一种具有复合生物活性的抗菌肽及其制备方法与应用与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种拟穴青蟹来源具有复合生物活性的抗菌肽及其制备方法与应用。

背景技术：

在先天免疫的基础上，脊椎动物进化出了可以不断丰富的获得性免疫系统。这种免疫方式的出现，使得生物体在进化过程中具有了更广泛的免疫形式，同时从被动防御型的免疫方式转化成为了主动的免疫方式。然而，对于无脊椎动物来说，先天免疫系统是它们防御细菌、病毒、寄生虫等病原微生物侵染的唯一免疫防御形式，这个系统主要包括细胞免疫与体液免疫两种类型。细胞免疫主要涉及到结节的形成、包囊作用、细胞吞噬作用三种类型。体液免疫主要包括抗菌肽的形成与黑化作用。其中，抗菌肽分子被认为是一类重要的能够针对细菌和真菌的入侵，发挥免疫效应的蛋白质分子。目前，发现的抗菌肽分子种类较多，其中有一类分子的结构比较典型，在其氨基酸序列中存在着一个乳清酸性蛋白结构域(wapdomain)，这个结构域的特点是存在着由8个半胱氨酸残基形成的4对二硫键。根据分子中存在的wap结构域的个数，人为地将其分为具有单个wap结构域的抗菌肽分子(swd)和具有双wap结构域的抗菌肽分子(dwd)。

多数抗菌肽分子不仅可以在甲壳类动物体内发挥清除细菌、真菌的作用，也可以在体外行使抗细菌、除真菌的功能。因此，将甲壳类动物内源性的抗菌肽基因进行体外大量表达与纯化之后，这些蛋白质在家畜青储饲料的防霉抗菌、家畜颗粒状饲料的防霉抗菌、假牙的清洁、隐形眼镜的除菌清洁、图书馆典藏珍贵书籍的防霉抗菌等方面，会具有非常广阔的应用前景，它们可以成为良好的绿色无污染的抗菌添加剂。需要指出的是，抗菌肽与目前广泛使用的抗生素、化工类的抗菌剂有着很大的区别：(1)源于甲壳类动物的抗菌肽分子发挥抗菌作用的同时，不会引起耐药性问题，因为抗菌肽分子发挥作用的过程是直接作用于细菌、真菌的细胞壁，从而引起细菌、真菌细胞壁某一部位的水解产生漏洞而引起细菌、真菌细胞的内溶物外泄，使其死亡而被清除，这类抗菌肽分子在医药行业也存在较大的应用前景。(2)源于甲壳类动物的抗菌肽分子发挥抗菌作用的同时，不会造成环境污染，这类抗菌肽分子在家畜养殖业的饲料储存方面、假牙的清洗和隐形眼镜的消毒方面、珍贵古老图书的收藏方面、水果蔬菜远距离运输过程的抗菌除霉方面存在较大的应用前景。

拟穴青蟹属于甲壳纲、十足目、青蟹属，是一种重要的水产经济养殖动物，在我国东南沿海养殖规模较为广泛。在过去的20年间，拟穴青蟹的养殖过程被白斑综合症病毒和弧菌以及其他一些细菌的侵染所困扰，细菌与病毒对于拟穴青蟹的感染给相关养殖行业带来了较大的经济损失。同时，一些科学研究结果也显示：拟穴青蟹在受到细菌或者白斑综合症病毒刺激的情况下，体内的crustin抗菌肽基因在mrna和蛋白质水平都会被显著的上调表达，来对抗细菌或者病毒的侵染，说明拟穴青蟹crustin抗菌肽是一类重要的内源性抗菌以及抗病毒效应分子。因此，深入研究拟穴青蟹的crustin抗菌肽基因对于进一步完善无脊椎动物先天免疫系统的基础理论有重要的意义之外，还可以为其在家畜养殖业饲料储存过程的抗菌除霉、人造假牙的清洗除菌和隐形眼镜的消毒除菌方面、珍贵古老图书收藏过程的防霉除菌方面，水果、蔬菜远距离运输过程的抗菌除霉等方面的具体应用，开发出具有良好前景的绿色无污染的抗菌除霉生物活性添加剂。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一种来源于拟穴青蟹(scyllaparamamosain)新的具有复合生物活性的抗菌肽。本发明的另一目的在于提供所述抗菌肽的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述抗菌肽的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种来源于拟穴青蟹新的具有复合生物活性的抗菌肽，命名为sp-crustin6，其氨基酸序列如seqidno.1所示，具有113个氨基酸残基。

