本发明涉及生物检测领域，更具体地，涉及一种人源dna样本codis探针组合和包括该dna探针组合的试剂盒，尤其涉及微量dna提取纯化的试剂盒。
背景技术
str(shorttandemrepeat，短片段重复序列)广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性，它们是由2-6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。对于一个特定的个体，染色体上某个特定基因座位的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一基因座位的重复次数可能不同，这就构成了人群中不同个体间在同一基因座存在一定的差异。由于人类基因组中这种重复序列非常多，通过对多个基因座多态性的联合检测，就可以明确区分个体与个体的不同，以及确定父母子的亲缘关系，所以str基因座的分型在公安、司法、科研部门被广泛应用。
为了建立全国范围内str分型的查询系统数据库，使罪犯dna资料能够异地查询，便于搜寻犯罪嫌疑人及串、并案的目的，1990年美国联邦调查局(fbi)开始实施联合dna检索系统(combineddnaindexsystem，codis)计划，并挑选了13个常染色体str基因座作为核心基因座，2011年codis核心基因座工作组在剔除原有的tpox基因座的基础上，又新增了6个常染色体str基因座，形成了19个新的codis核心基因座。联合应用的str基因座越多，得到准确结果的概率就越高，所以一些案件分析中，工作者会检测包括codis基因座在内的多个基因座。
对于大多数str分型试剂盒，1ng是最理想的模板量，然而在法医学实践中经常遇到不够理想的检材，微量甚至超微量即低拷贝模板dna(lowcopytemplate，lcn)检材，乃至高度腐败降解的生物物证检材。目前国内外已有多种针对str分型的试剂盒，但在dna模板含量低于125pg时，绝大多数试剂盒pcr扩增后dna的str分型rfus峰值较低或者无法正常出峰，数据无法采用，这给案件分析带来了许多不便。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，适应现实发展，提供一种从低拷贝模板生物检材中提取纯化极微量目的基因座的探针组合、包括该基因座探针组合的试剂盒和便于存储、使用、携带的外包装盒。
本发明所述的一种从低拷贝模板生物检材中提取纯化极微量目的基因座的探针组合，包括针对19个codisstr基因座的特异性捕获探针，其中，所述19个codisstr基因座分别为：d3s1358、fga、d5s818、csf1po、d8s1179、d7s820、th01、vwa、d13s317、d16s539、d18s51、d21s11、d2s1338、d19s433、d1s1656、d12s391、d2s441、d10s1248和dys391；所述针对19个codisstr基因座的特异性捕获探针的序列分别如seqidno.1至idno.14所示；
针对所述d3s1358、d8s1179、d21s11基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.1所示；
seqidno.1：5’-(tcta)m-(tctg)n-3’；
针对所述fga基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.2所示；
seqidno.2：5-(tttc)4ttttttct(cttt)m(ctgt)n(cttt)0(cttc)3-4(cttt)3ctcc(ttcc)4-3’；
针对所述d5s818、csf1po基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.3所示；
seqidno.3：5’-(agat)m-3’；
针对所述d7s820、d16s539基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.4所示；
seqidno.4：5’-(gata)m-3’；
针对所述th01基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.5所示；
seqidno.5：5’-(aatg)m-3’；
针对所述vwa基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.6所示；
seqidno.6：5’-(acta)m-3’；
针对所述d13s317、d2s441基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.7所示；
seqidno.7：5’-(tatc)m-3’；
针对所述d18s51基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.8所示；
