植物衰老相关蛋白及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及一种植物衰老相关蛋白及其编码基因和应用。
背景技术：
：衰老是植物发育不可分割的一部分，是发育的最后阶段。在衰老过程中，叶片细胞在结构、代谢、基因表达方面发生高度协调的变化。细胞结构最早、最明显的变化是叶绿体分解。代谢方面，碳代谢(光合作用)被叶绿体和大分子物质物质如蛋白质、膜脂、rna等的分解代谢所取代。在分子水平上，上述变化伴随着基因表达的变化。衰老是细胞程序化死亡。叶片衰老在营养元素的循环和再利用等生理活动中起着重要作用。衰老引起的叶片同化功能减退限制了作物产量的发挥。技术实现要素：本发明的目的是提供一种植物衰老相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供了一种蛋白质，来源于谷子(setariaitalical.)，具体为豫谷一号，所述蛋白质为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；(a2)在(a1)所述蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；(a3)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物衰老相关的蛋白质；(a4)来源于谷子且与(a1)具有98％以上同一性且与植物衰老相关的蛋白质。标签具体如表1所示。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedlha9ypydvpdya蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述核酸分子具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)：(b1)编码区如序列表中序列2第217-1317位核苷酸所示的dna分子；(b2)编码区如序列表中序列2第217-1320位核苷酸所示的dna分子；(b3)序列表中序列2所示的dna分子；(b4)来源于谷子且与(b1)或(b2)或(b3)具有95％以上同一性且编码所述蛋白质的dna分子；(b5)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子。所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物均属于本发明的保护范围。可用现有的表达载体构建含有所述核酸分子的重组表达载体。使用所述核酸分子构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述核酸分子构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物或转基因微生物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物或微生物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物或微生物。所述重组载体具体可为重组表达载体。所述重组表达载体具体可为在pcambia2300载体的多克隆位点(例如bamhi和xbai酶切位点之间)插入序列表的序列2第217-1317位核苷酸所示的dna分子得到的重组质粒。本发明还保护所述蛋白质的应用，为如下(c1)或(c2)：(c1)调控植物衰老进程；(c2)抑制植物衰老进程。本发明还保护所述核酸分子的应用，为如下(d1)或(d2)：(d1)培育衰老性状改变的转基因植物；(d2)培育衰老进程延缓的转基因植物。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入所述核酸分子，得到衰老进程延缓的转基因植物。所述核酸分子具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植物。携带有所述核酸分子的重组表达载体可通过ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到出发植物中。本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中所述蛋白质的含量和/或活性，从而延缓目的植物的衰老进程。本发明还保护以上任一所述方法在植物育种中的应用。所述植物育种的目标为获得衰老延缓的植物。以上任一所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为狗尾草属植物。所述狗尾草属植物可为谷子。所述双子叶植物可为拟南芥属植物。所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。本发明对于植物衰老机制的研究具有重大的理论价值，对于培育衰老延迟植物具有重大的应用价值。附图说明图1为表型的示例性照片。图2为叶绿素相对含量及离子渗透率的测定结果。图3为衰老标志性基因的相对表达水平。图4为dab染色的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。所有的实验均做3次生物学重复，数据进行t检验(student’st-test)分析，“**”代表“p﹤0.01”，“***”代表“p﹤0.001”。从豫谷一号(现有的谷子品种)中发现一个蛋白质，如序列表的序列1所示。豫谷一号的cdna中该蛋白质的编码框如序列表的序列2第217-1320位核苷酸所示。实施例、转基因植物的获得和鉴定一、重组表达载体的构建1、取豫谷一号的叶片，提取rna并反转录得到cdna。2、以步骤1得到的cdna为模板，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物。f1：5’-ggatccatggagcacgacgtgca-3’；r1：5’-tctagagtagccccaaagggaggctg-3’。3、取pcambia2300载体，用限制性内切酶bamhi和xbai进行双酶切，回收载体骨架。4、取步骤2得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶bamhi和xbai进行双酶切，回收酶切产物。