AR-V7可变剪切序列在抗去势抵抗性肿瘤中的应用的制作方法

文档序号：16069181发布日期：2018-11-24 12:59阅读：1209来源：国知局

本发明属于生物医学领域，涉及AR-V7可变剪切序列在抗去势抵抗性肿瘤中的应用。

背景技术：

前列腺癌是一种常见的恶性肿瘤，并且是造成男性肿瘤死亡的第二大病因。近年来，我国前列腺癌的发病率呈逐年快速上升趋势，2004年为5.8/10万人，到2009年已经上升为8/10万人。而发病率绝对值上升最快的是中国香港地区，从1999年的16.5/10万人上升到2010年的28.1/10万人。在台湾地区和上海，前列腺癌已位列男性常见肿瘤第5位和泌尿系统肿瘤第1位。由于我国对前列腺癌易感人群的筛查工作相对落后，导致晚期前列腺癌约占初次诊断的前列腺癌的70％；我国初诊为晚期前列腺癌的比例远高于欧美国家(20-30％)。雄激素剥夺治疗(Androgen deprivation therapy,ADT)是对这部分患者的最主要治疗方法。尽管在ADT治疗初期前列腺癌被不同程度的控制，但经过大约18个月敏感期后，大部分患者的疾病逐渐且不可逆地进展为去势抵抗性前列腺癌。

去势抵抗性前列腺癌(Castration resistant prostate cancer,CRPC)是指患者经过ADT治疗后，血清睾酮水平达到去势水平(<50ng/dl或<1.7nmol/L)，但是疾病依然进展的前列腺癌。疾病进展的临床表现为影像学可见的肿瘤进展和/或前列腺特异性抗原(PSA)水平持续增高。后者应满足以下条件，即在PSA达2ng/mL以上，每间隔一周监测血清PSA水平，连续3次血清PSA升高，且比基础值升高50％以上。然而，由于CRPC发病机制至今不明，因而临床缺乏针对病因的精准治疗，这是当前泌尿外科学研究的难点和热点。

AR信号通路在前列腺癌发展的各个阶段均起到了极为重要的作用，大量研究也表明AR信号通路的持续活化仍旧是CRPC进展的关键推动因素。虽然FDA批准的AR拮抗剂的恩杂鲁胺和抑制雄激素水平的阿比特龙两种药物能带来生存获益，但是仍有很多CRPC病人从开始就对这两种药物不敏感，而且几乎所有接受治疗的病人最终都会获得耐药，并且伴有PSA升高，提示了AR信号通路的再激活。AR剪切变异体(AR splice variants,AR-Vs)的出现异常激活了AR信号通路，从而出现了耐药。AR-Vs是发生截短突变的AR，缺少了AR的配体端(ligand-binding domain,LBD)，仍然保留AR的N端和DNA结合区，能够发挥AR的功能，在没有的雄激素或者恩杂鲁胺存在的情况下仍能够激活AR信号通路，使得前列腺癌患者在ADT治疗后进展为CRPC并且对恩杂鲁胺和阿比特龙耐药。AR-V7是AR-Vs中的一员，在CRPC病人中表达水平最高而且最为普遍。最近大量研究集中报道AR-V7的相关研究，揭示了AR-V7在促进CRPC进展中的作用以及作为治疗选择标记分子的重大意义。研究证明AR-V7的核定位及基因功能并不依赖于雄激素和AR全长的存在，而且AR-V7的高表达能够逆转ADT所抑制的雄激素激活的下游分子以及参与细胞周期进展的特殊分子信号，促进CRPC的生长和进展。因此，特异性抑制AR-V7可变剪切的靶向治疗十分必要。

关于AR-V7可变剪切的特异性功能位点序列还未见报道，本发明通过基础生物实验数据研究该序列在AR-V7可变剪切中的关键作用，本发明的成果可以为AR-V7阳性去势抵抗性前列腺癌治疗提供新的靶点，恢复肿瘤的药物敏感性。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种AR-V7的特异性剪切功能位点以及该位点在癌症治疗中的应用。

本发明的目的之二是提供一种可调控AR-V7的lncRNA及其在癌症治疗中的应用。

本发明的目的之三在于提供与AR-V7相关的反义寡核苷酸及其在癌症治疗中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种AR-V7的特异性剪切位点，所述剪切位点的序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的第二方面提供了一种预测评估AR-V7可变剪切功能位点的方法，步骤如下：

1)分析AR-V7 mRNA与全长AR(AR-FL)的mRNA的结构，确定AR-V7 mRNA的特有结构；

2)使用Human Splicing Finder在线预测评估网站的HSF 3.1模块，选择剪切位点分析(Splice site analysis)，输入基因名称AR，采用最大熵预测算法对AR-V7的特有结构进行分析；

