本发明涉及基因工程、生物制药领域，具有涉及一种猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗及其制备方法，尤其涉及一种重组猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术：
猪圆环病毒(porcinecircovirus，pcv)属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒无囊膜、是单链负股环状dna病毒，是最小的动物病毒之一。传统的观点认为猪圆环病毒存在两个基因型：猪圆环病毒1型(pcv1)和猪圆环病毒2型(pcv2)，其中pcv2具有致病性。2015年6月，美国北卡罗来纳州某猪场暴发猪皮炎肾病综合征(pdns)疫情，与历史平均值相比，母猪死亡率升高10.2％、受孕率下降0.6％。患病母猪出现厌食症状，皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，所产胎儿(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有类似临床症状。美国堪萨斯州立大学兽医诊断实验室的科学家rachelpalinski[1]，从患有皮炎肾病综合征与繁殖障碍的猪只中检测出一种新型猪圆环病毒，并通过宏基因组测序及遗传进化分析，将该病毒命名为猪圆环病毒3型(pcv3)。与猪圆环病毒1、2型相似，pcv3病毒粒子呈二十面体结构，无囊膜，直径为17-20nm。基因组为单股dna，全长2000bp，包含3个主要开放阅读框(orf)。其中，orf1编码由297个氨基酸(aa)组成的复制酶蛋白rep，rep蛋白编码基因序列中无标准起始密码子atg，rep基因5’端的起始密码子是gtc。orf3编码一个由231个aa组成的蛋白质，编码方向与orf1基因相同，其功能未知。orf2编码由214个aa组成的衣壳蛋白cap，与orf1和orf3的复制方向相反。pcv3cap蛋白n端富含精氨酸，为病毒核定位信号区域，与病毒在细胞核内定位有关。pcv3cap蛋白为pcv主要结构蛋白，能够诱导动物机体产生特异性免疫应答。pcv2与pcv3cap蛋白aa同源性仅为30％，两者间存在交叉免疫保护可能性较低。我国湖北、广东某些发生繁殖障碍母猪以及急性死亡仔猪体内也检测出pcv3。pcv3感染可导致母猪出现厌食症状，皮肤出现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，生产性能下降；妊娠母猪发生繁殖障碍，产弱胎、死胎、木乃伊胎和弱仔猪，病情严重甚至造成急性死亡；不同胎龄胎儿均可发生流产。截至目前，我国已有13个省的猪场存在pcv3感染与流行。鉴于pcv2与pcv3交叉免疫保护可能性较低，因此，现有的疫苗对该病毒没有保护作用。急需开发新的疫苗防控这种新型病毒引起的疾病。技术实现要素：鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种用于预防猪圆环病毒3型的生物疫苗及其制备方法，尤其是一种重组猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗及其制备方法；更具体地为：一种用大肠杆菌表达的重组猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗及其制备方法；另外，提供一种或多种在制备所述疫苗的过程中的中间产物以及所述中间产物的制备方法亦是本发明的发明目的之一，例如：pcv3cap蛋白基因克隆载体的构建、pcv3cap蛋白基因的剪接及表达筛选、pcv3cap蛋白基因密码子的优化、pcv3cap基因融合方法比较表达实验、重组pcv3cap基因表达和表达蛋白的纯化及检测、重组猪圆环病毒pcv-3型基因工程亚单位疫苗的配制、重组猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗的本体动物免疫及抗体检测等均是本发明的发明目的之一。此外，在后面的描述中会提及本申请发明人所作出的很多小的、较为琐碎的发明创造，其均属于本发明的发明目的，均是申请人希望得到专利保护的发明创造。为达此目的，本发明采用以下技术方案：一种猪圆环病毒3型(pcv3)基因工程亚单位疫苗的制备方法：s1：构建pcv3cap蛋白基因克隆载体；s2：对步骤s1克隆的pcv3cap蛋白基因进行剪接及表达筛选，并确定剪接方式；s3：对步骤s2筛选的能表达pcv3cap蛋白基因的密码子进行优化；s4：在步骤s3优化的pcv3cap蛋白n-端序列的基因上游连接一段特定的基因片段；s5：用步骤s4重组的基因构建表达工程菌，采用所述表达工程菌制备表达可溶性pcv3cap蛋白，并对其进行纯化；s6：利用纯化后的表达蛋白添加免疫增强剂配制疫苗。