5、将步骤4的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在pcambia2300载体的bamhi和xbai酶切位点之间插入了序列表的序列2第217-1317位核苷酸所示的dna分子。二、转基因植物的获得1、将步骤一得到的重组质粒导入农杆菌gv3101，得到重组农杆菌。2、用含10％蔗糖和0.02％silwet的水溶液悬浮步骤1得到的重组农杆菌，得到od600nm约为1.0的菌悬液，即为侵染液。3、将哥伦比亚生态型拟南芥植株倒扣在盛有侵染液的容器中，使包括花在内的整个地上部分完全浸没持续5-6min，然后取出植株并抖水；然后将植株水平横放并用黑色袋子覆盖避光保温，22℃光照培养16-36h；然后揭除黑色袋子，将植株重新竖直，22℃光照培养，收获种子，即为t1代种子，t1代种子长成的植株即为t1代植株。t1代植株自交并收获种子，即为t2代种子，t2代种子长成的植株即为t2代植株。t2代植株自交并收获种子，即为t3代种子，t3代种子长成的植株即为t3代植株。4、pcr鉴定t1代植株、t2代植株和抽样的t3代植株进行pcr鉴定。pcr鉴定的方法：提取叶片的基因组dna，将基因组dna作为模板进行pcr扩增(引物：5’-atggagcacgacgtgca-3’；5’-gtagccccaaagggaggctg-3’)，如果得到约1101bp的扩增产物，pcr鉴定结果为阳性，否则pcr鉴定结果为阴性。对于某一t1代植株来说，如果满足如下两个条件，该t1代植株即为单拷贝插入的转基因植株：①该t1代植株pcr鉴定结果为阳性；②该t1代植株自交得到的t2代植株的pcr鉴定结果显示，阳性植株与阴性植株的数量比基本符合3:1。对于某一t2代植株来说，如果满足如下三个条件，该t2代植株及其自交后代为一个纯合的转基因株系：①该t2代植株pcr鉴定结果为阳性；②其t1代植株为单拷贝插入的转基因植株；③其抽样检测的t3代植株pcr鉴定结果均为阳性。三、转空载体植物的获得用pcambia2300载体代替重组质粒，按照步骤二操作，得到转空载体株系。四、性状鉴定从步骤三得到的纯合的转基因株系中随机选三个株系(oe3株系、oe9株系、oe11株系)进行性状鉴定。供试植株：oe3株系的t3代植株、oe9株系的t3代植株、oe11株系的t3代植株、转空载体株系的的t3代植株和哥伦比亚生态型拟南芥植株。哥伦比亚生态型拟南芥植株用col表示。将具有两片子叶的幼苗移栽至培养基质(蛭石和营养土等体积混合得到培养基质)中，在22℃、16小时光照/8小时黑暗的条件下培养6周，然后观察表型。示例性照片见图1。哥伦比亚生态型拟南芥和转空载体株系的植株均可以观察到大量衰老叶片，三个转基因株系的植株基本观察不到衰老叶片。结果表明，转基因植株表现出晚衰表型。完成培养后，各植株取同一部位的叶片，进行叶绿素相对含量及离子渗透率的测定(方法参见文献：involvementofnactranscriptionfactorsinac1inapositivefeedbackloopviaababiosynthesisandleafsenescenceinfoxtailmillet)。结果见图2。转空载体株系的植株的叶绿素相对含量以及离子渗透率均与哥伦比亚生态型拟南芥无显著差异。三个转基因株系的植株的叶绿素相对含量显著高于哥伦比亚生态型拟南芥。三个转基因株系的植株的离子渗透率显著低于哥伦比亚生态型拟南芥。完成培养后，各植株取同一部位的叶片，采用实时定量pcr检测衰老标志性基因(sag4基因、sag13基因、rbcs基因和cab1基因)的水平。用于检测sag4基因的引物如下：p410-sen4-5'：cttactcaatcctctggaac；p411-sen4-3'：ctatgagcttgttgtgcatt。用于检测sag13基因的引物如下：p408-sag13-5'：gcaaccaaaggagccatg；p409-sag13-3'：gtttggccaactagtctgc。用于检测rbcs基因的引物如下：p1046-atrbcs-1a-qrt-f：gcatgcaggtgtggcctc；p1047-atrbcs-1a-qrt-r：cttagccaattcggaatcggt。用于检测cab1基因的引物如下：p1050-atcab1-qrt-f：tgtgctgcactactcaacct；p1051-atcab1-qrt-r：tccaaggacttcagatgccg。用于检测内参基因的引物如下：p1054-atubq-qrt-f：caaatccaaaaccctagaaaccgaa；p1055-atubq-qrt-r：atctcccgtaggacctgcactg。结果见图3。完成培养后，各植株取同一部位叶片，利用dab染色指示过氧化氢含量。照片见图4。哥伦比亚生态型拟南芥叶片和转空载体株系植株的叶片染色后表型一致。衰老进程促进植物体内过氧化氢积累，染色后三个转基因株系过氧化氢含量均显著低于哥伦比亚生态型拟南芥，说明转基因株系衰老进程滞后。上述结果表明，序列表的序列1所示的蛋白可以延缓植物叶片衰老，对叶片衰老起负调节作用。sequencelisting<110>河北师范大学河北省农林科学院遗传生理研究所（河北省农林科学院农产品质量安全研究中心）<120>植物衰老相关蛋白及其编码基因和应用<130>gncyx182263<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>367<212>prt<213>setariaitalical.