进一步地，拟穴青蟹体内，编码上述抗菌肽的核苷酸序列如seqidno.2所示，长342bp。

一种上述抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)以提取的拟穴青蟹总rna作为模板，以5’-ctgggaagaaatgacatg-3’作为反转录引物进行反转录pcr得到cdna。

(2)以cdna作为模板进行pcr扩增获得含上述抗菌肽编码序列的核苷酸片段，pcr扩增引物如下：

f：5′-nngggaggcctagtccttct-3′，

r：5′-nnctatgggtcagcaagcag-3′，

其中，nn由保护碱基和限制性内切酶酶切位点组成，n表示任意碱基，n为自然数，可根据相应的表达载体进行调整。

(3)步骤(2)的扩增产物与表达载体通过酶切、连接、转化，构建可表达重组抗菌肽的大肠杆菌工程菌。

(4)步骤(3)构建的大肠杆菌工程菌通过诱导培养，表达出重组抗菌肽。

本发明对重组抗菌肽与常见病原菌进行了结合实验、液体抑菌实验，以及与白斑综合症病毒(wssv)囊膜蛋白vp26结合实验、体内抑制wssv增殖实验，结果显示本发明的抗菌肽具有良好的抑菌、抗病毒活性。因此，本发明的抗菌肽可用于制备抑菌剂或抗病毒剂。

一种抑菌剂或抗病毒剂，包含本发明的抗菌肽。

本发明的优点和有益效果：本发明的抗菌肽具有良好的凝集细菌、结合细菌、抑制细菌、抑制真菌、抑制wssv病毒增殖的活性，在家畜养殖业饲料储存过程的抗菌除霉，人造假牙的清洗除菌和隐形眼镜的消毒除菌方面，珍贵古老图书收藏过程的防霉除菌方面，水果、蔬菜远距离运输过程的抗菌除霉等方面有着良好的应用前景。

附图说明

图1是sds-page检测重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6诱导表达与亲和纯化的结果图。泳道1是诱导前大肠杆菌的菌体总蛋白质，泳道2是iptg诱导后的大肠杆菌的菌体总蛋白质，泳道3是纯化后的rsp-crustin6重组蛋白质，泳道m是标准的蛋白质分子量。

图2是重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6与常见病原菌结合实验的结果图。

图3是重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6与wssv囊膜蛋白vp2的结合实验结果，a为rsp-crustin6的结果，b为gst的结果。

图4是重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6对wssv的活体抑制试验结果图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1拟穴青蟹抗菌肽基因sp-crustin6的克隆、重组表达与纯化

本发明的具有复合生物活性的抗菌肽sp-crustin6，其氨基酸序列如seqidno.1所示；编码抗菌肽sp-crustin6的核苷酸序列如seqidno.2所示。按照下述步骤对抗菌肽sp-crustin6进行重组表达和纯化。

(1)利用动物总rna提取试剂盒提取拟穴青蟹肌肉、肝胰腺、鳃、肠、眼柄5种等质量组织的混合组织样品的总rna，获得拟穴青蟹混合组织的总rna样品。

(2)以步骤(1)获得的拟穴青蟹总rna样品作为模板，以特异引物5’-ctgggaagaaatgacatg-3’作为反转录合成反应的后引物，利用一步法rt-pcr扩增试剂盒进行cdna的反转录合成，获得拟穴青蟹混合组织样品的cdna样品。

