一种植物根内生细菌DNA的提取方法与流程

本发明涉及一种生物高分子提取方法，特别涉及一种植物根内生细菌dna的提取方法。

背景技术：

植物根际及内生细菌群落是植物根际微生态系统的组成成分，植物根际微生物与植物有着非常密切的相互关系，植物根际及内生微生物具有提高植物获取营养物质的能力，促进植物生长，帮助植物抵御植物病原体，提高植物对生物、非生物胁迫的抵抗力等作用。了解植物根际及内生细菌的组成和多样性，对于探究植物根际微生物的群落构建机制和植物根际不同部位微生物之间的相互作用关系具有重要意义。

但是将植物根际及根内细菌分离是个难点，主要原因是植物根际土壤与根部难以分离。以往对于植物根部内生细菌dna的提取，预处理一般是使用酒精、无菌水进行多次清洗，然后进行研磨均质，这种方法实际上很容易使附着于根表面的细小土壤颗粒和微生物不能完全被去除，使得提取的根内生细菌dna被来自根际部分的细菌dna污染，导致提取纯度不高；其次现有的根内生细菌dna提取完毕一般需要进行纯化，耗时耗力，大大降低了提取效率。

现在关于植物内生细菌的提取方法多样，但都存在内生细菌dna可能被污染的问题，为了能满足植物内生细菌dna提取之后研究和操作的要求，行之有效、高质量分离植物根际部分与根内生部分并提取出根内生细菌dna是很有必要的。

技术实现要素：

发明目的：本发明针对无有效方法可分离植物根际细菌与根内生细菌，提出一种有效、提取步骤简单易行、提取纯度高的植物根内生细菌dna的分离、提取方法。

技术方案：本发明所述的一种植物根内生细菌dna的提取方法：包含以下步骤：(1)样品前期处理：将包含植物根部组织的土柱样品冷冻干燥；(2)去除植物根系松散土壤，使得植物根表面附着的土壤厚度低于1-2mm；(3)将经步骤(2)处理后的植物根放入装有pbs缓冲液的离心管中，洗涤、超声处理，获取植物根，随后低温保存；(4)将步骤(3)处理的植物根，研磨、均质；(5)取步骤(4)得到的样品，提取植物根内生细菌dna。

步骤(1)中，包含植物根部组织的土柱样品经冷冻干燥后，在超净工作台上进行操作。

步骤(2)中，将经过步骤(1)冷冻干燥的样品，先采用“抖根法”抖落根部(包括须根)四周松散的土壤，通过无菌手套揉搓和摇动从根部手动除去松散的土壤，直至剩余约为1-2mm附着在根部的土壤。

进一步地，步骤(3)中，将含有根外厚度约1-2mm的土壤样品置于盛有pbs缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)的离心管中进行洗涤，洗涤的具体步骤为：用无菌钳搅动清除根表面所有土壤，涡旋振荡5-10分钟后，取出根部。在该步骤中，对洗涤根部的缓冲液进行离心分离，弃去上清液，洗下来的部分为根际部分，低温保存，可提取根际部分的dna。

涡旋洗涤的目的是将附着于根部的土壤打散，针对附着于根部的大颗粒土壤。

优选地，洗涤次数大于两次，即所述根的内生部分经两次洗涤后，取出根部再放入新的含有35mlpbs缓冲液的50ml离心管中，进行后续处理。

进一步地，所述涡旋震荡的速度为3000r/min。

随后，将洗涤后的根部进行超声处理，所述超声处理次数不低于10个循环。每次经过超声处理后的根需放入新的含有pbs缓冲液的离心管中，多次更换缓冲液和离心管是为了更好地去除根表土壤以及微生物。

所述超声的功率≤40-50w，超声的循环周期为25-30s清洗，25-30s中断。

本发明中进行低功率超声处理的目的是去除附着在根部的细小颗粒土壤及根部表面的其他杂质，同时不破坏根部结构。根部作为分生组织，其表皮细胞的细胞壁很薄，若进行常规的清洗，将会破坏植物根部组织，造成后续步骤中，提取的根内生细菌的流失、破坏，无法准确地反应根部细菌的组成。若仅采取缓冲液清洗，则根部表面的杂质无法获得清除后续根内生细菌dna的提取的不仅需要纯化，另外现有的技术无法精准地分离植物根际部分和根内生细菌的dna，对后续根内生细菌dna的研究结果造成很大影响。

进一步地，步骤(5)中，所述植物根内生细菌dna使用powerbeadtubes试剂盒提取。

步骤(3)中，所述低温保存为在温度-20℃温度下保存。

优选地，步骤(1)中所述土柱样品的冷冻干燥是在真空冷冻干燥机中冻干完全。

优选地，步骤(4)中，所述根研磨均质的条件是，取一定量冻干完全的根内样品于研钵中，用研磨棒将样品快速研磨充分至细小粉末状，过程中多次更换洁净的研钵和磨具。

有益效果：(1)本发明将样品置于pbs缓冲液中振荡及多次超声法处理，减少根际细菌dna对根内生细菌dna的污染；(2)本发明中先用涡旋方法洗涤掉植物根部残余的大颗粒土壤，随后用低功率超声方法去除植物根部表面附着物，既不破坏植物根部表面完整性，又可完全去除杂质细菌；(3)本发明将清洗后的植物根部进行充分研磨，便于提取剂充分提取dna；(4)采用土壤dna提取试剂盒进行dna提取，且提取完毕不需要进行纯化，提高了提取效率。