seqidno.8：5’-(agaa)m-3’；
针对所述d2s1338基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.9所示；
seqidno.9：5’-(tgcc)m(ttcc)n-3’；
针对所述d19s433基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.10所示；
seqidno.10：5’-(aagg)aaag(aagg)tagg(aagg)m-3’；
针对所述d1s1656基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.11所示；
seqidno.11：5’-(taga)m(tga)0-1(taga)n(tagg)0-1(tg)5-3’；
针对所述d12s391基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.12所示；
seqidno.12：5’-(taga)m(agac)n(agat)0-1-3’；
针对所述d10s1248基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.13所示；
seqidno.13：5’-(ggaa)m-3’；
针对所述dys391基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.14所示；
seqidno.14：5’-(tctg)3(tcta)m-3’；
m和n均为可变数目，每组基因座的特异性捕获探针的序列总长度控制在300bp。
本发明还公开了一种微量人源dna样本的提取、纯化试剂盒，包括上述的一种从低拷贝模板生物检材中提取纯化极微量目的基因座的探针组合。
进一步，所述特异性捕获探针的序列seqidno.1至idno.14等比例混合，优选特异性捕获探针的点样浓度为100um。
进一步，包括包被有基因座特异性捕获探针的微型离心管，还包括杂交增强剂和杂交清洗液。
本发明还公开了上述微量人源dna样本的提取、纯化试剂盒的应用方法：将待检测的微量或降解的人源dna样本、针对所述19个codisstr基因座的捕获探针组合，特异性抓捕目的片段作为模板，再结合市售str分型试剂盒进行检验，能够大大提高检出率。
进一步，能够应用于法医个体识别，亲子鉴定，尸源认定过程中遇到的各种检材样本，包括对高浓度血迹，精液样本，微量、高度降解、高抑制剂含量的样本dna的提取、纯化，以及对白骨化尸骨、接触性脱落细胞或者土壤中的血液样本dna的提取、纯化。
本发明同时还提供了一种微量人源dna样本的提取、纯化试剂盒的外包装盒，包括盒体和底板，所述盒体包括内壳和外壳，所述内壳和外壳均为圆柱体，所述底板与所述盒体内壁底部相结合，所述内壳包括内层和外层，所述内壳内层填充有乳胶海绵或泡沫，所述乳胶海绵或泡沫上开设有放置杂交增强剂试管的插孔和放置杂交清洗液试剂瓶的凹槽，所述插孔和所述凹槽的开口位于所述内壳的上端面上，便于杂交增强剂试管和杂交清洗液试剂瓶的取装，所述底板上设有与所述内壳外层底部相对应的轨道，所述内壳外层能够在所述轨道上旋转，真空包装有探针管的真空包装袋连接缠绕于所述内壳的外层，所述外壳侧壁开设有与所述真空包装有探针管的真空包装袋相对应的抽出孔，实验者可根据需求抽取相应数目的真空袋包装的探针管，所述探针管即包被有基因座特异性捕获探针的微型离心管。
进一步，所述杂交增强剂试管包括管体和与所述管体密封连接的管盖；所述杂交清洗液试剂瓶包括瓶体和与所述瓶体密封连接的瓶盖。
进一步，所述底板与盒体内侧壁的结合方式为固定结合或活动结合。
进一步，所述底板的材质为可回弹、可承托支撑且不易变形的材质。
进一步，所述盒体和底板均采用防水材料或涂有防水材料层。
本发明的优点和积极效果：
本发明利用微型离心管上包被codis包含的多个基因座探针序列，利用dna的碱基互补配对原理，进行特异性的抓捕目的片段，从而对各种检材上极微量的dna进行快速、高效、准确的提取和纯化。本发明确定了稳定有效的dna提取纯化试剂和操作方法，并提供详细的操作流程。
每个基因座探针序列总长度控制在300bp，均一的探针长度使得探针和模板之间结合温度一致，从而提高了各条探针和模板结合的均一性，在杂交捕获温度一致的条件下增加了模板利用率。
附图说明
图1为本发明所述试剂盒的实验方法操作流程；
图2为本发明所述试剂盒dna提取产物str分形图；
图3为本发明所述试剂盒dna提取产物str分形的阴性对照图；
图4为本发明所述试剂盒外包装盒的正面结构示意图；
图5为本发明所述的试剂盒外包装盒的剖面结构示意图；
图6为真空包装有探针管在内的真空包装袋的结构示意图；
图7为杂交增强剂试管的结构示意图；
图8为杂交清洗液试剂瓶的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