一种用于制备pcv3疫苗的可溶性融合蛋白的制造方法：s1：构建pcv3cap蛋白基因克隆载体；s2：对步骤s1克隆的pcv3cap蛋白基因进行剪接及表达筛选；作为优选实施例，s2：对步骤s1克隆的pcv3cap蛋白基因进行剪接及表达筛选的步骤包括：设计引物对pcv3cap蛋白的n端序列的基因进行剪接。作为优选实施例，n端剪接引物包括下列物质中的至少一个上游引物：n端未剪接引物：5′-cccggatccatgagacacagagctatattcagaagaagaccc-3’；n端剪接引物1：5′-cccggatccatgagaagaaggctattcattaggagg-3′；n端剪接引物2：5′-cccggatccatgcccacagctggcacatactacacaaag-3′；n端剪接引物3：5′-cccggatccatgaagaaatactccaccatgaacgtc-3′；n端剪接引物4：5′-cccggatccatgaagccctggcacgccaaccacttc-3′。作为优选实施例，步骤s2中确定的剪接方式为：设计引物对pcv3cap蛋白的n端序列的基因进行剪接，n端剪接引物2为：5′-cccggatccatgcccacagctggcacatactacacaaag-3′。s3：对步骤s2筛选的能表达pcv3cap蛋白基因的密码子进行优化。作为优选实施例，s3：对步骤s2筛选的能表达pcv3cap蛋白基因的密码子进行优化的步骤包括：1)将原基因序列的第69位亮氨酸的密码子编码由cta变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子ctg，将原基因序列的第83位异亮氨酸的密码子编码由ata变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子att；2)在1)操作的基础上，进一步将原基因序列的第109位异亮氨酸的密码子编码由ata变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子att，将原基因序列的第111位亮氨酸的密码子编码由cta变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子ctg。s4：在步骤s3优化的pcv3cap蛋白n-端序列的基因上游连接一段特定的基因片段；作为优选实施例，s4：在去掉pcv3cap蛋白的n端精氨酸丰富的核定位肽后，用pcv3rep蛋白的n端32个氨基酸序列替代核定位肽系列。该设计方案通过合成一段pcr长引物，然后通过pcr的方法实现。引物序列如下：正向上游引物：5’-accatgggccggagggaaagcccgaaacacaggtggtgttttacgataaacaactggaccccgaccgagtgggaatctattgtggagtgtggaggcagtcccacagctggcacatactacacaaag-3’反向下游引物：5’-aagcttttagagaacggacttgtaacgaatcc-3’用该套引物的扩增产物构建成表达工程菌，并命名为：escherichiacolibl21(de3)/pet28a-pcv3nd32m3cap，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2018156。采用该表达工程菌表达制备可溶性pcv3cap蛋白，并对其进行纯化；作为优选实施例，纯化后的表达蛋白的亚基分子量约为25kda，蛋白的电泳纯度达到95％以上，在透射电镜下呈现出直径为17.74nm至18.20nm圆球状病毒样颗粒。与技术背景中阐述的pcv3直径为17-20nm的病毒颗粒大小相吻合，表明该蛋白合成过程中能自我装配成病毒样颗粒。一种采用本发明所述的方法制备的猪圆环病毒3型(pcv3)基因工程亚单位疫苗，优选地，所述疫苗中的免疫增强剂包括氢氧化铝胶。一种采用本发明所述的方法制备的用于制备pcv3疫苗的可溶性融合蛋白。一种重组pcv3cap蛋白，其基因序列如下：一种用于制备猪圆环病毒3型疫苗的可溶性融合蛋白，其主要成份是大肠杆菌表达的经过改造后的pcv3cap蛋白作为优选实施例，所述的pcv3cap蛋白是pcv3cap蛋白全基因删除不同长度核苷酸序列后剩余的基因片段，它们分别为：pcv3capgene，pcv3nd24capgene，pcv3nd32capgene，pcv3nd40capgene，pcv3nd57capgene，优选pcv3nd32capgene。