附图说明

图1为本发明提取的芦苇根部dna电泳图谱。

具体实施方式

下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1：选取南京某湖泊作植物土柱样品采集地，采取的植物为芦苇根部，采集湖泊地面以下5-15cm包含芦苇根部组织的土柱样品，用无菌自封袋盛放，封装好放于超低温冰箱中-20℃冷藏，冷藏48h后取出，在真空冷冻干燥机中处理72h使土柱样品完全冻干，取冻干完全的包含芦苇根部组织的土柱样品，在超净工作台上进行进一步处理。首先采用“抖根法”抖落根部(包括须根)四周松散的土壤，并通过用无菌手套揉搓和摇动从根部手动除去松散的土壤，直至剩余约1mm附着在根部的土壤，将根外厚度约1mm的土壤样品置于盛有pbs缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)的离心管中，用无菌钳搅动清除根表面所有土壤，在3000r/min的转速下，涡旋振荡10分钟后，取出根部，对洗涤缓冲液进行离心分离，弃去上清液，留下来的部分作为根际部分，超低温冰箱中-20℃低温保存；将取出的根部放入新的含有35mlpbs缓冲液的50ml离心管中，重复以上洗涤步骤一次，弃去缓冲液，取出根部再放入新的含有35mlpbs缓冲液的50ml离心管中，置于超声清洗机中，在低功率40w下清洗10个循环(30s清洗，30s中断)，从pbs中获得的根部组织样品即根内生样品，放于超低温冰箱中-20℃低温保存。之后将根的内生部分用组织研磨器研磨1分钟，然后将根际、根内样品研磨均质，使用精密电子天平各称取重量为0.25g根内样品置于10ml塑料连盖离心管中；采用powerbeadtubes试剂盒，按试剂盒操作步骤分别提取根际部分及根内部分内生细菌dna。

使用powerbeadtubes试剂盒提取的具体步骤为：

1)加入0.25g样品到powerbeadtubes缓冲液中，轻轻涡旋摇匀；

2)加入c1溶液(含有sds以及其他用于细胞裂解的试剂)进行检测，若出现沉淀，60℃水浴至全溶解；

3)加入60μlc1溶液，上下颠倒数次摇匀，目的是破坏细胞膜上的脂肪酸、脂质；

4)把powerbeadtubes固定在涡旋仪适配器上，3200rpm涡旋连续振荡10～15min；

5)室温10000g离心30s；

6)转移上清至一个干净的2mlcollectiontube(试剂盒提供)中；

7)加入250μlc2溶液(含有组分可沉淀那些影响dna纯度和下游实验的非dna的有机、无机物质，如腐殖酸、细胞碎片、蛋白质等)到上清中，涡旋混匀5s。4℃孵育5min；

8)室温10000g离心1min；

9)避开沉淀小珠，转移上清≤600μl到一个新的收集管中；

10)加入200μlc3(含有组分可进一步沉淀那些影响dna纯度和下游实验的非dna的有机、无机物质，如腐殖酸、细胞碎片、蛋白质等)到上清中，涡旋摇匀。4℃孵育5min；

11)室温10000g离心1min；

12)避开沉淀小珠，转移上清≤750μl到一个新的收集管中；

13)c4溶液(高浓度盐溶液)使用前先摇匀。加入1200μlc4溶液到上清中，涡旋摇匀5s，目的是调整dna溶液的盐浓度，使dna在高盐环境下牢牢地吸附在硅胶滤膜上；

14)加载约675μl上清到spinfilter过滤柱中，室温10000g离心1min，重复此步骤；

15)加入500μlc5(以酒精为主的缓冲液)到spinfilter中，室温10000g离心30s，目的是进一步去除滤膜上非dna成分的盐分、腐殖酸等杂质；

16)弃去上清(滤液不含dna)；

17)室温10000g离心1min，目的是进一步去除残留c5溶液(酒精缓冲液)；

18)小心转移spinfilter到collectiontube(试剂盒提供)中，尽量避免c5溶液污染；

19)加入100μlc6溶液(dna洗脱液)或无菌te缓冲液到白色滤膜中心；

20)室温10000g离心30s；

21)弃去spinfilter。此时收集管中的dna可直接用于下游实验，无需进一步纯化。dna冷冻保存(-20℃～-80℃)。

将实施例1中提取出来的内生细菌dna，取3个样品，各做2个平行，作为聚合酶链反应(pcr)的模板，在pcr仪中进行pcr扩增，采用通用引物779f(5'-aacmggattagataccckg-3')和1115r(5'-agggttgcgctcgttgg-3')进行pcr扩增，扩增产物片段长为336bp。pcr扩增反应体系为：提取的基因组dna模板1μl、上下游引物(779f-115r)各0.6μl、taqpremix-blue：10μl、灭菌水7.8μl。pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最终72℃延伸10min，4℃保存。

取5μlpcr扩增后的样品体系，经质量分数为0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增的16srdna的纯度，用凝胶成像仪照相观察。电泳条件为：电压150v，电流100ma，1×tbebuffer，25min。电泳结果如图1，图1中a为dnamarker，b为提取出来的内生细菌dna的扩增片段，c为两个阴性对照。

电泳结果如图1所示，从图1中可以看出，扩增片段的电泳条带十分清晰，且明亮程度较大，说明提取出来的dna纯度较高，提取效果较好。

本发明将根际和根内生部分的细菌分离、可以极大减少植物根际部分细菌dna对根内生细菌dna的污染，省略了纯化步骤，安全实用，提高了细菌dna的提取效率和纯度，优势明显。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应注意的是，对于本行业技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明方法原理和精神的前提下，本发明还会有若干改进和变形，这些改进和变形也应落入本发明的保护范围之内。