(3)设计扩增拟穴青蟹抗菌肽基因sp-crustin6编码区表达片段(成熟肽)的前后引物sp-crustin6-f和sp-crustin6-r：

sp-crustin6-f：5′-tactcagaattcgggaggcctagtccttct-3′，

sp-crustin6-r：5′-tactcactcgagctatgggtcagcaagcag-3′。

以步骤(2)中的拟穴青蟹混合组织的cdna样品作为模板，进行梯度pcr扩增反应，反应的程序为：98℃预变性5min，第一扩增梯度：98℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸30s，循环10圈；第二扩增梯度：98℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，循环15圈；第三扩增梯度：98℃变性30s，59℃退火45s，72℃延伸30s，循环10圈；后延伸5min，获得pcr扩增反应产物。

(4)将步骤(3)获得的pcr扩增反应产物进行回收以及纯化，之后进行ecorⅰ核酸内切酶和xhoⅰ核酸内切酶的双酶切处理，并且与经过ecorⅰ核酸内切酶和xhoⅰ核酸内切酶双酶切处理的大肠杆菌pgex-4t-1质粒载体连接，转化大肠杆菌bl21表达菌株感受态细胞之后，利用sp-crustin6-f和sp-crustin6-r引物进行菌落pcr反应筛选目的基因的阳性表达菌株，将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行目的基因的序列验证。

(5)将步骤(4)获得的目的基因阳性表达菌株进行iptg浓度梯度复合温度梯度式的诱导表达，方法如下：将目的基因阳性表达菌株接入到装有300ml液体lb培养基的1000ml三角瓶中，在37℃、180rpm条件下，摇床避光转培养4.5h，之后，加入终浓度为0.1mm的iptg，在28℃、180rpm条件下继续摇床避光培养6h，之后，调整iptg终浓度为0.3mm，28℃、180rpm条件下摇床避光继续培养5h，之后，调整iptg终浓度为0.5mm，37℃、180rpm条件下摇床避光继续培养4h，之后，6000rpm条件下离心收集菌体。

(6)将步骤(5)获得的菌体进行不同低温复合超声波的方式进行菌体破碎，首先对菌体进行-20℃条件下的冷冻处理30min，之后在-40℃条件下的冷冻处理50min，之后，利用超声波破碎仪进行细菌菌体破碎，之后，在10000rpm条件下离心收集破碎后的沉淀。

(7)将步骤(6)获得的破碎后的沉淀，利用30ml变性液(0.15mtris-hcl，5mmdtt，6m脲，ph7.5)，在37℃、180rpm条件下摇床避光震荡2.5h，之后，在12000rpm条件下离心收集上清液，并且，利用截留能力为3.5kda的透析袋进行过夜12h、4℃低温透析处理，透析液配方为0.15mtris-hcl，10mmcysteins，ph7.5。

(8)将步骤(7)透析完毕的液体，进行10000rpm条件下的离心处理，并且收集上清液，即为目的重组蛋白质的变性-复性液，并且，利用预装5ml的gst-tag凝胶柱进行纯化，首先，用30ml1×pbs缓冲液冲洗gst-tag凝胶柱1次，之后，将获得的目的重组蛋白质的变性-复性液25ml缓慢流通gst-tag凝胶柱3次，再用，25ml洗脱液(20mm还原型谷胱甘肽，30mmtris-hcl，ph7.5)洗脱柱子，并且收集洗脱液，利用截留能力为3.5kda的透析袋在1×pbs缓冲液中进行4℃低温12h透析处理，次日，利用聚乙二醇8000进行浓缩处理，使目的重组蛋白的终浓度为200μg·ml^-1。

