牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及动物病毒分子生物学检测方法领域。具体涉及一种牛结节性皮肤病病毒野毒株taqman-mgb实时荧光定量pcr检测用引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

牛结节性皮肤病（lumpyskindisease,lsd）又称牛疙瘩皮肤病、牛结节疹或牛结节性皮炎，是由牛结节性皮肤病病毒（lumpyskindiseasevirus,lsdv）引起的一种牛的急性、亚急性传染病，各种牛均易感，被世界动物卫生组织（oie）列为必须通报的动物传染病，是《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》规定的一类传染病。该病的感染率为5%~85%，病死率为10%；其主要临床特征为病牛皮肤表面出现大量疙瘩样结节，体温升高至40℃以上，消瘦，产奶量剧减约50%。同时，还可致原发性和继发性肺炎，感染的患畜四肢因滑膜炎和腱鞘炎而引起跛行，患病母畜流产，公畜暂时或永久不育，严重时导致死亡；皮张鞣制后具有凹陷或空洞而造成巨大的经济损失，对养牛业危害巨大。

该病于1929年在非洲赞比亚地区首次发现，随后50年里该病仅在非洲大陆广泛传播。1943年传播至波扎那，然后传入南非，引起800万头牛只发病，造成了重大的经济损失。1957年肯尼亚出现该病并大流行。1971年苏丹出现改变后，lsd跳过撒哈拉沙漠，1974年在乍得、尼日尔和尼日利亚被发现；1976年到达象牙海岸，接下来lsdv一直在非洲大陆周期性的暴发。1977年毛利达利亚、加纳、利比里亚均有该病的报道。1981~1986年，坦桑尼亚、肯尼亚、津巴布韦、索马里均有发生该病，死亡率在20%左右。1989年lsdv从非洲大陆传入中东的以色列，并不断蔓延至该地区的科威特、巴林等10多个国家。2013年lsdv传入土耳其并在其国内扩散而成为地方流行性疾病；2014-2015年lsdv在中东地区继续扩散，相继传入伊朗和沙特，以及阿塞拜疆和亚美尼亚等高加索国家。2015年lsdv再次跨州传播，传入欧洲的希腊和俄罗斯；2016年lsdv在欧洲继续蔓延，先后传入保加利亚、马其顿、塞尔维亚、阿尔巴尼亚和黑山等国家，引起了全球关注。2015年-2016年欧洲7个国家累计报告疫情1455起，发病牛达20183头，其中，俄罗斯报告的lsdv疫情数和病例数最多。上述报道表明，lsdv传入我国的风险极大。我国境内尚未发生lsdv。鉴于我国与发病国家的贸易和人员往来日益频繁，lsdv在全球进一步扩散的形式、对lsdv认识和研究还存在许多未知等情况，而国内对该病毒的研究尚不足，因此，为了防止该病毒通过从国外引进种畜或进口肉制品等途径而进入我国，在进境时加强对肉制品中牛结节性皮肤病病毒的检测显得尤为重要。

荧光定量pcr技术是一种快速、准确的检测方法，且具有高特异性、高敏感性和稳定性。而mgb探针是一种新型的探针，3’端经特殊处理的高特异性探针，能检测模板结合区甚至1个碱基的突变基因，且本底荧光信号低，准确率高。由于羊痘病毒属病毒（牛结节性皮肤病病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒）其同源性非常高，可达96%以上，非常难鉴别。而牛结节性皮肤病病毒疫苗株与野毒株之间的差异则更小，鉴别牛结节性皮肤病病毒疫苗株与野毒株是当前检测领域非常难的问题之一。本针发明针对taqmanmgb探针的优点，可以鉴别1个碱基的突变基因，通过对lsdv野毒株特异性保守序列与疫苗株的差异性进行深入分析，筛选，创新性的设计了特异性引物和taqmanmgb探针，首次建立了特异性强、敏感性高、稳定性好的鉴别牛结节性皮肤病病毒野毒株的荧光定量检测方法。

taqman探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭基团则在3’端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光信号与3’端基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生产将会伴随一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此，taqman探针检测的积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。

taqman-mgb探针是近年来发明的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会发生荧光，这样就降低了pcr反应的荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性和特异性。