一种从低拷贝模板生物检材中提取纯化极微量目的基因座的探针组合，包括针对19个codisstr基因座的特异性捕获探针，其中，所述19个codisstr基因座分别为：d3s1358、fga、d5s818、csf1po、d8s1179、d7s820、th01、vwa、d13s317、d16s539、d18s51、d21s11、d2s1338、d19s433、d1s1656、d12s391、d2s441、d10s1248和dys391；所述针对19个codisstr基因座的特异性捕获探针的序列分别如seqidno.1至idno.14所示；
针对所述d3s1358、d8s1179、d21s11基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.1所示；
seqidno.1：5’-(tcta)m-(tctg)n-3’；
针对所述fga基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.2所示；
seqidno.2：5-(tttc)4ttttttct(cttt)m(ctgt)n(cttt)0(cttc)3-4(cttt)3ctcc(ttcc)4-3’；
针对所述d5s818、csf1po基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.3所示；
seqidno.3：5’-(agat)m-3’；
针对所述d7s820、d16s539基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.4所示；
seqidno.4：5’-(gata)m-3’；
针对所述th01基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.5所示；
seqidno.5：5’-(aatg)m-3’；
针对所述vwa基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.6所示；
seqidno.6：5’-(acta)m-3’；
针对所述d13s317、d2s441基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.7所示；
seqidno.7：5’-(tatc)m-3’；
针对所述d18s51基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.8所示；
seqidno.8：5’-(agaa)m-3’；
针对所述d2s1338基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.9所示；
seqidno.9：5’-(tgcc)m(ttcc)n-3’；
针对所述d19s433基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.10所示；
seqidno.10：5’-(aagg)aaag(aagg)tagg(aagg)m-3’；
针对所述d1s1656基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.11所示；
seqidno.11：5’-(taga)m(tga)0-1(taga)n(tagg)0-1(tg)5-3’；
针对所述d12s391基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.12所示；
seqidno.12：5’-(taga)m(agac)n(agat)0-1-3’；
针对所述d10s1248基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.13所示；
seqidno.13：5’-(ggaa)m-3’；
针对所述dys391基因座的特异性捕获探针的序列如seqidno.14所示；
seqidno.14：5’-(tctg)3(tcta)m-3’；
m和n均为可变数目，每组基因座的特异性捕获探针的序列总长度控制在300bp。
根据重复单位的结构特点，str基因座可分为三种类型：
①简单序列：重复单位长度和碱基组成基本一致。例如d10s1248基因座为(ggaa)8～19，重复单位长度为4个碱基(ggaa)，已报道其重复的次数有8、9……18、19共12个等位基因，每个人只占其中的1种(纯合子)或者两种(杂合子)，不同的人重复单位出现次数不一致，形成人与人之间的差异。
②复合序列：同一基因座内有两种或两种以上的重复序列，且重复单位的长度基本一致。如d12s391基因座重复区结构为(taga)8～17(agac)6～10(agat)0～1；又如d12s391基因座重复区结构为(tgcc)m(ttcc)n，m、n为不确定数目。
③复杂序列：同一基因座内等位基因之间重复序列既有序列差异，也有长度差异。例如d21s11，重复序列为(tcta)/(tctg)，迄今该基因座已报道的等位基因有90余个。