3)验证可变剪切的功能位点序列在AR pre-mRNA的特异性。

进一步，步骤1)中将AR转录本AR-FL(NM_000044.4)及AR-V7转录本(NM_001348061.1)的核酸信息通过Graphics模块进行mRNA结构对比，FASTA模块进行mRNA序列对比，筛选到特有结构隐藏外显子3。

进一步，本发明第二方面所述的方法，还包括对所得到的序列进一步验证，通过封闭该位点来判断是否影响AR-V7的可变剪切从而判断该序列是否是功能性剪切序列。

本发明的第三方面提供了一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸选自：

特异性结合CYTOR的反义寡核苷酸；或

特异性结合如序列SEQ ID NO.7所示的剪切位点的反义寡核苷酸。

进一步，所述反义寡核苷酸包括修饰得到的反义寡核苷酸，所述修饰包括选自以下的一种或多种修饰：至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷间键、至少一种修饰的核苷酸及其组合。其中，所述一种或多种修饰包括选自以下至少一种修饰的糖部分：2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2'-O-烷基修饰的糖部分、二环的糖部分及其组合；所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的核苷酸间键：硫代磷酸酯、2'-O甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、膦酸烷基酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯及其组合；所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰的核苷酸：肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、阿拉伯糖-核酸(FANA)、类似物、衍生物及其组合。

进一步，在本发明的具体实施方案中，特异性结合CYTOR的反义寡核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，特异性结合如序列SEQ ID NO.7所示的剪切位点的反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步，所述反义寡核苷酸为甲基化修饰的反义寡核苷酸。

本发明的第四方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括封闭权利要求1所述位点的试剂。

作为一种可选择的实施方式，所述试剂是反义寡核苷酸。

作为优选的一种实施方式，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明的第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第三方面所述的反义寡核苷酸。

本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：

a.本发明第一方面所述的特异性剪切位点在制备治疗雄激素受体相关肿瘤的激素去势治疗后的去势抵抗和复发转移药物的应用；

b.本发明第一方面所述的特异性剪切位点在筛选治疗雄激素受体相关肿瘤的激素去势治疗后的去势抵抗和复发转移候选药物中的应用；

c.特异性结合AR-V7的CYTOR在制备治疗雄激素受体相关肿瘤的激素去势治疗后的去势抵抗和复发转移药物中的应用；

d.本发明第三方面所述的反义寡核苷酸在制备治疗肿瘤的药物中的应用；

e.本发明第三方面所述的反义寡核苷酸在制备治疗雄激素受体相关肿瘤的激素去势治疗后的去势抵抗和复发转移药物中应用；

f.本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的产品中的应用；

g.本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗雄激素受体相关肿瘤的激素去势治疗后的去势抵抗和复发转移产品中应用；

h.本发明第五方面所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的产品中的应用；

i.本发明第五方面所述的药物组合物在制备治疗雄激素受体相关肿瘤的激素去势治疗后的去势抵抗和复发转移产品中应用。

进一步，a中所述的药物包括封闭剪切位点的试剂；优选的，所述试剂为反义寡核苷酸；更为优选的，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步，b中所述的治疗雄激素受体相关肿瘤的激素去势治疗后的去势抵抗和复发转移药物作用于本发明第一方面所述的特异性剪切位点，抑制AR-V7的剪切。

进一步，c中所述药物包括CYTOR的抑制剂，优选的，所述抑制剂为反义寡核苷酸或短发夹RNA，更为优选的，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明中，所述的肿瘤包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫颈癌和结肠癌。

在本发明中，“反义寡核苷酸”是指结合另一RNA或DNA(靶RNA、DNA)的RNA或DNA分子。例如，如果其是RNA寡核苷酸，其借助于RNA-RNA相互作用结合另一RNA靶并且改变靶RNA的活性。反义寡核苷酸可上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。该定义意为包括从治疗、诊断或其它观点来说有用的任何外来RNA或DNA分子。这种分子包括，例如，反义RNA或DNA分子、干扰RNA(RNAi)、微RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治疗性编辑RNA和激动剂与拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可选剪接体、引物、探针以及与靶核酸的至少一部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。

在本发明的范畴中，术语"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚物或聚合物。术语"寡核苷酸"还包括天然和/或修饰的单体或键合的线性或环状寡聚物，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代形式和其α-异头形式、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、硫代磷酸酯、膦酸甲酯和类似物。寡核苷酸能够经由规则方式的单体与单体间的相互作用，例如Watson-Crick型碱基配对、或逆型碱基配对或类似物特异性结合靶多核苷酸。