技术实现要素：

为克服上述现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种牛结节性皮肤病病毒野毒株taqman-mgb探针实时荧光定量pcr检测用引物，第二个目的是提供使用该引物进行牛结节性皮肤病病毒野毒株taqman-mgb探针实时荧光定量pcr检测的试剂盒，第三个目的是提供使用上述试剂盒的检测方法，该检测方法用于对进口肉制品中牛结节性皮肤病病毒的检测。

为了实现上述第一个目的，本发明采用如下技术方案：本发明检测用引物包括牛结节性皮肤病病毒野毒株上游引物，其dna序列为seqidno.1；牛结节性皮肤病病毒野毒株下游引物，其dna序列为seqidno.2；牛结节性皮肤病病毒野毒株mgb探针，其dna序列为seqidno.3。

为实现上述第二个目的，本发明采用如下技术方案：一种牛结节性皮肤病病毒野毒株taqman-mgb探针实时荧光定量pcr检测试剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：

所述扩增反应液管包括以下反应液：

序列为seqidno.1的10μmol/l牛结节性皮肤病病毒野毒株上游引物0.5μl；

序列为seqidno.2的10μmol/l牛结节性皮肤病病毒野毒株下游引物0.5μl；

序列为seqidno.3的10μmol/l牛结节性皮肤病病毒野毒株mgb探针1.0μl；

2xpremixextaq(probepcr)缓冲液8.0μl；

灭菌去离子水9.0μl；

19μl，为单次反应的用量。

所述阳性对照管：管内为牛结节性皮肤病病毒野毒株阳性重组质粒dna，体积为50μl；

所述阴性对照管：管内为无牛结节性皮肤病病毒野毒株感染的牛组织基因组dna，体积为50μl；

所述灭菌去离子水管：1000μl。

为实现上述第三个目的，本发明提供一种牛结节性皮肤病病毒野毒株taqman-mgb探针实时荧光定量pcr检测方法，包括如下步骤：

（1）制备待检测样品模板dna：选用商品化的组织或血液dna提取试剂盒，提取待测样品的基因组dna或病毒dna，获得待检样品模板dna。

（2）扩增反应体系为：19μl扩增反应液，1μl待检样品模板dna或阳性对照或阴性对照，反应体系总体积为20μl。

（3）实时荧光定量pcr扩增，将步骤2)配制好的扩增反应体系进行pcr扩增，扩增反应条件：95℃30s，1个循环；95℃5s，56℃34s（fam，使用abi7500fast建议采用34s），45个循环，在56℃34s进行荧光信号采集。

（4）结果判定：将扩增反应在40个循环内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，40个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增曲线明显，阴性对照没有扩增。反之，阳性质控未出现目的条带或阴性对照出现条带，则结果无效。

本发明的原理是：针对一段靶序列保守区域设计2条引物和一条mgb探针，利用探针只与模板特异性地结合，其结合的位点在两条引物之间。探针的5’端标记有报告基团fam，3’端标记有非淬灭基因，本身不产生荧光，可以大大降低本低信号的强度。同时探针上还连接有mgb修饰基因，可以将探针的tm值提高10℃左右。因此，为了获得同样的tm值，可以将mgb探针设计的更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大大提高，扩增效率更高。这种实验方法所使用的仪器比较简单，同时克服了传统pcr固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，该检测方法对检测人员的技术要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。

taqman-mgb探针荧光定量pcr扩增技术是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增方法。将此基因扩增技术与普通pcr或普通taqman探针技术进行比较，可发现该技术在特异性、敏感性和检测范围等指标上明显优于普通pcr和普通taqman探针技术，且不依赖于任何特殊的仪器设备即可实现现场高通量快速检测。整过检测周期仅需50min左右。