<400>1metgluhisaspvalhishishisglnleuleuglnglnglnglnthr151015metgluleuproproglypheargphehisprothraspglugluleu202530ilethrhistyrleuthrarglysalaalaaspproargphealapro354045argalavalglyglualaaspleuasnlyscysgluprotrpaspleu505560proalaargalathrmetglyglulysglutrptyrphephecysval65707580lysasparglystyrprothrglyleuargthrasnargalathrglu859095serglytyrtrplysalathrglylysasparggluilephearggly100105110lysalaleuvalglymetlyslysthrleuvalphetyrthrglyarg115120125alaproargglyglylysthrglytrpvalmethisglutyrargleu130135140aspglylyshisalaglythrserasnargserserleuileproser145150155160ileargalaglyalaserlysaspglutrpvalleucysargvalphe165170175lyslysserilegluproproleuvalalaalaglyglylysargser180185190serglyprocysvalgluvalalaaspvalvalglyprosersermet195200205sermetalaaspaspleualaalacysalaleuproproleumetasp210215220valserglyglyserglyglyglyalametserleuseralavalala225230235240glyilegluleuproproproalaglnhisvalthrcyspheserasn245250255alaleuglnglyglnpheleuasnpropropheleuleuproserala260265270glyproalaalaalaalaasphishisleualametalaserserala275280285serpropheleualasermetmetglnalaalaglntyraspglyala290295300alaglyvalglyglymetvalhisgluleuleuglngluglyglygly305310315320trptyrserlysleuglygluarggluargleuserglyglyglygly325330335alaserglnaspthrglyleuthrsergluvalasnproglygluile340345350serserargglnhismetasphisalaalaserleutrpglytyr355360365<210>2<211>1578<212>dna<213>setariaitalical.<400>2atccgcactgttctgatggtgctacctgtgatatcccctctgtttctttatgtgctcgcc60atattgtgctgcatcgatgcagtttcttgcagcctttctttcgttgttgcttgttcgatt120tggttcctgattattgaagtgcttgctctagctagataagctgtgatcaaaccgagggtt180tagacggcgatccttagctcactggccaggcaggagatggagcacgacgtgcaccaccac240cagctgctgcagcagcagcagaccatggagctccctccggggttccggttccaccccacc300gacgaggagctcatcacgcactacctcaccaggaaggccgccgacccccgcttcgccccg360cgcgccgtcggcgaggccgacctcaacaagtgcgagccatgggacctgcccgctcgggcg420acgatgggggagaaggagtggtacttcttctgcgtcaaggaccgcaagtacccgacgggg480ctgaggacgaaccgggccaccgagtccggctactggaaggcgacgggcaaggaccgggag540atcttcaggggcaaagccctcgtcggcatgaagaagacgctcgtcttctacacggggagg600gcacccaggggaggcaagaccggctgggtcatgcacgagtaccgcctcgacggcaagcac660gccggcaccagcaacaggagcagcctcatcccctcgatcagagctggcgcgtcaaaggac720gagtgggtgctgtgcagggtgttcaagaagagcatcgagccgccgttggtggctgctggc780ggcaagaggtcgtcgggcccatgcgtggaggtggcggacgtcgtggggccgtcgtccatg840tccatggcggacgacctcgccgcgtgcgcgctgcctccgctgatggacgtgtccggtggc900agcggcggcggcgccatgtcgctttctgcggtggcgggtattgagctgccgccaccggca960caacacgtgacctgcttctccaacgcgctgcagggccagttcctgaacccacccttcctg1020ctcccctccgccggccccgcggcggccgcggaccaccacctcgccatggcgtcctccgcc1080tcgccgttcctggcgagcatgatgcaggcggcgcagtacgacggcgccgcgggcgtgggc1140ggcatggtgcatgagctcctgcaggagggcggcgggtggtacagcaagctgggagagagg1200gagcggctgagcggtggcggcggcgcgtcgcaggacaccggcctcacctcggaggtgaac1260cccggcgagatctcgtcgcggcagcacatggatcacgcagcctccctttggggctactga1320gctcgatctcttgatggatcatcattaagaattgaattagtattagttactggattggga1380accgggattattgttgtattgtagtgcaattggatgttgtcatgcaaaagggaaagaagt1440tgtgagcaatcagcaatgtatagtactgtagtctactagatcgatttggtttggagttgc1500tactgtaatgggagtactgttgtgtgacagccggaaaggtctattttggaacgcggaaat1560tctatggtaacctcgcaa1578当前第1页12