寡核苷酸可以是"嵌合的"，即，包括不同区域。在本发明的范畴中，"嵌合"化合物是寡核苷酸，其包含两个或更多个化学区域，例如，DNA区域、RNA区域、PNA区域等等。每个化学区域由至少一个单体单位构成，在寡核苷酸化合物的情形中所述单体单位即为核苷酸。这些寡核苷酸通常包括至少一个区域，其中寡核苷酸经修饰以表现一种或多种期望特性。寡核苷酸的期望特性包括但不限于，例如，对核酸酶降解增加的耐受性、增加的细胞摄取和/或对靶核酸增加的结合亲和力。因此，寡核苷酸的不同区域可具有不同特性。如上所述，本发明的嵌合寡核苷酸可形成为两种或更多种寡核苷酸的混合结构、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸类似物。

在本发明中，“药物”和“药物组合物”可以进行等同替代。所述的药物组合物除了包括本发明中的活性成分，还包括药学上可接受的载体。所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体等。

本发明首次发现了CYTOR与AR-V7特异性结合，且通过实验证明了降低CYTOR的表达可以降低AR-V7的水平，且降低CYTOR的水平可以恢复去势抵抗性前列腺癌细胞系的药物敏感性。

在本发明中，编码CYTOR的基因位于2号染色体短臂1区1带上，本发明中的CYTOR包括野生型、突变型或其片段。在本发明的实施例中，一种代表性的编码CYTOR的基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中CYTOR基因(NR_024204.2)所示。本发明的CYTOR核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

在本发明中，外源核酸向宿主细胞或生物体中的转移可通过直接检测细胞或生物体中该核酸的存在来评价。这种检测可通过本领域公知的多种方法来实现。例如，外源核酸的存在可通过DNA印迹或利用特异性地扩增与该核酸相关的核苷酸序列的引物通过聚合酶链式反应(PCR)技术来检测。外源核酸的表达还可利用包括基因表达分析的常规方法测量。例如，从外源核酸产生的mRNA可利用RNA印迹和逆转录PCR(RT-PCR)来检测和定量。

RNA从外源核酸的表达还可通过测量酶促活性或报告蛋白活性来检测。例如，反义调节活性可间接地作为靶核酸表达的减少或增加来测量，靶核酸表达的减少或增加作为外源核酸在产生效应RNA的指示。基于序列保守性，可设计引物并用于扩增靶基因的编码区域。最初，来自每个基因的最高度表达的编码区域可用于构建模式对照基因，尽管可使用任何编码或非编码区域。通过在报告基因编码区域和其poly(A)信号之间插入每个编码区域来组装每个对照基因。这些质粒将产生报告基因在基因的上游部分且可能的RNAi靶在3'非编码区域的mRNA。单独反义寡核苷酸的效果将通过报告基因的调节来测定。可用于本发明方法的报告基因包括乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶(Luc)、胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)及其衍生物。赋予对氨苄西林、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素和四环素抗性的多种选择标记是可得的。确定报告基因的调节的方法是本领域公知的，包括但不限于，荧光方法(例如，荧光光谱学、荧光激活细胞分选术(FACS)、荧光显微镜检术、抗生素抗性确定。

在实施方案中，利用本发明反义寡核苷酸处理的样品(例如，体内或体外的细胞或组织)中的AR-V7表达(例如，mRNA或蛋白)通过与对照样品中的AR-V7表达比较来评价。例如，蛋白或核酸的表达可利用本领域技术人员已知的方法与模拟处理或未处理样品中的比较。可选地，取决于期望的信息，可与以对照反义寡核苷酸(例如，具有改变的或不同序列的反义寡核苷酸)处理的样品进行比较。在另一实施方案中，处理样品与未处理样品中AR-V7蛋白或核酸的表达差异可与处理样品与未处理样品中不同核酸(包括研究者认为适当的任何标准，例如，看家基因)的表达差异比较。

观察到的差异可如期望地表示，例如，以比率或分数的形式，用于与对照比较。在实施方案中，以本发明反义寡核苷酸处理的样品中AR-V7 mRNA或蛋白的水平相对于未处理样品或以对照核酸处理的样品增加或减少约1.25倍至约10倍或更多。在实施方案中AR-V7 mRNA或蛋白的水平增加或减少至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、或至少约10倍或更多。

在本发明中，“培养体系”定义为表达或使成为感受态以表达AR-V7基因产物的任何生物体、细胞、细胞培养物或组织。这些包括但不限于，人、转基因动物、细胞、细胞培养物、组织、异种移植物、移植物及其组合。

作为一个非限制性实例，将以一种或多种反义化合物处理的细胞或组织中的表达模式与未被反义化合物处理的对照细胞或组织比较，并按照其属于所检查的基因的例如疾病关联、信号传导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能分析所产生的模式的基因表达差异水平。这些分析可对刺激或未刺激的细胞进行，并在影响表达模式的其它化合物存在或不存在下。