作为优选实施例，所述的经过n端剪裁后的猪圆环病毒3型cap蛋白基因，进行基因编码密码子的优化。其特征是：1)将原基因序列的第69位亮氨酸的密码子编码由cta变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子ctg，将原基因序列的第83位异亮氨酸的密码子编码由ata变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子att；2)在1)操作的基础上，进一步将原基因序列的第109位异亮氨酸的密码子编码由ata变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子att，将原基因序列的第111位亮氨酸的密码子编码由cta变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子ctg。作为优选实施例，所述的pcv3cap蛋白基因进行n端剪裁序列替换的融合表达，在去掉pcv3cap蛋白的n端精氨酸丰富的核定位肽后，用pcv3rep蛋白的n端32个氨基酸序列进行替换，同时将pcv3rep蛋白序列的起始密码子由gtc改为atg，并在起始密码子后增加1个甘氨酸的编码序列。作为优选实施例，质粒载体，含有所述的核苷酸序列。作为优选实施例，宿主细胞，含有所述的质粒载体，为大肠杆菌bl21(de3)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2018156。该宿主细胞经过生物工程方法的诱导能表达出可溶性重组pcv3cap蛋白。作为优选实施例，所述的细胞，经过诱导表达生产的可溶性pcv3cap蛋白的纯化方法，其主要步骤是：破菌离心，10％-30％饱和度硫酸铵分级沉淀浓缩，sepharosetm4fastflow凝胶过滤层析，和marcrocapq离子交换层析方法，可使表达蛋白的电泳纯度达到95％以上，亚基分子量约为25kda，在电子显微镜下呈现出17.74nm-18.20nm的病毒样颗粒。表明该蛋白合成过程中能自我装配成病毒样颗粒。作为优选实施例，所述的猪圆环病毒3型cap蛋白纯化后加上免疫增强剂，制成重组pcv3基因工程亚单位疫苗。该免疫增强剂主要是氢氧化铝胶。附图说明图1是pcv3cap蛋白表达及纯化结果电泳图；图2重组pcv3cap电子显微镜照片；图1中：泳道1：blueplusproteinmarker(14-100kda)，从下向上分别为：14，25，30，40，50，70，100kda；泳道2：e.colibl21/pet28a表达蛋白全菌；泳道3：e.colibl21pet28a-pcv3nd32m3cap表达蛋白全菌；泳道4：e.colibl21pet28a-pcv3nd32m3cap表达蛋白上清液；泳道5：e.colibl21pet28a-pcv3nd32m3cap表达蛋白经sepharosetm4fastflow柱层析洗脱液；泳道5：e.colibl21pet28a-pcv3nd32m3cap表达蛋白经marcrocapq离子交换层析洗脱液。下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。具体实施方式下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：一、pcv3cap蛋白基因克隆载体的构建1、材料与方法1.1、病料dna的提取取猪圆环病毒3型感染后病死猪的腹股沟淋巴结样品0.5g，加无菌生理盐水4.5ml，充分匀浆后取472μl淋巴结匀浆液，加入25μl10％sds(十二烷基硫酸钠)和2.5μl蛋白酶k(25mg/ml)，置于50℃水浴作用2小时，加入500μl的tris饱和酚，涡旋30秒，置12000rpm离心10分钟。将上清移入另外一支离心管中，加500μl的体积比为25∶24∶1的苯酚、氯仿、异戊醇，混合后置12000rpm离心10分钟。取上清，按1/10体积加入3mol/l醋酸钠(ph值5.3)，加入2.5倍体积的无水乙醇，置-20℃冰箱中30分钟，以15000rpm离心10分钟，弃上清后加入70％乙醇1ml洗涤沉淀，以15000rpm离心10分钟，弃上清。带有核酸沉淀的ep管开盖放置到65℃的金属浴中干燥10min左右，使残余的乙醇完全挥发，干燥总dna沉淀。使用前加入50μl双蒸水溶解，置-20℃冰箱中保存备用。