一种微量人源dna样本的提取、纯化试剂盒，包括上述的一种从低拷贝模板生物检材中提取纯化极微量目的基因座的探针组合、包被有基因座特异性捕获探针的微型离心管、杂交增强剂和杂交清洗液；
所述特异性捕获探针的序列seqidno.1至idno.14等比例混合，优选特异性捕获探针的点样浓度为100um；
微型离心管内壁先经过硅烷偶联剂修饰上氨基，再用戊二醛与氨基反应生成醛基；每组基因座的特异性捕获探针序列的5’端经过氨基修饰，溶解点样探针的碳酸钠缓冲液浓度为0.2m，ph＝9.0，利用探针5’端的氨基和微型离心管内壁上醛基的亲核加成反应将探针包被在微型离心管内壁上；
针对不同的检材用常规方法进行dna提取，取少量提取样本加入探针微型离心管中，按总体积比的2％加入杂交增强剂，98℃孵育10min，60℃孵育10min；
根据dna碱基互补配对原理，探针与被捕获的模板杂交在一起，再利用杂交清洗液将未被探针特异捕获的片段冲洗掉。所有str分型的试剂盒引物均是在核心序列侧翼区，且与核心序列不一致，因此，在不用将捕获的模板序列洗脱的条件下，直接在探针管中加入pcr组分进行扩增，使得模板捕获更加方便快捷且增加了模板浓度，因而利用本发明提供的包含有19个codisstr基因座特异性捕获探针的试剂盒可以进行低拷贝模板的抓捕。
上述微量人源dna样本的提取、纯化试剂盒的应用方法：上述微量人源dna样本的提取、纯化试剂盒的应用方法：将待检测的人源dna样本常规方法提取后，应用所述19个codisstr基因座的特异性捕获探针组合进行目的模板的抓捕提取纯化，再应用市售str分型试剂盒进行pcr扩增、基因测序仪分型。能够用于法医个体识别，亲子鉴定，尸源认定过程中遇到的各种检材样本，如对高浓度血迹，精液样本，微量、高度降解、高抑制剂含量的样本dna的提取、纯化，以及对白骨化尸骨、接触性脱落细胞或者土壤中的血液样本dna的提取、纯化。
(1)上述微量人源dna样本的提取、纯化试剂盒的制作流程：
①杂交增强剂，规格为1ml试管包装；
②杂交清洗液，规格为5ml试剂瓶包装；
③包被有基因座特异性捕获探针的微型离心管，规格为0.2ml/50个，分别真空包装袋包装；
④试剂盒能够常温保存。
(2)上述微量人源dna样本的提取、纯化试剂盒的使用方法如下：
①根据实验者需求选取相应数目的探针微型离心管，分别加入98ul常规提取方法获得的dna样本，另取一个微型离心管加入98ul去离子水作为阴性对照；
设置阴性对照证明：“所有str分型的试剂盒引物均是在核心序列侧翼区，且与核心序列碱基不能互补配对，因此，在不用将捕获的模板序列洗脱的条件下，直接在探针管中加入pcr组分进行扩增”，本发明提供的的探针不会作为模板被扩增，引物无法与探针结合。
②每个微型离心管中分别加入2ul(杂交增强剂占总体积2％，如：98ul样本+2ul杂交增强剂)杂交增强剂，在pcr扩增仪中95℃孵育10min，再60℃孵育10min；若常规dna提取样本有剩余，可以再次加入对应的微型离心管中，重复上述步骤；
③弃去所有液体；
④加入100ul杂交清洗液震荡瞬离；
⑤清洗掉多余未结合的杂质后，弃去所有液体。
⑥加入市售str分型试剂盒扩增体系，pcr扩增后用测序仪进行荧光检测str分型。
实际案例操作，2017年9月，在某市郊区发现白骨化人体四肢，且在附近水塘中发现了颅骨，经侦查机关认定是一起碎尸案。该市公安局对该碎尸尸骸进行了dna检验，部分骸骨的str分型结果不够理想，因此全部尸骸无法进行同一认定。发明人受办案机关委托将上述骸骨的长骨及牙齿等检材用本发明实施例提供的基因座探针提取纯化试剂盒，并结合市售str分型试剂盒进行检验，所得到的分型结果完全一致，认定颅骨及四肢骨为同一人体骸骨，因此为案件分析提供了重要的科学证据。
上述微量人源dna样本的提取、纯化试剂盒的外包装盒，如图3-7所示，包括盒体和底板，所述盒体包括内壳3和外壳5，所述内壳3和外壳5均为圆柱体，所述底板与所述盒体内壁底部相结合，所述内壳3包括内层和外层，所述内壳内层填充有乳胶海绵或泡沫，所述乳胶海绵或泡沫上开设有放置杂交增强剂试管的插孔1和放置杂交清洗液试剂瓶的凹槽2，所述插孔1和所述凹槽2的开口位于所述内壳3的上端面上，便于杂交增强剂试管和杂交清洗液试剂瓶的取装，所述底板上设有与所述内壳外层底部相对应的轨道6，所述内壳外层能够在所述轨道6上旋转，真空包装有探针管的真空包装袋连接缠绕于所述内壳3的外层，所述外壳5侧壁开设有与所述真空包装有探针管的真空包装袋相对应的抽出孔4，实验者可根据需求抽取相应数目的真空袋包装的探针管7，所述探针管即包被有基因座特异性捕获探针的微型离心管。
所述杂交增强剂试管包括管体和与所述管体密封连接的管盖；所述杂交清洗液试剂瓶包括瓶体和与所述瓶体密封连接的瓶盖。
所述底板与盒体内侧壁的结合方式为固定结合或活动结合。
所述底板的材质为橡胶。
所述盒体和底板均采用防水材料或涂有防水材料层。
上述实施例仅是本发明的较优实施方式，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修饰、修改及替代变化，均属于本发明技术方案的范围内。