本领域已知的基因表达分析方法的实例包括DNA阵列或微阵列、SAGE(基因表达系列分析)、READS(消化的cDNA的限制性酶扩增)、TOGA(总基因表达分析)、蛋白阵列和蛋白质组学、表达的序列标签(EST)测序、消减RNA指纹技术(SuRF)、消减克隆、差异展示(DD)、比较基因组杂交、FISH(荧光原位杂交)技术和质谱方法。

本领域技术人员还利用反义的特异性和灵敏性用于治疗用途。反义化合物已经在动物(包括人)的疾病状态的治疗中用作治疗部分。反义寡核苷酸药物已经安全且有效地施用于人，目前正在进行许多临床试验。因此已经确定，反义化合物可以是有用的治疗形态，可被配置以用于治疗细胞、组织和动物(尤其是人)的治疗方案。

对于治疗，通过施用根据本发明的反义化合物来治疗怀疑患有可通过调节AR-V7的表达来治疗的疾病或病症的动物，优选地人。例如，在一个非限制性实施方案中，方法包括向需要治疗的动物施用治疗有效量的AR-V7调节剂的步骤。本发明的AR-V7调节剂有效地调节AR-V7的活性或调节AR-V7蛋白的表达。在一个实施方案中，与对照相比，动物中AR-V7的活性或表达被抑制约10％。优选地，动物中AR-V7的活性或表达被抑制约30％。更优选地，动物中AR-V7的活性或表达被抑制50％或更多。因此，与对照相比，寡聚化合物调节AR-V7mRNA的表达至少10％、至少50％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。

本发明的寡核苷酸包括将该寡核苷酸化学连接至增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物。这些部分或缀合物可包括共价结合官能团例如伯羟基或仲羟基基团的缀合物基团。本发明的缀合物基团包括嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物药代动力学特性的基团、增强寡聚物药效学特性的基团。典型缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本发明范畴中，增强药效学特性的基团包括改进摄取、增强对降解的耐受性和/或加强与靶核酸序列特异性杂交的基团。在本发明范畴中，增强药代动力学特性的基团包括改进本发明化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。缀合物部分包括但不限于，脂质部分例如胆固醇部分、胆酸、硫醚例如己基-5-三苯甲基硫醇、硫胆固醇、脂肪族链例如十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂例如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H膦酸三乙基铵、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈酰基部分或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。本发明的寡核苷酸还可缀合于活性药物物质，例如，阿斯匹林、华法林、苯基丁氮酮、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、氟灭酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂环庚三烯、吲哚美辛、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺药物、抗糖尿病药、抗菌药或抗生素。

为了辅助摄取、分布和/或吸收，本发明的化合物还可与其它分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其它方式关联，例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其它制剂。

尽管反义寡核苷酸不必以载体的背景施用以便调节靶表达和/或功能，但是本发明的实施方案包括用于表达反义寡核苷酸的表达载体构建体，包括启动子、杂合体启动子基因序列，并具备强的组成型启动子活性或在期望情形中可被诱导的启动子活性。

在实施方案中，发明实践包括以适当的核酸递送系统施用至少一种上述反义寡核苷酸。在一个实施方案中，该系统包括可操作地连接于多核苷酸的非病毒载体。这种非病毒载体的实例包括单独寡核苷酸或寡核苷酸与适当的蛋白、多糖或脂质制剂的组合。

另外适当的核酸递送系统包括病毒载体，通常序列来自以下的至少一种：腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、辅助病毒依赖型腺病毒、逆转录病毒或日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合体。优选地，病毒载体包括可操作地连接于多核苷酸的强的真核启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子。

另外优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼氏鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一种优选的基于HIV的病毒载体包括至少两种载体，其中gag和pol基因来自HIV基因组且env基因来自另一病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘病毒载体例如正痘病毒或禽痘病毒载体、疱疹病毒载体例如I型单纯疱疹病毒(HSV)载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。

本发明的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或这种酯的盐、或当施用于动物(包括人)时能够提供(直接或间接)生物活性代谢物的任何其它化合物或其残留物。

本发明还包括包含本发明反义寡核苷酸的药物组合物和制剂。取决于期望局部还是系统治疗和待治疗的区域，本发明的药物组合物可以多种方式施用。施用可以是局部的(包括眼睛和向粘膜，包括阴道和直肠递送)、肺部，例如通过吸入或喷入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮)、口服或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如鞘内或心室内的施用。

本发明的组合物可配制为任何的许多可能剂型，例如但不限于，片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可配制为在含水、不含水或混合介质中的悬浮剂。含水悬浮剂可进一步包含增加悬浮剂粘度的物质，包括例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮剂还可包含稳定剂。