1.2、pcr扩增pcv3cap蛋白基因1.2.1、外套引物扩增pcv3cap外套引物pf5’gtatttattgggtgggtgggtgggcag3’pcv3cap外套引物pr5’ggatccacggaggtctgtagggagaaa3’扩增体系(见表1)：表1优选按照上述增扩体系中试剂的序号顺序先后依次添加上述试剂，其中病料总dna为病料dna提取步骤中提取得到的产物。温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30s，→62℃，45s，→72℃，60s)×30→72℃，10min。其中62℃为退火温度，45s是退火时间。这里需要特别说明的是：上述温度循环参数是经过本申请发明人结合理论在大量创造性实验的基础上获得的，温度过高或过低、循环时间过长或过短均会影响所述外套引物扩增的效率。在上述外套扩增的基础上利用其产物进一步进行后续内套引物扩增，具体如下：1.2.2、内套引物扩增pcv3cap内套引物pf5’atgagacacagagctatattcagaagaagaccc3’pcv3cap内套引物pr5’aagcttttagagaacggacttgtaacgaatcc3’扩增体系(见表2)：表2温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30s，→62℃，45s，→72℃，60s)×35→72℃，10min。其中62℃为退火温度，45s是退火时间。这里需要特别说明的是：上述温度循环参数是经过本申请发明人结合理论在大量创造性实验的基础上获得的，温度过高或过低、循环时间过长或过短均会影响所述内套引物扩增的效率。利用琼脂糖凝胶电泳回收扩增带，连接到ptopo-ta质粒载体上，转化大肠杆菌dh5α，转化菌命名为：e.colidh5α/ptopo-pcv3cap，经pcr鉴定后送上海生物工程有限公司进行序列测定。2ptopo-pcv3cap质粒的目的基因测序结果及推测的氨基酸排列次序如下：二、pcv3cap蛋白基因的剪接及表达筛选材料与方法pcv3全基因保存载体：ptopo-pcv3cap限制性核酸内切酶：bamhi；hindiii设计引物对pcv3cap蛋白n端序列的基因进行剪接。引物见下表3：表3引物名称引物序列n端未剪接引物5′-cccggatccatgagacacagagctatattcagaagaagaccc-3’n端剪接引物15′-cccggatccatgagaagaaggctattcattaggagg-3′(nd24)n端剪接引物25′-cccggatccatgcccacagctggcacatactacacaaag-3′(nd32)n端剪接引物35′-cccggatccatgaagaaatactccaccatgaacgtc-3′(nd40)n端剪接引物45′-cccggatccatgaagccctggcacgccaaccacttc-3′(nd57)下游引物5’cccaagcttttagagaacggacttgtaacgaatcc3’pcr反应体系(表4)：表4温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30s，→62℃，45s，→72℃，60s)×35→72℃，10min。其中62℃为退火温度，45s是退火时间。这里需要特别说明的是：上述温度循环参数是经过本申请发明人结合理论在大量创造性实验的基础上获得的，温度过高或过低、循环时间过长或过短均会影响产物效率。电泳回收扩增带，并连接到ptopo-ta质粒载体上。转化大肠杆菌dh5α，提取质粒dna后用pcr方法检测鉴定重组质粒。分别命名为：ptopopcv3cap，ptopopcv3nd24cap，ptopopcv3nd32cap，ptopopcv3nd40cap，ptopopcv3nd57cap。其中pcv3capgene，pcv3nd24capgene，pcv3nd32capgene，pcv3nd40capgene，pcv3nd57capgene。优选pcv3nd32capgene是猪圆环病毒3型cap蛋白全基因删除不同长度核苷酸序列后剩余的基因片段。将上述5种不同剪切方式构建的质粒dna分别用限制性核酸内切酶(bamhi/hindiii)进行消化，并与同样限制性核酸内切酶消化的表达质粒pet28a进行连接。连接产物分别命名为：pet28apcv3cap，pet28apcv3nd24cap，pet28apcv3nd32cap，pet28apcv3nd40cap，pet28apcv3nd57cap。用连接产物转化大肠杆菌bl21(de3)，筛选转化子。