一种用于检测银离子的荧光探针及其制备方法与应用与流程

本发明涉及分析化学中荧光探针传感技术领域，尤其涉及一种用于检测银离子的荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

银离子及其化合物已经被广泛应用于各个领域，由于银离子及其化合物可以使微生物窒息而死亡，对某些细菌、病毒、藻类及真菌显出毒性。过量的银离子能引起水及其它环境污染，因此，它也是最危险的金属污染物之一。银离能诱导不同类型细胞病变，例如人齿银纤维母细胞、角质细胞、人体组织肥大细胞等。过量的摄入银会对人体产生危害。银离子可在人体内生物聚集而产生毒性，它能与许多生理代谢物质如胺、咪唑和羧酸等活性基团及非活性的巯基酶发生相互作用。因此，我国对生活用水规定银离子的限值为0.05mgl-1。因此，发展简单高效快速的银离子检测方法，实现对生活用水、环境和生物样品中微量ag+含量的准确检测具有重要的意义。银离子或银盐被人体吸收后会在皮肤、眼睛及粘膜沉着，产生病变，危害人体健康。因此，快速、高灵敏度、抗干扰性强的银离子的检测方法对生物医药和环境保护都至关重要。

传统的银离子的分析方法有试纸法、原子吸收法、电化学法和电位滴定等，这些方法中大多存在耗时，操作繁琐，容易受其他离子干扰等问题。荧光探针检测法以其检测简便快捷，响应时间短，灵敏度高和抗干扰能力强等倍受人们的关注。虽然报道了一些用于检测银离子的荧光探针，但由于它们存在灵敏度低，抗干扰能力差，响应慢，并且大多以蓝光和短波发射为主，背景干扰和对组织损伤作用大等弊端影响了其实际应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种用于检测银离子的荧光探针及其制备方法与应用，制备得到的荧光探针为基于苝酰亚胺的可视化检测银离子的荧光探针，使用方便、灵敏度高、抗干扰能力强、响应快。

本发明是这样实现的：

本发明目的之一在于提供一种用于检测银离子的荧光探针，我们将其命名为pdi-ad，其分子式为c134h114n18o16，其结构式如下：

本发明的目的之二在于提供一种用于检测银离子的荧光探针的制备方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1、化合物an-boc的制备：乙二胺连上保护基boc酸酐后，与丙烯酸甲酯的双建发生迈克尔加成反应和酰胺化缩合反应生成化合物an-boc；

步骤2、化合物nb-a的制备：化合物pd(oac)2,邻甲基三苯基膦，磷酸钾，2-乙烯基吡啶，和4-溴-1,8-萘酸酐的dmf溶液加热回流制得化合物nb-a；

步骤3、化合物nb-3的制备：将步骤1所得化合物an-boc和步骤2所得的化合物nb-a溶解在无水乙醇中加热回流反应至完全得到化合物nb-2，向溶解有化合物nb-2的二氯甲烷溶液中滴加三氟乙酸至反应完全得到化合物nb-3；

步骤4、化合物pdi-a的制备：将溶解有1,7-二溴苝酐-3,4:9,10-二(二酸酐)，六氢哌啶，碳酸钾dmf加热反应至完全得到化合物pdi-a；

步骤5、将步骤3所得的化合物nb-3和步骤4所得的化合物pdi-a以及三乙胺溶解在dmf中至反应完全，即得该用于检测银离子的荧光探针pdi-ad。

本发明的目的之三在于提供所述荧光探针在检测银离子中的应用，该荧光探针pdi-ad在加入银离子前后伴随着明显的颜色变化，即由深绿色变为浅绿色，从而实现对银离子的可视化检测。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1、本发明提供的一种用于检测银离子的荧光探针，探针对银离子检测简单快捷，且具有分子内荧光共振能量转移现象，使得其在生物和环境领域具有广阔的应用前景，其检测原理如图2所示，荧光显著增强(约增强8倍)，伴有分子内荧光共振能量转移现象(荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体donor)的发射光谱与另一个基团(受体acceptor)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光)，这里银离子作为供体，萘酰亚胺单元中心的苝酰亚胺基团作为受体，400nm激发萘酰亚胺单元时中心苝酰亚胺的发射强度比采用其最大吸收672nm激发的发射强度增强了近3倍，此探针为荧光“关-开”型响应，抗干扰能力强，检测灵敏度高。

2、本发明提供的一种用于检测银离子的荧光探针，该探针中心识别基团发射波长为750nm处，是近红外发射探针，有利于应用在生物显微成像上。

3、本发明提供的一种用于检测银离子的荧光探针，探针pdi-ad在加入银离子前后伴随着明显的颜色变化(由深绿色变为浅绿色)，从而实现对银离子的可视化检测，裸眼识别效果明显，这大大提高了其使用效果。