本发明的药物组合物包括但不限于，溶液、乳液、泡沫剂和含脂质体制剂。本发明的药物组合物和制剂可包括一种或多种渗透促进剂、载体、赋形剂或其它活性或无活性配料。

本发明的某些实施方案提供包含一种或多种寡聚化合物和通过非反义机制起作用的一种或多种其它化疗剂的药物组合物。这种化疗剂的实例包括但不限于，癌症化疗药物例如柔红霉素、道诺霉素、放线菌素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、双氯乙亚硝基脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光神霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧柯福霉素、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、泰素、长春新碱、长春碱、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚(DES)。当与本发明的化合物一起使用时，这种化疗剂可单独地使用(例如，5-FU和寡核苷酸)，顺序地使用(例如，5-FU和寡核苷酸持续一段时间，随后是MTX和寡核苷酸)或与一种或多种其它这种化疗剂组合使用(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放疗和寡核苷酸)。包括但不限于非类固醇抗炎药物和皮质激素的抗炎药物及包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、无环鸟苷和更昔洛韦的抗病毒药物也可组合在本发明的组合物中。反义化合物与其它非反义药物的组合也在本发明的范围中。两种或更多种组合的化合物可一起或顺序地使用。

认为治疗性组合物的配制及其随后的施用(给药)在本领域技术人员的能力范围内。给药依赖于待治疗的疾病状态的严重度和响应性，治疗的时期持续数天到数月，或直到实现治愈或实现疾病状态的减轻。最佳给药计划可从患者体内药物积累的测量来计算。本领域普通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可根据单独寡核苷酸的相对效力而变化，通常可基于在有效的体外和体内动物模型中有效的EC50来估算。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了AR-V7的可变剪切特异性功能位点，通过封闭该位点可以抑制AR-V7，而不影响AR-FL的表达，从而抑制AR-V7介导的肿瘤的激素去势抵抗，恢复肿瘤的药物敏感性。

本发明首次发现了lncRNA CYTOR可以调控AR-V7的表达水平，降低CYTOR的表达水平可以恢复肿瘤及肿瘤细胞对药物的敏感性。

本发明首次发现了lncRNA CYTOR特异性结合AR-V7的可变剪切特异性功能位点，调控AR-V7的表达水平，从而为AR-V7阳性去势抵抗性肿瘤的治疗提供新的靶点，恢复肿瘤的药物敏感性。

附图说明

图1是雄激素非依赖性前列腺癌细胞系LNCaP-AI建立过程的细胞形态图。

图2是雄激素非依赖性前列腺癌细胞系LNCaP-AI建立过程中细胞生长能力图。

图3是雄激素非依赖性前列腺癌细胞系LNCaP-AI对双氢睾酮(DHT)和恩杂鲁胺、比卡鲁胺药物的反应图。

图4是雄激素非依赖性前列腺癌细胞系LNCaP-AI建立过程中AR-V7表达水平图。

图5是shCYTOR对CYTOR和AR-V7表达水平的影响图，其中，图A是对CYTOR mRNA的影响图；图B是对AR-V7蛋白的影响图。

图6靶向AR-V7可变剪切特异性功能位点序列设计反义寡核苷酸ASOAR-V7示意图。

图7是转染ASO^AR-V7不同时间对不同细胞系中AR-V7 mRNA水平的影响图；其中，图A为5h，图B为10h。

图8是转染ASO^CYTOR不同时间对不同细胞系中AR-V7 mRNA水平的影响图；其中，图A为LNCaP-AI细胞，图B为22Rv1细胞。

图9是MTT检测在敲低CYTOR以后，LNCaP-AI和22Rv1细胞对恩杂鲁胺药物的敏感性图。

图10是小鼠药物敏感性的反应图，图A是小鼠肿瘤大小图；图B是肿瘤肿瘤统计图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。因此，本发明的宽度和范围不应限于任何上述的实施方案。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1阳性去势抵抗性前列腺癌细胞系LNCaP-AI的构建及验证

1、细胞系的去雄激素培养

将雄激素依赖的前列腺癌细胞系LNCaP培养于10％活性炭去雄激素胎牛血清的RPMI-1640培养基中。细胞于细胞培养箱中进行培养，培养条件为37℃，5％CO2。

2、MTT法检测细胞的增殖活性

将待检测细胞计数后稀释为2×10⁴/ml，接种96孔板中，每孔加入100μl细胞稀释液，约2×10³细胞/孔，每组实验设置4-5个重复孔以减少误差。置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，于接种后1、2、3天后取出96孔板，小心吸去细胞培养液并向待测孔中每孔加100μl 1×MTT溶液，37℃培养箱孵育4h，小心吸出上清液，向待测孔中每孔加150μl DMSO使甲臜溶解，用平板摇床摇匀将待检验溶液置于酶标仪中，在570nm波长处检测光密度。记录各测试孔的光密度(opticaldelnsity，OD)值。

3、MTT法检测去势抵抗性前列腺癌细胞系对化疗药物的反应

采用MTT法检测去势抵抗性前列腺癌细胞系LNCaP-AI对双氢睾酮(DHT)、恩杂鲁胺(MDV3100)和比卡鲁胺(bicalutamide)的反应，具体操作参见步骤2。