构建成5种pcv3抗原蛋白表达工程菌。分别命名为：e.colibl21/pet28apcv3cap，e.colibl21/pet28apcv3nd24cap，e.colibl21/pet28apcv3nd32cap，e.colibl21/pet28apcv3nd40cap，e.colibl21/pet28apcv3nd57cap。进行诱导表达实验，诱导剂为α-乳糖，工作浓度为：0.03mol/l。诱导产物用sds-page电泳进行检测。结果显示e.colibl21pet28apcv3cap不表达，e.colibl21pet28apcv3nd24cap不表达，e.colibl21pet28apcv3nd32cap微量表达，表达量约为总蛋白量的10％，部分可溶。e.colibl21pet28apcv3nd40cap高效表达，表达量约为总蛋白量的30％，不可溶。e.colibl21pet28apcv3nd57cap高效表达，表达量约为总蛋白量的35％，不可溶。三、pcv3cap蛋白基因密码子的优化由于e.colibl21pet28a-pcv3nd32cap表达蛋白部分可溶，但是表达量偏低，因此，选择了该工程菌进行密码子优化。共设计了两种方案优化pcv3cap蛋白基因密码子。第一方案：通过overlappingpcr的方式完成。a片段扩增引物序列：ap1：5′-cccggatccatgcccacagctggcacatactacacaaag-3′ap2：5′-catctttagaatcttataatattcaaagctaattgcagtttcccactcgttcaggcgggtaatgaa-3′pcr扩增体系(见表5)：表5温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30s，→62℃，45s，→72℃，60s)×20→72℃，10min。保留扩增产物备用。其中62℃为退火温度，45s是退火时间。这里需要特别说明的是：上述温度循环参数是经过本申请发明人结合理论在大量创造性实验的基础上获得的，温度过高或过低、循环时间过长或过短均会影响产物效率。b片段扩增引物：bp1：5′-ttcattacccgcctgaacgagtgggaaactgcaattagctttgaatattataagattctaaagatg-3′bp2：5’cccaagcttttagagaacggacttgtaacgaatcc3’pcr扩增体系(见表6)：表6温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30s，→62℃，45s，→72℃，60s)×20→72℃，10min。保留扩增产物备用。其中62℃为退火温度，45s是退火时间。这里需要特别说明的是：上述温度循环参数是经过本申请发明人结合理论在大量创造性实验的基础上获得的，温度过高或过低、循环时间过长或过短均会影响产物效率。ab片段的扩增引物序列：ap1：5′-cccggatccatgcccacagctggcacatactacacaaag-3′bp2：5’cccaagcttttagagaacggacttgtaacgaatcc3’pcr扩增体系(见表7)：表7温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30s，→62℃，45s，→72℃，60s)×35→72℃，10min。扩增产物回收后用bamhi/hindiii双酶切后插入pet28a质粒中构建表达质粒载体。将原基因序列的第69位亮氨酸的密码子编码由cta变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子ctg。将原基因序列的第83位异亮氨酸的密码子编码由ata变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子att。由该序列构建的大肠杆菌表达工程菌命名为：e.colibl21/pet28apcv3nd32m1cap。第二方案：在方案一的基础上，通过overlappingpcr的方法完成。c片段扩增引物序列：cp1：5′-cccggatccatgcccacagctggcacatactacacaaag-3′cp2：5′-ccaagtgtttgtggtccaggcgccgtccagatcaatggctgtgtgcccgaacatagtttttgtttgctg-3′pcr扩增体系(见表8)：表8温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30s，→62℃，45s，→72℃，60s)×20→72℃，10min。