4、本发明提供的一种用于检测银离子的荧光探针，荧光探针pdi-ad对银离子具有较好的选择性，其它的离子如k⁺,ca²⁺,na⁺,mg²⁺,zn²⁺,fe³⁺,fe²⁺,ni²⁺,co²⁺,mn²⁺,cu²⁺,f^-,cl^-,br^-,i^-,s^2-,so4^2-,scn^-,co3^2-,so3^2-,no^3-,ac^2-和no^2-均不能导致其荧光发生明显的变化，抗干扰能力强。

5、本发明提供的一种用于检测银离子的荧光探针，稳定性好，耐强酸强碱，可长期保存使用。

附图说明

图1为本发明实施例1的提供的用于检测银离子的荧光探针的合成路线图；

图2为本发明实施例1的提供的用于检测银离子的荧光探针的发光原理图；

图3为本发明实施例1的提供的用于检测银离子的荧光探针的核磁氢谱图；

图4为本发明实施例1的提供的用于检测银离子的荧光探针的核磁碳谱图；

图5为本发明实施例1的提供的用于检测银离子的荧光探针的高分辨质谱图；

图6为本发明实施例1的提供的用于检测银离子的荧光探针的能量转移滴定曲线图；

图7为本发明实施例1的提供的用于检测银离子的荧光探针的时间响应曲线图；

图8为本发明实施例1的提供的用于检测银离子的荧光探针的干扰离子实验图；

图9为本发明实施例1的提供的用于检测银离子的荧光探针在日光下加入银离子前后的颜色变化图；其中(a)图为加入银离子前的颜色图，(b)图为加入银离子后的颜色图。

具体实施方式

实施例1荧光探针pdi-ad

一、荧光探针的制备

1、化合物an-boc的制备：

(1)在维持反应体系0℃条件下，向溶解有乙二胺(en)(27g,440mmol)的二氯甲烷溶液(500ml)缓慢滴加boc酸酐(16g,72mmol)，保证激烈搅条件下6小时滴加完成，待滴加完毕后缓慢升温到室温，搅拌过夜有大量白色固体生产。向反应液中加入300ml水充分搅拌萃取，有机相经无水硫酸干燥后减压去除溶剂得到一黄色油状物。经硅胶层析分离得一浅黄色油状液体化合物(11g).产率：88％。

(2)向溶解有上述合成化合物boc-乙二胺(10g,62mmol)的甲醇溶液缓慢滴加含有丙烯酸甲酯(ma)(54g,620mmol)的甲醇溶液(50ml)。室温下搅拌三天，60℃条件下减压除去溶剂和过量的丙烯酸甲酯得一淡黄色油状物。层析分离，最后得一无色油状物an-2(21g),产率：99％。

(3)将上一步化合物an-2(10g,30mmol)溶解在甲醇中(50ml)，然后在0℃条件下将其缓慢滴加到含有乙二胺(60g,1mol)的甲醇溶液中。将混合物在室温下搅拌5天。反应完毕，过量的溶剂和乙二胺在60℃水浴中旋转减压去除。为了彻底去除过量的乙二胺，分三次向反应混合物中加入乙醇(100×3ml)然后减压旋干，最后得到一粘稠状油状液体(12g),产率：99％。

2、化合物nb-a的制备：

氮气保护下，将溶解有化合物pd(oac)2(45mg,0.20mmol),邻甲基三苯基膦(150mg,0.40mmol),磷酸钾(3.6g,10mmol),2-乙烯基吡啶(2g,17mmol),和化合物4-溴-1,8-萘酸酐(2g,7.2mmol)的dmf(100ml)溶液在130℃温度下加热回流8-12小时。待反应冷却到室温后向反应液中加入水(200ml)并有大量固体析出。抽滤、甲醇重结晶得一淡黄色固体,产率：75-80％。

3、化合物nb-3的制备：

(1)将步骤1制得的化合物an-boc(1.6g,4mmol)和步骤2制得的化合物nb-a(2.8g,10mmol)溶解在150ml无水乙醇中,加热回流48h,反应完成后，过量的溶剂减压去除得一黄色固体，层析分离得一黄色固体nb-2(m.p.142-144℃)。

(2)向溶解有化合物nb-2(2.4g,2.6mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液中滴加三氟乙酸(10ml)，反应混合物室温搅拌24小时，tlc跟踪反应，反应完成后减压除去过量的溶剂和三氟乙酸最后得一黄色固体化合物nb-3。化合物nb-3不经过进一步的纯化直接在下一步反应中使用。

4、化合物pdi-a的制备：

氮气保护下，将溶解有化合物1,7-二溴苝酐-3,4:9,10-二(二酸酐)(2.0g,3.6mmol)，六氢哌啶(1.8g,12.0mmol),碳酸钾(2.38g,6.8mmol)120ml的dmf加热反应8-12小时。待反应液冷却到室温后，向其加入水100ml，用稀盐酸调ph至中性有大量固体绿色生成。化合物未经提纯直接在下一步反应中使用。