重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6的诱导表达与亲和纯化结果见图1。图1显示，利用iptg进行诱导之后，与诱导前相比较，目的重组蛋白被大量表达，利用gst-tag凝胶柱纯化目的蛋白质之后，可以获得组分单一的目的蛋白质，而且，目的重组蛋白质的电泳条带位置位于标准蛋白质分子量40kda附近，与理论预测值39.4kda一致，表明成功表达出目的重组蛋白。

实施例2重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6的细菌结合作用

将实施例1获得的浓度为200μg·ml^-1的目的重组蛋白rsp-crustin6溶液进行常见病原菌的结合实验，首先，分别将200μl过夜培养的菌液(分别为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、白色念珠菌、毕赤酵母)，与200μl浓度为200μg·ml^-1的目的重组蛋白溶液，在37℃、180rpm条件下摇床避光震荡孵育1.5h，之后，6000rpm条件下室温离心收集菌体，用1×pbs缓冲液反复洗涤3次，每次洗涤5min，再用7％sds溶液洗涤菌体5min，之后，菌体沉淀再用500μl1×pbs缓冲液洗涤1次，6000rpm条件下室温离心分别收集菌体沉淀与洗脱液，分别作为样品进行sds-page，转膜之后，进行westernblot实验，利用抗gst-tag的抗体检测重组目的蛋白质的有无，确定重组蛋白质结合菌体的活性。

试验结果(图2)显示：重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6可以十分强烈地与枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌结合，可以较弱地与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、毕赤酵母结合。

实施例3重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6的液体抑菌作用

将实施例1获得的浓度为200μg·ml^-1的目的重组蛋白rsp-crustin6溶液进行常见病原菌的液体抑菌实验，首先金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、藤黄微球菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、毕赤酵母作为病原菌进行常规过夜培养，次日，将利用1×pbs缓冲液进行2倍梯度稀释的100μl的重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6蛋白质溶液分别与100μl目标病原菌菌液混合后，置于清洁的一次性96孔酶标板的点样孔之中进行孵育，同时，gst蛋白作为对照组，并且，每一个点样孔中再加入100μl液体pb培养基(1％胰蛋白胨，质量体积比为0.5％的nacl，ph为7.5)。之后，28℃条件下，静置培养24h之后，期间，利用分光光度计600nm波长测定各个细菌混合液中病原菌的生长情况，确定目的重组蛋白质对各种病原菌的最小抑菌浓度。

试验结果显示：重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6可以有效地抑制金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的生长繁殖，对于溶藻弧菌、副溶血性弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌、毕赤酵母的生长繁殖也有一定程度的抑制作用(表1)。

表1重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6对不同病原菌的最小抑菌浓度

实施例4重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6与白斑综合症病毒(wssv)囊膜蛋白vp26的结合作用

将实施例1获得的浓度为200μg·ml^-1的目的重组蛋白rsp-crustin6(带有gst标签)，与利用大肠杆菌原核表达系统表达的、带有his-tag标签的白斑综合症病毒(wssv)囊膜蛋白质vp26作为实验样品(该重组蛋白的浓度调整为200μg·ml^-1)，进行蛋白质互作的研究。首先，取质量体积浓度为50％的glutathione-sepharose4b凝胶150μl(1×pbs保存)，用1×pbs缓冲液冲洗3次，之后与上述75μlrsp-crustin6蛋白质透析液(带有gst-tag)以及75μl重组蛋白vp26透析液(带有his-tag)，在4℃条件下孵育2h，同时，浓度为200μg·ml^-1的谷胱甘肽转移酶(gst)作为对照样品进行处理。孵育结束后，将实验组、对照组混合样品用1×pbs缓冲液冲洗4次，并且，取最后一次洗涤液作为样品留存(wash样品)；最后，实验组、对照组混合样品分别用含有10mm还原性谷胱甘肽的100μl1×pbs缓冲液洗脱1次，6000rpm低速离心之后收集洗脱液，作为12.5％的sds-page实验的蛋白质样品(elution样品)进行电泳以及染色、脱色处理。