保留扩增产物备用。d片段扩增引物序列：dp1：5’cagcaaacaaaaactatgttcgggcacacagccattgatctggacggcgcctggaccacaaacacttggdp2：5’cccaagcttttagagaacggacttgtaacgaatcc3’pcr扩增体系(见表9)：表9温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30s，→62℃，45s，→72℃，60s)×20→72℃，10min。保留扩增产物备用。cd片段的扩增引物序列：ap1：5′-cccggatccatgcccacagctggcacatactacacaaag-3′bp2：5’cccaagcttttagagaacggacttgtaacgaatcc3’pcr扩增体系(见表10)：表10温度循环参数：94℃，5min→(94℃，30s，→62℃，45s，→72℃，60s)×35→72℃，10min。扩增产物回收后用bamhi/hindiii双酶切后插入pet28a质粒中构建表达质粒载体。在第一方案的基础上进一步将原基因序列的第109位异亮氨酸的密码子由ata变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子att。将原基因序列的第111位亮氨酸的密码子由cta变为能被大肠杆菌trna正常识别的密码子ctg。将本实例构建的2种pcv3cap蛋白表达工程菌进行诱导表达。诱导剂为α-乳糖，工作浓度为：0.03mol/l。然后，用超声波破菌离心后，通过sds-page电泳检测蛋白的表达量和溶解性状。结果显示，第二方案的目的蛋白表达和溶解性状更佳。表达量约为总蛋白的15％-20％，置于12000rpm下离心10min后约有30-40％目的蛋白存在于上清中。由该序列构建的大肠杆菌表达工程菌命名为：e.colibl21/pet28apcv3nd32m2cap。四、pcv3cap基因融合比较表达实验第一方案在去掉pcv3cap蛋白的n端精氨酸丰富的核定位肽后，用表达质粒pet28a的5’-端序列替代核定位肽。该方案等同于工程菌e.colibl21/pet28apcv3nd32m2cap。第二方案在去掉pcv3cap蛋白的n端精氨酸丰富的核定位肽后，用pcv3rep蛋白的n端32个氨基酸基因序列替代核定位肽系列，并将pcv3rep蛋白原序列的起始密码子gtc改为atg，为了去掉表达质粒pet28a的5’-端的原融合序列，将原有的限制性内切酶位点ggatcc(bamhi)改为ccatgg(ncoi)为满足ncoi酶切位点的要求，在原序列的起始密码后添加了一组编码甘氨酸的密码子ggc。全序列的长度为33个氨基酸。该设计方案通过合成一段长引物，然后通过pcr的方法实现。引物序列如下：正向上游引物：5’-accatgggccggagggaaagcccgaaacacaggtggtgttttacgataaacaactggaccccgaccgagtgggaatctattgtggagtgtggaggcagtcccacagctggcacatactacacaaag-3’反向下游引物：5’-aagcttttagagaacggacttgtaacgaatcc-3’扩增完成后，连接到ptopo-ta质粒载体上，回收质粒，用ncoi/hindiii，进行双酶切后连接到ncoi/hindiii双酶切线性化的pet28a质粒上。转化大肠杆菌bl21(de3)细胞构建表达工程菌。经pcr鉴定后送上海生物工程有限公司进行序列测定。测序结果如下：将本实例构建的2种pcv3cap蛋白表达工程菌进行诱导表达。诱导剂为α-乳糖，工作浓度为：0.03mol/l。然后，用超声波破菌离心后，通过sds-page电泳检测蛋白的表达量和溶解性状。结果显示，方案二的目的蛋白表达和溶解性状较好。表达量约为总蛋白的20％-25％，置于12000rpm下离心10min后主要的表达蛋白存于上清中，表明是可溶性蛋白(见图1)。工程菌命名为：escherichiacolibl21(de3)/pet28a-pcv3nd32m3cap，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏单位代码cctcc)，保藏日期2018年3月26日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctccno：m2018156，分类命名escherichiacolibl21(de3)/pet28a-pcv3nd32m3cap。