本发明属于农业生物技术领域，具体涉及提高里氏木霉转化效率的重组表达载体及应用。
背景技术
里氏木霉作为主要的丝状真菌之一，其纤维素酶产量可高达100g/l，是纤维素酶的主要生产菌株。里氏木霉具有表达量高、分泌效率高、能进行翻译后加工，如糖基化、蛋白酶的切割和二硫键的形成等修饰的特点。因此，里氏木霉成为具有吸引力的基因工程宿主菌，常被用于过表达纤维素酶和半纤维素酶基因。
相比大肠杆菌和酿酒酵母这两个常用的外源基因表达系统，里氏木霉是多细胞微生物，具有较厚的细胞壁，不利于丝状真菌高效转化。目前里氏木霉常用的转化方法有以下4种：peg介导的原生质体的转化、根瘤农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化。现有技术中，使用最多的里氏木霉转化方法是原生质体转化法。经典的peg原生质体转化方法不需要借助外界设备、操作简单，但该转化方法存在转化子少，且阳性率低的现象，在一定程度上限制了目的基因的高效表达。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的里氏木霉的转化子少、阳性率低的问题，本发明提供一种提高里氏木霉转化效率的重组表达载体，其能够提高里氏木霉的转化效率。
本发明的目的是提供一种提高里氏木霉转化效率的重组表达载体。
本发明的再一目的是提供制备转化效率提高的里氏木酶的方法。
根据本发明的具体实施方式，提高里氏木霉转化效率的重组表达载体中，基因表达盒的目的基因的下游顺次连接有序列tel1和序列tel2，所述序列tel1的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述序列tel2的核苷酸序列如seqidno.2所示。
根据本领域的公知常识，所述基因表达盒由上游至下游一般包括启动子、目的基因，终止子，筛选标记基因和其它调控序列。
根据本发明的具体实施方式，可以将序列tel1和序列tel2插入在终止子的下游，或筛选标记基因的下游。
序列tel1的核苷酸序列seqidno.1：
attaccctgttatccctattagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggtaactataacggtcctaaggtagcgaa
序列tel2的核苷酸序列seqidno.2：
taactataacggtcctaaggtagcgaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaagcgatcgc
根据本发明的具体实施方式，序列tel1和序列tel2之间连接有核酸酶i-ceui识别位点。
根据本发明的具体实施方式，所述基因表达盒的结构从上游到下游依次为启动子、目的基因、终止子、序列tel1、序列tel2，序列tel1和序列tel2之间连接有核酸酶i-ceui识别位点。
根据本发明的具体实施方式，本发明重组表达载体的基因表达盒中启动子为cbh1启动子，所述目的基因为dsred基因，所述终止子为cbh1终止子；所述重组表达载体的结构为ppcbh1-dsred-tcbh1-pyr4-tel1-tel2，序列tel1的核苷酸序列如seqidno.1所示，序列tel1和序列tel2之间连接有核酸酶i-ceui识别位点。
本发明提供了提高里氏木霉转化效率的重组表达载体的应用。
本发明提供了提高里氏木霉转化效率的方法，所述方法包括使用改造的重组表达载体转化里氏木霉的步骤，在所述重组表达载体的基因表达盒的目的基因的下游顺次连接有序列tel1和序列tel2，所述序列tel1的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述序列tel2的核苷酸序列如seqidno.2所示。
根据本发明的具体实施方式，提高里氏木霉转化效率的方法，包括以下步骤：
(1)向质粒中引入基因表达盒，得到重组表达载体，其中，所述基因表达盒的目的基因的下游顺次连接有序列tel1和序列tel2，所述序列tel1的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述序列tel2的核苷酸序列如seqidno.2所示；
(2)将重组表达载体转化入里氏木霉，得到重组菌株；
(3)培养重组菌株。
根据本发明的具体实施方式，提高里氏木霉转化效率的方法，步骤(1)中，将序列tel1和序列tel2之间连接核酸酶i-ceui识别位点。
根据本发明的具体实施方式，提高里氏木霉转化效率的方法，步骤(1)中，构建ppcbh1-dsred-tcbh1-pyr4-tel1-tel2质粒表达载体。
本发明的有益效果：
本发明在重组表达载体的基因表达盒中引入序列tel1和序列tel2，其中序列tel2中包含15个5’-ccctaa-3’连续重复的序列，而序列tel1中包含有与该重复区域反向互补的序列。里氏木酶中插入重组表达载体后，其转化效率相比于未添加上述序列的载体提高了2倍以上。
附图说明
图1显示乳糖平板法检测转化子中dsred基因的表达情况；
图2显示dsred基因在转化子中的拷贝数。
具体实施方式