5、探针分子pdi-ad的制备：

将化合物nb-2(2.2g,2.4mmol)，化合物pdi-a(0.84g,1.2mmol)和三乙胺(2ml)溶解在dmf(60ml)中，氮气保护下，将反应混合物加热回流8-12小时，待反应完成后，冷却到室温然后向反应液中加入100ml水，有大量绿色固体析出。抽滤、水洗然后真空干燥。最后经层析分离(洗脱剂dcm/methanol＝20-10:1)得一紫色固体，产率：85-90％。

探针pdi-ad的合成路线如图1所示。

二、荧光探针

1、所述制得的荧光探针为基于苝酰亚胺的可视化检测银离子的荧光探针，我们将其命名为pdi-ad，其分子式为c134h114n18o16，其结构式如下：

2、所述探针分子pdi-ad的发光原理如图2所述，伴有分子内荧光共振能量转移现象，这里银离子作为供体，萘酰亚胺单元中心的苝酰亚胺基团作为受体，400nm激发萘酰亚胺单元时中心苝酰亚胺的发射强度比采用其最大吸收672nm激发的发射强度增强了近3倍，此探针为荧光“关-开”型响应。

3、探针分子pdi-ad的核磁氢谱如图3所示，探针分子pdi-ad的核磁碳谱如图4所示，探针分子pdi-ad的高分辨质谱图(基质解吸辅助电离质谱仪测定)如图5所示。

实验例1探针pdi-ad与不同当量的银离子反应的荧光光谱变化

取实施例1制备得到的探针pdi-ad溶于thf中，配制成浓度为10^-5mol/l的探针母液；用蒸馏水作溶剂，配制各种浓度同样为10^-4mol/l的银离子液。用移液枪分别加入物质的量比为1：3比例的探针和检测物种，vthf：vh2o＝1:9)，将配制好的溶液摇匀，然后测试它们的实时荧光光谱。

图6为探针pdi-ad与不同当量的银离子反应的荧光光谱变化图，可看出，随着银离子的浓度增强，750nm处的发射强度逐渐增强，最大增强倍数接近24倍。同时我们取增强曲线的前八个点做探针对银离子的浓度梯度曲线，拟合、计算出探针对银离子的检测限，其最低值达2×10^-6mol/l。

实验例2探针pdi-ad对银离子的响应时间测试测定

取实施例1制备的探针pdi-ad溶于thf中，配制成浓度为10^-5mmol/l的探针母液；用蒸馏水作溶剂，配制案例6中配置好的银离子溶液，将其按3个当量比滴加到探针溶液中，摇匀，然后每8-12秒测试一次它们的实时荧光光谱。

由图7可看出，银离子与探针pdi-ad作用后，荧光强度强度逐渐增强，一分钟后发射强度趋于平稳。

实验例3探针pdi-ad对不同干扰离子的选择性

取实施例1制备的探针pdi-ad溶于thf中，配制成浓度为10^-5mol/l的探针母液；用蒸馏水作溶剂，配制各种浓度同样为10^-4mol/l的检测物种(ca²⁺,mg²+,zn²⁺,fe³⁺,ni²+,co²⁺,mn²⁺,cu²⁺,so4^2-,scn^-,co3^2-,so3^2-,no^3-,ac^-,clo^-,和h2o2,银离子液。用移液枪分别加入物质的量比为1：3比例的探针和检测物种，vthf：vh2o＝1:9)，将配制好的溶液摇匀，然后测试它们的实时荧光光谱。

图8中的横坐标1-15依次为探针与离子ca²⁺，mg²⁺，zn²⁺，fe³⁺，ni²⁺，co²⁺,mn²⁺,cu²⁺,so4^2-,scn^-,co3^2-,so3^2-,no3-,ac^-,clo^-,和h2o2作用的荧光发射强度，纵坐标中1’-15’依次为向1-15的溶液继续滴加同样量的ag⁺离子后探针的荧光光谱强度。(λex＝400nm，λem＝775nm)

由图8可知，由银离子与探针pdi-ad作用后，具有良好的选择性，荧光强度增强24倍左右，而其它的检测物种对探针pdi-ad的荧光几乎没有影响。

实验例4探针pdi-ad对银离子的可视化检测及其稳定测试

取实施例5制备的探针pdi-ad溶于thf中，配制成浓度为10^-5mol/l的探针母液；用蒸馏水作溶剂，配制浓度为10^-4molmmol/l的银离子液。用移液枪分别加入物质的量比为1：3比例的探针和检测物种，vthf：vh2o＝1:9，将配制好的溶液摇匀。

如图9所示，探针溶液颜色在60秒内用深蓝色变成浅蓝色。将此探针检测前和后溶液室温下保存4周，探针颜色无明显变化。因此，探针pdi-ad对银离子具有专一选择性和较高的灵敏度、抗干扰能力强、响应快、稳定性好并且能够通过颜色变化实现对银离子裸眼识别。

所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。