4、Western blot检测去势抵抗性前列腺癌细胞系中AR-V7的蛋白水平

1)细胞总蛋白的提取

收集处于对数期的细胞，用预冷的PBS洗涤细胞。将RIPA细胞裂解液和PMSF以100:1的比例混匀，向细胞中加入上述裂解液150μl，冰上放置30min，使用移液器将裂解后的液体吸至EP管中，4℃下14000rpm离心5min，小心收集离心后的上清。

2)总蛋白浓度测定

按照BSA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行蛋白浓度的测定。

3)SDS-PAGE电泳

按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒的说明书配制8％的分离胶和5％的浓缩胶并进行电泳。

4)western检测

a.电转移

将PVDF膜放入甲醇溶液中激活5min，放入转膜缓冲液中平衡20min。取出PAGE胶放入转膜缓冲液中，切下相应的PAGE胶，按照由下到上依次为滤纸、PVDF膜、PAGE胶、滤纸的顺序放到半干的转膜仪中，恒压25V转膜1.5h；

b.免疫杂交

取出PVDF膜，PBS冲洗后置于5％牛奶中室温下孵育1h，将PVDF膜放入杂交袋中，加入一抗过夜，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜，再加入相应的二抗，室温下孵育1h，TBST缓冲液洗涤。

c.DAB显色

PVDF膜稍干后滴加新鲜配制的DAB显色液，PVDF膜显色后扫描记录。以β-actin作为内参照，采用Bio-Rad凝胶成像分析系统对PVDF膜拍照。

5、统计学分析

采用SPSS18.0统计软件对实验数据进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

1)雄激素非依赖性前列腺癌细胞系LNCaP-AI建立过程的细胞形态如图1所示。当LNCaP细胞在无雄激素条件下生长到第10代时(培养时间约1个月)，细胞生长逐渐减慢，大量的细胞死亡，仅剩余少量细胞存活，且细胞状态较差，说明实验进行的雄激素去除处理有效，能够在体外模拟ADT治疗的效果。培养过程中细胞伸出较多细长的触角样伪足结构，伪足结构与胞质之间长度比例较大，部分细胞伪足结构相互交织，形成网状的神经细胞样结构，提示细胞逐步向神经内分泌方向进行转化。随着培养时间的延长，细胞死亡持续加剧，仅剩余星星点点的细胞存活，神经内分泌样细胞消失，存活的细胞呈集落性分布，细胞形态为椭圆状，细胞状态逐步恢复，这一时期的细胞称为LNCaP-AD细胞(Androgen Dependent LNCaP)。将生长状态较好的LNCaP-AD细胞集落小心用胰酶消化下来，转移至96孔板中继续培养。当细胞生长到第40代时(培养时间约3个月)，细胞活性逐步恢复，生长逐渐加快，提示其逐步适应了雄激素缺失的生长环境，逐步向雄激素非依赖方向过度。当细胞生长到第60代时(培养时间约6个月)，可以观察到细胞生长速度较快，状态良好，能够在无雄激素的条件下快速增殖，提示其已经进入雄激素非依赖状态，此后各代细胞均保持这种性状，将这种雄激素非依赖性的LNCaP细胞亚型称之为LNCaP-AI(Androgen Independent)；

2)LNCaP-AI建立过程中的细胞增殖活性如图2所示，与母代LNCaP细胞相比将，去雄培养早期的细胞，细胞生长速度缓慢，且随着去雄时间延长，细胞生长越来越慢。当去雄进入到中期，即第40代时，细胞生长情况较前几代有所增加，提示其逐步适应了雄激素缺失的生长环境，逐步向CRPC方向过度，而最终建立所得的LNCaP-AI细胞系，则生长速度一直较快，能够在不依赖雄激素的条件下快速增殖，提示其已经进入去势抵抗状态。

3)LNCaP-AI细胞对双氢睾酮(DHT)、恩杂鲁胺(MDV3100)和比卡鲁胺(bicalutamide)的反应如图3所示，对照组(DMSO)与药物组之间的细胞增殖无显著性差异，说明LNCaP-AI细胞对雄激素拮抗药物的耐受；

4)LNCaP-AI细胞中的AR-V7的蛋白水平如图4所示，随着去势时间的延长，AR-V7表达量逐步增加，提示长期去雄处理可引起LNCaP-AI细胞中逐步表达AR-V7。