实施例1
1.构建表达红色荧光蛋白的重组质粒：ppcbh1-dsred-tcbh1-pyr4、ppcbh1-dsred-tcbh1-pyr4-tel1-tel2
cbh1启动子与tel2以overlap的方式连接；dsred与tcbh1以overlap的方式连接；pcbh1-tel2、dsred-tcbh1、pyr4-ampr-ori三个片段通过无缝拼接的方式连接，得到中间质粒载体。将tel2-pcbh1片段、dsred-tcbh1片段、pyr4-ampr-ori片段，按照无缝拼接试剂盒的方法连接。测序成功后，便得到了中间质粒载体ppcbh1-dsred-tcbh1-pyr4-tel2。将中间质粒载体和tel1片段用i-ceui和spei双酶切，回收片段后，用t4连接酶连接两个片段。22℃连接1h，转化大肠杆菌trans1后，挑单克隆验证阳性转化子，得到重组质粒载体ppcbh1-dsred-tcbh1-pyr4-tel1-tel2。
将pyr4-ampr-ori、cbh1启动子、dsred、cbh1终止子以无缝拼接的方式连接。37℃连接30min，转化大肠杆菌trans1后，挑单克隆验证阳性转化子。测序成功后，便得到质粒ppcbh1-dsred-tcbh1-pyr4。
2.用含tel序列质粒和不含tel序列的对照质粒转化入里氏木霉
将里氏木霉tu-6接种于土豆培养基(pda)平板上，28℃静置培养7d待其产孢，将孢子刮下并接种于100ml含有尿嘧啶的pdb培养基中，28℃、160rpm振摇培养过夜。200目筛过滤收集萌发的菌丝，加入10mg/ml的酵母破壁酶，在30℃消化2-3小时。收集原生质体后，将质粒转化里氏木霉tu-6菌株。本发明中，每个转化混合液培养基倒入10个平板，以方便转化子个数的计数。
3.重组转化子的计数
重组质粒转化tu-6后，培养4-5天后，对含tel序列质粒和不含tel序列的对照质粒转化子个数进行统计，结果如表1所示：
表1转化子数目的比较
由实验结果可知，加入序列tel后，转化子数量提高超过2倍。
4.肉眼观测dsred基因表达红色荧光蛋白
用含有tel和dsred表达盒的质粒转化里氏木霉tu-6菌株，培养5-7天后。待单克隆长出后，挑取单个转化子，接种于含mm-乳糖培养基的24孔板，于28℃培养5-7天。培养期间，观察转化子菌落的颜色，如图1所示，转化子菌落呈红色，可见dsred基因在里氏木酶中得到表达。
5.提取代表性转化子的基因组
为了验证质粒中添加tel序列后，是否是以低拷贝的形式插入里氏木霉tu-6中，本发明从不同启动子样本中选择代表性的转化子，提取真菌基因组。
将代表性转化子接种pda板生长、产孢7d后，接mm-glucose种子培养基2d后，收集菌丝并压干，分装于2mlep管，迅速冻于液氮中。提取时，用机器研磨菌丝1分30s，提取方法参照真菌试剂盒fungaldnakit。
6.转化子的质粒载体拷贝数的鉴定
转化子的拷贝数的鉴定采用qrt-pcr的方法，选择单一拷贝数的cbh1基因作为内参，dsred作为检测的目标基因。
在不同启动子中，各选择4株具有同荧光强度的代表性的转化子，将基因组dna的浓度稀释至1-2ng/μl，取1μl为模板；以引物qcbh1f(5'-attcggcggatcctctttctc-3')和qcbh1r(5'-tgtggaggaggtctcgttgtc-3')扩增cbh1基因，以引物对qdsredf(5'-gagaagctgtacccccaggac-3')和qdsredr(5'-tgccgggcagctgcacgggct-3')扩增dsred基因。dsred基因的拷贝数用2-△△ct法相对定量。
dsred基因与序列tel物理联系在一个质粒载体上，所以dsred拷贝数的多少可以验证序列tel是否以低拷贝的形式插入里氏木霉中。转化子拷贝数的鉴定结果如图2所示，可见序列tel可以引导dsred基因在里氏木霉中以1-2拷贝的低拷贝的形式存在。
序列表
<110>中国农业科学院饲料研究所
<120>提高里氏木霉转化效率的重组表达载体及应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>135
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
attaccctgttatccctattagggttagggttagggttagggttagggttagggttaggg60
ttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggtaactataacgg120
tcctaaggtagcgaa135
<210>2
<211>125
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
taactataacggtcctaaggtagcgaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccc60
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