本发明的优点是：（1）不需要特殊试剂与设备；（2）高特异性：应用保守区段，二条特异性引物及一条mgb探针，根据是否扩增就能判断靶标物质是否存在，阳性检出率可达99.8%，假阳性率小于0.1%，假阴性率小于0.6%；（3）快速、高效扩增：检测时间仅需50min左右。（4）敏感性高：最低检测低限达4.6拷贝/μl；（5）鉴定结果简便：通过最后的扩增曲线即可对检测结果进行精确的判定，无需再进行电泳等其他任何分析步骤，同时减少化学污染；（6）用途：可用于畜产品及其相关产品的快速检测。

附图说明

图1为特异性试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数；

图2、图3均为敏感性试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数；

图4为重复性试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数；

图5为标准曲线的建立。

具体实施方式

下面提供具体实施例，进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于以下实施例。

实施例1，引物的设计与筛选

根据genbank网站上公布的牛结节性皮肤病病毒野毒株参考序列和疫苗株序列进行比对分析，针对taqmanmgb探针的优点，可以鉴别1个碱基的突变基因，深入分析lsdv野毒株与疫苗株基因序列的差异性，最后选择lsdv的orf126区域，利用primerpremier5.0生物软件创新性地设计了其特异性引物和taqmanmgb探针，分别标记为seqidno.1-seqidno.3。所有引物和探针均送往由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。其中引物组中牛结节性皮肤病病毒野毒株上游引物：seqidno.1；牛结节性皮肤病病毒野毒株下游引物：seqidno.2；牛结节性皮肤病病毒野毒株探针：seqidno.3。seqidno.1-seqidno.3的浓度分别为10μmol/l，10μmol/l，10μmol/l，其体积比为1:1:1。同时，利用pcr引物软件设计阳性重组质粒dna的pcr引物，其核苷酸序列分别为：pcr上游引物：seqidno.4；pcr下游引物：seqidno.5；它们的体积比为1:1。具体引物序列如下：

序列为seqidno.1代表的序列为：

5’-atttaatttgggacgataacaacg-3’；

序列为seqidno.2代表的序列为：

5’-gttgttacaactcaaatcgttagg-3’；

序列为seqidno.3代表的序列为：5’-fam-accacctaatgatag-mgb-3’；

序列为seqidno.4代表的序列为：5’-gtacttggtcaaattgtag-3’；

序列为seqidno.5代表的序列为：5’-cattgtcrtcyggtaatgt-3’。

实施例2，阳性重组质粒构建

将人工合成lsdv野毒株基因组进行pcr扩增及电泳鉴定。采用pcr上游引物seqidno.4和pcr下游引物seqidno.5进行扩增，并使用胶回收试剂盒回收扩增目的条带。按照1:10的比例与pmd19-t载体进行连接反应，4℃连接过夜，转化dh5a菌，经抗性选择和pcr鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定其核酸的od值，使其260/280的比值在1.8~2.0之间。

实施例3，阴性对照品的制备

用商品化试剂盒提取无牛结节性皮肤病病毒感染的牛组织dna，并进行pcr鉴定阴性。

实施例4，牛结节性皮肤病病毒野毒株taqman-mgb探针实时荧光定量pcr检测方法，包括如下步骤：

（1）制备待检样品模板dna：选用商品化的组织或血液dna提取试剂盒，提取待测样品的基因组dna或病毒dna，获得待检样品模板dna。

（2）扩增反应体系为：19μl扩增反应液，1μl待检样品模板dna或阳性对照或阴性对照，反应体系总体积为20μl。

（3）实时荧光定量pcr扩增，将步骤2)配制好的扩增反应体系进行pcr扩增，扩增反应条件：95℃30s，1个循环；95℃5s，56℃34s（fam，使用abi7500fast建议采用34s），45个循环，在56℃34s进行荧光信号采集。

（4）结果判定：将扩增反应在40个循环内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，40个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增曲线明显，阴性对照没有扩增。反之，阳性质控未出现目的条带或阴性对照出现条带，则结果无效。