实施例2 CYTOR对去势抵抗性前列腺癌细胞系中AR-V7表达水平的影响

1、细胞培养

体外六孔板培养LNCaP-AI和22Rv1细胞，细胞铺板24小时后转染细胞。

2、转染

1)shRNA的设计

针对长链非编码RNA CYTOR与AR-V7的结合序列设计合成靶向CYTOR的短发夹RNA(shCYTOR)以及对照(shSCR)。

shCYTOR序列如下：

5’-TCTATGTGTCTTAATCCCTTGTCCT-3’(SEQ ID NO.1)

shSCR的序列：

5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3’(SEQ ID NO.2)

2)脂质体转染

采用罗氏的Lipofectamine 2000试剂盒将体外合成的短发夹RNA与脂质体转染试剂混合转染前列腺癌细胞，具体步骤详见说明书。

3、QPCR检测细胞中的CYTOR的mRNA水平

1)细胞总RNA的提取

细胞转染72h后，使用Tiangen公司的细胞RNA提取试剂盒提取RNA，具体步骤详见说明书。

2)反转录

采用Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录为cDNA，具体操作详见试剂盒说明书。

3)PCR反应

引物设计：针对CYTOR和GAPDH的序列设计合成引物，引物序列如下：

CYTOR的引物序列：

正向引物：5’-ACAGGAAGCTCTATGACACACTTG-3’(SEQ ID NO.3)

反向引物：5’-CTGCATTCCGGCTGTGAT-3’(SEQ ID NO.4)；

GAPDH的引物序列：

正向引物：5’-CCATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-GGTGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’(SEQ ID NO.6)；

以GAPDH为内参，进行QPCR反应，以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

4、Western blot检测细胞中AR-V7蛋白的水平

细胞转染72h后，收集细胞中的总蛋白，并对AR-V7和AR-FL的蛋白表达水平进行western检测，具体步骤参见实施例1。

5、结果

结果如图5所示，图A显示了shCYTOR能显著降低细胞中的CYTOR的mRNA水平，差异具有统计学意义(P<0.05)，图B shCYTOR能够显著降低细胞中的AR-V7的蛋白水平，而AR(AR-FL)蛋白则无显著变化，说明长链非编码RNA CYTOR能够不影响AR-FL表达的情况下，调控AR-V7的可变剪切。

实施例3生物信息学预测评估AR-V7可变剪切功能位点

1、AR-V7特有结构的确定

1)使用NCBI数据库中的gene模块选取AR基因(androgen receptor[Homo sapiens(hTman)])的全长转录本即AR-FL(NM_000044.4)，和转录本3即AR-V7(NM_001348061.1)的核酸信息；

2)使用Graphics模块对比AR-FL和AR-V7的mRNA结构，分析AR-V7的特有结构；

3)使用FASTA模块比对mRNA序列，分析剪切的信号序列，确定AR-V7可变剪切的序列。

2、可变剪切功能位点的分析

使用HTman Splicing Finder在线预测评估网站的HSF 3.1模块，选择剪切位点分析(Splice site analysis)，输入基因名称AR，继续选择步骤1中所确定的转录本，采用最大熵预测算法进行分析。

3、可变剪切功能位点特异性的验证

将分析得到的剪切位点序列在AR pre-mRNA序列中进行匹配，寻找序列存在的可能的位置，确定该序列的具体位置。

4、结果及分析

通过对AR-V7结构以及mRNA序列的分析，确定AR-V7 mRNA缺少AR-FL mRNA的外显子4-8。AR-V7 mRNA的结构为AR-FL mRNA的外显子1-3后面连接AR pre-mRNA内含子3中的一部分序列即隐藏外显子3。分析隐藏外显子3的RNA序列时发现，在隐藏外显子3的3’端含有高度保守的5’-AATAAA-3’切割信号序列，在AR-V7 mRNA加工过程中，参与RNA剪切的多酶复合体能够识别这些切割信号序列、切割并进行多聚腺苷酸化，形成腺苷酸(poly A)尾结构。在隐藏外显子3的5’端紧邻内含子3的3’剪接部位存在AG序列。该3’剪接部位存在脊椎动物剪接共有的序列信号特点：10个嘧啶5’-TCTCTCTTTC-3’的延伸，后面紧接任意碱基，再接C，最后终止于AG，这些序列对剪接都是必需的。AR pre-mRNA中隐藏外显子3之前的内含子3序列以“套索”结构的形式被切除，同时外显子3与隐藏外显子3接合，形成成熟的AR-V7 mRNA。因此确定AR-V7 mRNA特有的隐藏外显子3为AR前体mRNA(pre-mRNA)可变剪切的结果。

经过在线预测评估，获得AR-V7隐藏外显子3(即ENST00000504326的外显子4)的5’端功能序列CGGGTTGGC(SEQ ID NO.7)。将该序列进行特异性匹配分析，发现该序列位于AR-V7隐藏外显子3的5’端第9个核苷酸处，而与调节AR-V7可变剪切的长链非编码RNA-CYTOR的部分序列互补，确定该序列为调控AR-V7的可变剪切的序列。