五、重组pcv3cap基因表达和表达蛋白的纯化及检测1、发酵培养及诱导表达：用发酵培养的方法生产escherichiacolibl21(de3)/pet28a-pcv3nd32m3cap。待od600值(在600nm处的吸光值)达1.0左右时加入诱导剂α-乳糖至工作浓度为0.03mol/l。诱导培养5小时。2、菌体裂解用pbs缓冲液将表达菌体重悬(湿菌体∶pbs＝1∶10)，使用超声波裂解仪(型号：宁波新芝生物科技股份有限公司，jy98-iii超声波细胞粉碎机)裂解300次，功率65％，裂解5s，间隔20s，裂解完毕后，进行显微镜检查，确定裂解完全。裂解液置12000rpm离心10min。去沉淀。上清液继续纯化。3、硫酸铵沉淀将表达蛋白上清液用硫酸铵进行分级沉淀，收集10％-30％饱和度的硫酸铵沉淀，用pbs液复溶后继续下续纯化过程。4、凝胶柱层析将pcv3蛋白液上样于sepharosetm4fastflow层析柱，收集目的蛋白峰。5、离子交换层析分离将凝胶柱层析收集的蛋白液用marcrocapq离子交换柱进行纯化。洗脱液a：0.02mpbs缓冲液；洗脱液b：0.02mpbs缓冲液，ph7.4，含有1mol氯化钠。进行线性梯度洗脱，收集抗原蛋白的洗脱峰。通过sds-page电泳检测蛋白纯化结果见附图1。其中，图1中泳道1：blueplusproteinmarker(14-100kda)，从下向上分别为：14，25，30，40，50，70，100kda；泳道2：e.colibl21/pet28a表达蛋白全菌；泳道3：e.colibl21pet28a-pcv3nd32m3cap表达蛋白全菌；泳道4：e.colibl21pet28a-pcv3nd32m3cap表达蛋白上清液；泳道5：e.colibl21pet28a-pcv3nd32m3cap表达蛋白经sepharosetm4fastflow柱层析洗脱液；泳道5：e.colibl21pet28a-pcv3nd32m3cap表达蛋白经marcrocapq离子交换层析洗脱液。电泳结果显示，表达蛋白为可溶性蛋白，蛋白的电泳纯度达到95％以上，亚基分子量约为25kda。6、透射电子显微镜观察pcv3cap蛋白表达纯化产物将200目碳涂层铜网浸于50微升纯化样品液中，室温条件下作用10分钟，用滤纸吸去多余的液体，用3％磷钨酸负染10分钟，用滤纸吸去多余液体。制备好的样品在透射电子显微镜(jem-1200ex)下观察pcv3cap蛋白形成的类病毒颗粒结构。见附图2，由电子显微镜照片可见，在40万倍放大的条件下纯化蛋白呈现规整的圆状颗粒，颗粒直径17.74nm-18.20nm，表明该蛋白合成过程中能自我装配成病毒样颗粒。六、重组猪圆环病毒-3型基因工程亚单位疫苗的配制。将纯化抗原蛋白稀释至25mg/100ml，以配制pcv-3基因工程亚单位疫苗1000毫升(注：1000头份疫苗)为例。1、pcv3nd32m3cap蛋白液(25mg/100ml)800ml2、铝胶佐剂(2mg/ml，al3+)200ml充分混合，即为重组猪圆环病毒pcv3基因工程亚蛋白疫苗。七、重组猪圆环病毒-3型基因工程亚单位疫苗的本体动物免疫及抗体检测取21-27日龄实验猪，采集血清用elisa试剂盒测定抗pcv3cap抗体，均为阴性。将15头抗体阴性猪，随机分为3组。空白对照组5头，颈部肌肉注射灭菌生理盐水2毫升；实验1组5头，颈部肌肉注射重组猪圆环病毒-3型基因工程亚单位疫苗1毫升；实验2组5头，颈部肌肉注射重组猪圆环病毒-3型基因工程亚单位疫苗2毫升。注射免疫21天时，用相同的疫苗相同的剂量进行2次免疫，2次免疫后14天，(一免后35天)采集实验猪血清标本，用elisa试剂盒检测抗体。结果见表11：表11注：阴性样本od450平均值＝0.11按照经典间接elisa的结果判断标准，s/n＜1.6为抗体阴性；2.1＞s/n≥1.6为抗体可疑；s/n≥2.1为抗体阳性。根据以上判断标准，实验1组在免疫2次后都可达到抗体阳性的标准，抗体阳性率为100％。实验2组在免疫2次后抗体阳性率也为100％，而且血清抗体滴度高于实验1组。八、猪圆环病毒3型基因工程亚蛋白疫苗的本体动物攻毒保护实验及结果根据palinskir，pineyrop，shangp，yuanf，guor，fangy，byerse，hausebm(2017)anovelporcinecircovirusdistantlyrelatedtoknowncircovirusesisassociatedwithporcinedermatitisandnephropathysyndromeandreproductivefailure.jvirol91：e01879-16报道的pcv3荧光定量pcr引物序列合成引物。