实施例5，特异性试验

采用实施例4的反应体系及反应条件进行特异性试验，所采用的反应模板分别是牛结节性皮肤病病毒（lsdv）疫苗株、牛结节性皮肤病病毒（lsdv）野毒株、绵羊痘病毒（sppv）疫苗株、绵羊痘病毒（sppv）野毒株、山羊痘病毒（gtpv）疫苗株、山羊痘病毒（gtpv）野毒株、牛痘病毒（cowpoxvirus）、猪圆环病毒（pcv）2型的基因组dna和猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）、蓝舌病病毒（btv）、小反刍兽疫病毒（pprv）的cdna，同时设立depch2o阴性对照。参见图1的结果显示：只有牛结节性皮肤病病毒野毒株核酸有特异性扩增曲线，其他相关核酸均无典型扩增曲线。图1中曲线表示牛结节性皮肤病病毒野毒株dna扩增结果。

实施例6，敏感性试验

将所建立的牛结节性皮肤病病毒野毒株（wtlsdv）质控标准品进行10倍倍比稀释（1.84×10⁷拷贝/μl~1.84×10⁰拷贝/μl），同时，将1.84×10⁰拷贝/μl的wtlsdv重组质粒再进行2倍倍比稀释，采用实施例4的反应体系及反应条件进行敏感性试验，建立的该方法最低能够检测出4.6拷贝/μl的dna样品。

参考图2的结果显示：图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依次分别是1.84×10⁷拷贝/μl，1.84×10⁶拷贝/μl，1.84×10⁵拷贝/μl，1.84×10⁴拷贝/μl，1.84×10³拷贝/μl，1.84×10²拷贝/μl，1.84×10¹拷贝/μl；1.84×10⁰拷贝/μl；

参考图3的结果显示：图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依次分别是1.84×10⁶拷贝/μl；18.4拷贝/μl，9.2拷贝/μl，4.6拷贝/μl；2.3拷贝/μl，2.3拷贝/μl，1.2拷贝/μl。

实施例7，重复性试验

以重组质粒标准品1.84×10¹拷贝/μl、1.84×10²拷贝/μl、1.84×10³拷贝/μl、1.84×10⁴拷贝/μl、1.84×10⁵拷贝/μl为模板，采用实施例4的反应体系及反应条件进行重复性试验，组内与组间重复试验变异系数分别为0.43%~1.2%和1.08%~2.41%，表明该方法具有较好的重复性。参见图4的结果显示。

实施例8，标准曲线的建立

把重组质粒的标准品进行7个梯度的倍比稀释，制作标准曲线，以荧光强度的对数值为横坐标，循环数的纵坐标作图，得到标准曲线，相关系数r2=0.999，扩增效率大于98%，y=－3.361x＋34.979。由此可见本实验所建立的标准曲线扩增效率较好，其荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间的相关性较好，准确度较高。参见图5的结果显示。

实施例8试剂的制备

扩增反应液管：序列为seqidno.1的10μmol/llsdv野毒株上游引物0.5μl；序列为seqidno.2的10μmol/llsdv野毒株下游引物0.5μl；序列为seqidno.3的10μmol/llsdv野毒株mgb探针1.0μl；2xpremixextaq(probepcr)缓冲液8.0μl；灭菌去离子水9.0μl；共19μl，为单次反应的用量。每个试剂盒共包括50个反应的量，共950μl。

所述阳性对照管：管内为lsdv野毒株阳性重组质粒dna，体积为50μl；

所述阴性对照管：管内为无lsdv感染的牛组织基因组dna，体积为50μl；

所述灭菌去离子水管：1000μl。

实施例9试剂盒的组装

按实施例8所配制的扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管、灭菌去离子水管各1支，贴上生产日期、有效期及产品标签，-20℃保存及运输。

sequencelisting

<110>重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>牛结节性皮肤病病毒野毒株taqman-mgb实时荧光定量pcr检测用引物、试剂盒及检测方法

<160>5

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>seqidno.1

atttaatttgggacgataacaacg24

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列

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gttgttacaactcaaatcgttagg24

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<212>dna

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fam-accacctaatgatag-mgb15

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<212>dna

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<400>seqidno.4

gtacttggtcaaattgtag19

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<212>dna

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<400>seqidno.5

cattgtcrtcyggtaatgt19