试验结果(图3)显示：与gst对照组相比较，重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6可以与wssv囊膜蛋白vp26结合，具有一定的抑制病毒增殖的潜在作用。

实施例5重组拟穴青蟹抗菌肽rsp-crustin6对白斑综合症病毒(wssv)在螃蟹体内增殖的抑制作用

将实施例1获得的浓度为200μg·ml^-1的目的重组蛋白rsp-crustin6与浓度为200μg·ml^-1的谷胱甘肽转移酶(gst)作为两组试验样品，进行拟穴青蟹活体白斑综合症病毒(wssv)体内增殖的抑制试验，具体方法如下：取活力好、平均体重为100g的拟穴青蟹36只，并且平均、随机分为两组，将重组蛋白rsp-crustin6与白斑综合症病毒在4℃条件下孵育15min之后作为第一组螃蟹的注射样品，将谷胱甘肽转移酶(gst)与白斑综合症病毒在4℃条件下孵育15min之后作为第二组螃蟹的注射样品。孵育结束之后，将两组注射样品分别从每组螃蟹的右侧第五条腿的根部进行注射，使每只螃蟹的wssv注射量为10⁵个病毒粒子，之后开始计时，在注射后的0、24、36、48、72、96h作为取样点，每组螃蟹随机选取3只，取其鳃部组织并且混合。利用动物组织dna提取试剂盒对每个取样时间点的鳃组织混合样品提取基因组dna，作为扩增wssv病毒vp26基因序列的模版，主要是利用qrt-pcr的试验方法分析蛋白与病毒混合后注射进入活体拟穴青蟹体内之后的增殖情况，qrt-pcr试验的前、后引物为f：5’-ccaaccaacacgtaaagga-3’，r：5’-gagtattgtaggacctctc-3’，qrt-pcr反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火50s，60-95℃按照每秒升高0.5℃的方式延伸，共计循环40次；之后4℃保存。之后，将本次qrt-pcr试验扩增的vp26基因的序列与pet-28-a质粒载体重组连接，测定其质粒dna的浓度之后，进行10倍稀释(10²-10⁷梯度稀释)作为标准对照样品，进行上述qrt-pcr试验，通过比较分析，计算出蛋白与病毒混合后注射进入活体拟穴青蟹体内之后，在每个取样时间点上的病毒粒子数量。

实验结果(图4)显示：与gst对照蛋白质相比较，重组蛋白rsp-crustin6与wssv混合孵育、注射进入拟穴青蟹之后，在0、24、36、48、72、96h时间点上，wssv在螃蟹体内的增殖速度明显降低，说明重组蛋白rsp-crustin6具有良好的抑制病毒增殖的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>内蒙古科技大学

<120>一种具有复合生物活性的抗菌肽及其制备方法与应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>113

<212>prt

<213>scyllaparamamosain

<400>1

metleuargilevalthrvalalavalvalvalleuvalvalvalmet

151015

aspalaglualaglyargproserproserprosercysargsertrp

202530

cyslysargproglyhisproglulysasnalaphetyrcyscysasp

354045

pheglyileglythrvalglylysprophealathrhisproglylys

505560

cysprohisargproilecysprogluglyleutyrthrargglypro

65707580

alaprothrvalcysalahisaspglyglncysserlyshisglulys

859095

cyscysalaaspalacysleugluhishisthrcysleuleualaasp

100105110

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<210>2

<211>342

<212>dna

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<400>2

atgcttcgcattgtgactgtcgccgtcgtggtgcttgtggtggtgatggatgctgaggct60

gggaggcctagtccttctccaagctgcaggagctggtgcaaaaggcctggacaccctgaa120

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gctcccacggtatgtgctcacgacggccagtgctccaagcacgagaagtgctgtgctgat300

gcctgccttgaacaccacacctgtctgcttgctgacccatag342

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctgggaagaaatgacatg18

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tactcagaattcgggaggcctagtccttct30

<210>5

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

tactcactcgagctatgggtcagcaagcag30