pcv3realtimefp：agtgctccccattgaacgpcv3realtimerp：acacagccgttacttcac不按原文献合成荧光探针，而用tbgreentmpremixextaqtm(rr420a)试剂盒(takara产品)中的tbgreen荧光物质。从血样中提取总dna：1、取50μl血清，加入450μl灭菌的pbs进行稀释。2、加入500μl等体积的tris-饱和酚，剧烈震荡，4℃，12000rpm离心10min。3、将上清小心转移至灭菌的1.5ml的ep管中，加入等体积的(约400μl)的25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇，震荡混匀；4℃，12000rpm离心10min。4、取上清(约250μl)转移至灭菌的1.5ml的ep管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀后，放置于-20℃沉淀1h；4℃，12000rpm离心10min。5、弃上清，沉淀用1ml的70％乙醇进行清洗，4℃，12000rpm离心10min。6、弃上清，带有核酸沉淀的ep管开启管盖，放置到65℃的金属浴中干燥10min左右，使残余的乙醇完全挥发。7、加入25μl的5mmtris-hcl(ph8.0)缓冲液，溶解dna，并用quawell5000超微量分光光度计进行dna含量的测定和纯度的分析。标准品的制备：1、质粒为ptopopcv3nd24cap2、分子量为(1865+594)bp×660da/bp＝1622940da3、测定的质粒浓度为300ng/μl＝0.3g/l4、摩尔浓度为0.3/1622940＝1.8×10-6mol/l5、拷贝数为1.8×10-6×6.02×1023＝1.0836×1018copy/l＝1×1012copy/μl6、用tris缓冲液将模板稀释成1×1010copy/μl、1×108copy/μl、1×107copy/μl、1×106copy/μl、1×105copy/μl、1×104copy/μl、1×103copy/μl、1×102copy/μl、1×101copy/μl荧光定量：荧光定量pcr仪为biorad的cfxconnect；试剂盒为takara的sybrpremixextaq(tlirnasehplus)，code：rr420a表12sybrpremixextaq10μl10μmpcv3realtimefp0.4μl10μmpcv3realtimerp0.4μltemplate1μlddh2o8.2μltotal20μl两步法扩增：扩增温度参数：94℃，3min；40cycles×(94℃，10s；55℃，35s读板)；融解曲线测定参数：94℃，10s；65℃----95℃，5s读板(0.5℃递增)。表13fluorefficiency％slopey-interceptr^2sybr104.25-3.22442.2130.999攻毒保护实验：取猪圆环病毒3型感染病猪的腹股沟淋巴结样品5.0g，加无菌生理盐水45.0ml，充分匀浆置10000转/min离心5分钟。取50μl匀浆液提取dna后，进行realtimepcr。测得pcv3拷贝数为3.85×108。剩余匀浆上清液用0.22μm的除菌滤器过滤2次。取滤液对实例7的猪进行攻毒实验。每头猪静脉注射1ml。攻毒后48小时采静脉血，分离血清用realtimepcr测定病毒拷贝数。表14注：不同组logstartingquantity平均值具有不同字母肩号的数据间有显著差异。用spss统计分析软件进行单因素方差分析，多重比较student-newman-keuls检验设定显著性水平α为0.05。多重比较检验的相似性子集结果显示，实验1组显著高于实验2组和空白对照组攻毒前，显著低于空白对照组攻毒后。实验2组显著低于实验1组和空白对照组攻毒后，与空白对照组攻毒前无显著性差异。空白对照组攻毒后显著高于实验1组、实验2组和空白对照组攻毒前。空白对照组攻毒前显著低于实验1组和空白对照组攻毒后，与实验2组无显著性差异。重组猪圆环病毒pcv3型基因工程亚蛋白疫苗的本体动物攻毒保护实验结果表明，猪圆环病毒3型基因工程亚单位疫苗免疫后的实验1组和实验2组猪只的血清病毒载量显著降低，而且，病毒载量降低的程度与疫苗的免疫剂量有关。表明猪圆环病毒pcv-3基因工程亚蛋白疫苗对实验猪有显著的保护作用。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页12