实施例4检测剪切功能位点对AR-V7表达的影响

1、细胞培养

体外六孔板培养LNCaP-AI和22Rv1细胞，细胞铺板24h后转染细胞。

2、转染

1)反义寡核苷酸的设计

根据特异性剪切功能位点序列设计AR-V7的反义寡核苷酸ASO^AR-V7(设计示意图如图6所示)以及CYTOR的反义寡核苷酸ASO^CYTOR，序列如下：

ASO^CYTOR的序列：

5’-GTGGGCGGTTGGAACCAG-3’(SEQ ID NO.8)

ASO^AR-V7的序列：

5’-CAATTGCCAACCCGGAAT-3’(SEQ ID NO.9)

2)脂质体转染

将甲基化修饰的反义寡核苷酸ASO^AR-V7和ASO^CYTOR分别与脂质体转染试剂混合均匀室温孵育20min，将混合物均匀加入培养基中。使得ASO^AR-V7和ASO^CYTOR在培养基中的终浓度分别为0nM，100nM，200nM。

3、PCR检测细胞中的CYTOR的mRNA水平

1)细胞总RNA的提取

转染5h和10h后，使用Tiangen公司的细胞RNA提取试剂盒提取RNA，具体步骤详见说明书。

2)反转录

采用Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录为cDNA，具体操作详见试剂盒说明书。

3)PCR反应

针对AR-V7和AR-FL的序列设计合成引物，引物序列如下：

AR-V7的引物序列：

正向引物：5’-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTA-3’(SEQ ID NO.10)

反向引物：5’-TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT-3’(SEQ ID NO.11)；

AR-FL的引物序列：

正向引物：5’-CAGCCTATTGCGAGAGAGCTG-3’(SEQ ID NO.12)

反向引物：5’-GAAAGGATCTTGGGCACTTGC-3’(SEQ ID NO.13)

采用CWBIO 2×Taq MasterMix、AR-V7引物、AR-FL引物和Sangon Biotech GAPDH内参引物进行PCR反应。

4、结果

结果如图7和8所示，转染ASO^AR-V7和ASO^CYTOR后5h，在LNCaP-AI和22Rv1细胞中均可见到AR-V7表达水平降低，且随着ASO^AR-V7浓度的增加，AR-V7表达水平降低的更加明显；转染后10h，同样可以见到AR-V7表达水平下降，且相对于转染后5h，AR-V7 mRNA水平降低更多。转染5h和10h均未见到AR-FL mRNA水平发生变化，说明ASO^AR-V7和ASO^CYTOR不影响AR-FL表达的情况下，调控AR-V7的可变剪切转染ASO^AR-V7组相对于转染ASO^CYTOR组AR-V7 mRNA水平降低更为明显。

实施例5 AR-V7对恢复药物敏感性的作用

1、体外检测去势抵抗性前列腺癌药物敏感性的反应

采用MTT法检测敲低CYTOR之后去势抵抗性前列腺癌细胞系LNCaP-AI和22Rv1对恩杂鲁胺(10μM)的反应，具体操作参见实施例1。

2、体内检测去势抵抗性前列腺癌药物敏感性的反应

1)将22Rv1转染敲低CYTOR的对照组(shSCR，CYTOR水平无变化)和实验组(shCYTOR，CYTOR水平降低)细胞各6×10⁶，按照细胞体积与Matrigel胶体积3：1进行混合，每组混合物1.2ml。

2)将对照组细胞混合物分别给予6只6周龄裸鼠左上肢腋窝皮下种瘤，每只鼠200μl等量皮下注射。实验组细胞混合物分别给予另外6只6周龄裸鼠同样方法种瘤。

3)种瘤2.5周后，观察两组裸鼠均可见左上肢腋窝皮下成瘤。随机将对照组中3只鼠口饲25mg/kg恩杂鲁胺药物，随机将实验组中3只鼠口饲25mg/kg恩杂鲁胺药物，并将口饲药物的鼠分到新的鼠笼，继续饲养一周后取出皮下肿瘤，称重肿瘤重量。

3、结果

体外检测结果如图9所示，敲低CYTOR之后，雄激素非依赖性前列腺癌细胞系LNCaP-AI和22Rv1恢复对药物的敏感性，体内检测结果如图10所示，CYTOR水平降低后能够抑制肿瘤的生长，即无服药实验组小鼠肿瘤小于无服药对照组小鼠肿瘤，CYTOR水平降低后增强了前列腺癌对于恩杂鲁胺药物的敏感性，即实验组口饲药物小鼠肿瘤相对于实验组无服药小鼠肿瘤的抑制率高于对照组口饲药物小鼠肿瘤相对于对照组无服药小鼠肿瘤的抑制率。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 天津市泌尿外科研究所

<120> AR-V7可变剪切序列在抗去势抵抗性肿瘤中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA