用于检测HPV的试剂盒的制作方法

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种用于检测hpv的试剂盒。

背景技术

人类乳突病毒(humanpapillomavirus，hpv)是一种比细菌还小的微生物，是滤过性病毒的一种。在目前已知的200多种亚型hpv中，大约40种亚型可以侵犯女性生殖道，至少15种亚型与侵袭性子宫颈癌有关，称为致癌性或高危险性型，其中第16型最为常见，第18型次之，两者合起来已占了子宫颈癌的70％。人类乳突病毒具有高度的宿主专一性特性，专门会感染人类的皮肤及黏膜。感染第16型及18型人类乳突病毒与子宫颈癌、阴茎癌、会阴癌和肛门癌等的形成有关。

目前市面上hpv的检测方法有很多种，包括杂交捕获法、荧光原位杂交法、芯片技术杂交法、实时荧光pcr法、斑点印记法及恒温扩增法等，每种检测方法的敏感性、特异性均有所不同。无论哪种检测方法，都不能检测所有的型别，但是也不必过于担心漏诊的问题，因为子宫颈癌的发生，只与高危型hpv有关，如上述提到的70％宫颈癌患者感染的为16型和18型两个亚型，其他的高危型hpv在现有的检测方法中基本都能查出。因此，若高危型hpv的检测结果为阴性，则基本可排除子宫颈癌的可能性。

恒温扩增(isothermalamplification)中一个重要代表技术为重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)。此技术是由英国公司twistdxinc开发的一种可以替代传统pcr的新型核酸检测技术。利用该技术，能够在30分钟内进行常温下的单分子核酸检测，该技术对硬件设备的要求较低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。但是，现有的rpa扩增技术还存在缺陷，如针对～500bp->500bp的目标产物(酶搭配的选择)容易造成灵敏度差及反应时间长(见文献：twistampmanuals.availablefrom:www.twistdx.co.uk/resources/instruction_manuals/twistamp_product_documentation/)，而且扩增后的产物有背景信号干扰的问题(见文献：o.piepenburg,c.h.williams,d.l.stempleandn.a.armes,plosbiol.,2006,4,e204,1115–1121.)。因此，该rpa扩增技术有待进一步改进。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种用于检测hpv的试剂盒，旨在解决现有rpa法检测hpv时，存在专一性与灵敏度不高的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种用于检测hpv的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增hpv的引物，以及uvsx、uvsy、ssb和dna聚合酶。

恒温扩增法中酶的组合搭配非常关键，rpa技术主要依赖于三种酶蛋白：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶(recombinase)、单链结合蛋白(ssb)和链置换dna聚合酶(polynerase)，而本发明提供的用于检测hpv的试剂盒是一种基于恒温扩增的试剂盒，在该试剂盒中，选用了t4系列酶组合即uvsx和uvsy取代现有的重组酶，该酶体系相对现有技术，不仅可以进一步提高hpv检测的灵敏度和专一性，而且对扩增hpv的引物选择可更加多元化，可以在较短引物条件下扩增100-200bp产物，进而缩短反应时间，降低背景信号的干扰，最终提高检测效率，显著降低检测成本。

附图说明

图1为本发明实施例3中的hpv检测结果的电泳图；其中，1为dnamarker，2为阳性对照，3为hpv16感染dna样本、4为hpv18感染dna样本、5为阴性对照、6为空白对照。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种用于检测hpv的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增hpv的引物，以及uvsx、uvsy、ssb和dna聚合酶。

恒温扩增法中酶的组合搭配非常关键，rpa技术主要依赖于三种酶蛋白：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链结合蛋白和链置换dna聚合酶，而本发明实施例提供的用于检测hpv的试剂盒是一种基于恒温扩增的试剂盒，在该试剂盒中，选用了t4系列酶组合即uvsx和uvsy取代现有的重组酶，该酶体系不仅可以进一步提高hpv检测的灵敏度和专一性，而且对扩增hpv的引物选择可更加多元化，可以在较短引物条件下扩增100-200bp产物，进而缩短反应时间，降低背景信号的干扰，最终提高检测效率，显著降低检测成本。

目前rpa扩增的原理为：重组酶(recombinase)与引物结合形成的蛋白-dna复合物，能在双链dna中寻找同源序列，一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动dna合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的dna链与单链结合蛋白(ssb)结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物开启一个合成反应，整个过程进行得非常快，一般可在30分钟之内获得可检出水平的扩增产物。该过程中，重组酶、单链结合蛋白和链置换dna聚合酶这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右，但目前这三种酶组合存在灵敏度差及反应时间长、扩增后的产物有背景信号干扰的问题。而本发明实施例中，在现有rpa基础上，提出一种重组高敏扩增法(recombinantsensitizeamplification，rsa)，该方法是一种经改良的新型恒温扩增方法，应用于针对hpv检测的试剂盒，该试剂盒中针对品项筛选最佳的酶组合(即uvsx、uvsy、ssb和dna聚合酶)替代现有酶，通过模拟原始dna复制过程，免去传统pcr温度变化来达到扩增效果，搭配专属设计用于扩增hpv的引物，可以缩短整个复制时程，提高复制模板的准确性和效率，降低其他dna/背景信号的干扰，从而提高检测时间，显著降低检测成本。

进一步地，在本发明实施例提供的试剂盒中，所述用于扩增hpv的引物包括用于扩增hpv16的第一引物对，且所述第一引物对的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示。以及，所述用于扩增hpv的引物包括用于扩增hpv18的第二引物对，且所述第二引物对的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示。即通过第一引物对和/或第二引物对，结合本发明实施例试剂盒中特有的酶组合系统，检测高危型hpv：hpv16型和hpv18型。

具体地，通过ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)搜寻genbank(基因库)的hpv16(ncbireferencesequence:nc_001526.4)及hpv18(ncbireferencesequence:nc_001357.1)的完整基因序列，根据该完整基因序列设计引物(引物长度～30bp，gc含量：30-70％)。设计出的第一引物对和第一引物对与本实施例试剂盒中特有的酶组合系统相结合，可对ncbi数据库找到的hpv16及hpv18dna序列有高专一性的、约130～200bp的dna扩增产物。

具体引物序列如下：

hpv16primerforward(seqidno.1)：

5’-gtttcaggacccacaggagcgacccagaaa-3’；

hpv16primerreverse(seqidno.2)：

5’-aacataacgacaagattacaacaaggtagt-3’；

hpv18primerforward(seqidno.3)：

5’-atccaacacggcgaccctacaagctacctg-3’；

hpv18primerreverse(seqidno.4)：

5’-ccgtggaataattatttaacatattgggtc-3’。

进一步地，在本发明实施例提供的试剂盒中，所述uvsx的氨基酸序列如seqidno.5所示；具体如下：

>sp|p04529|uvsx_bpt4recombinationandrepairproteinos＝enterobacteriaphaget4ox＝10665gn＝uvsxpe＝1sv＝2

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所述uvsy的氨基酸序列如seqidno.6所示，具体如下：

>sp|p04537|uvsy_bpt4recombinationproteinuvsyos＝enterobacteriaphaget4ox＝10665gn＝uvsype＝1sv＝3

mrledlqeelkkdvfidstklqyeaannvmlyskwlnkhssikkemlrieaqkkvalkarldyysgrgdgdefsmdryeksemktvlsadkdvlkvdtslqywgilldfcsgaldaiksrgfaikhiqdmrafeagk。

所述ssb的氨基酸序列如seqidno.7所示，具体如下：

>sp|p0age0|ssb_ecolisingle-strandeddna-bindingproteinos＝escherichiacoli(straink12)ox＝83333gn＝ssbpe＝1sv＝2

masrgvnkvilvgnlgqdpevrympnggavanitlatseswrdkatgemkeqtewhrvvlfgklaevaseylrkgsqvyiegqlrtrkwtdqsgqdryttevvvnvggtmqmlggrqgggapaggnigggqpqggwgqpqqpqggnqfsggaqsrpqqsapaapsneppmdfdddipf。

所述dna聚合酶的氨基酸序列如seqidno.8所示，具体如下：

>sp|p52026|dpo1_geosednapolymeraseios＝geobacillusstearothermophilusox＝1422gn＝polape＝1sv＝2

mknklvlidgnsvayraffalpllhndkgihtnavygftmmlnkilaeeqpthilvafdagkttfrhetfqdykggrqqtppelseqfpllrellkayripayeldhyeaddiigtmaaraeregfavkvisgdrdltqlaspqvtveitkkgitdiesytpetvvekygltpeqivdlkglmgdksdnipgvpgigektavkllkqfgtvenvlasideikgeklkenlrqyrdlallskqlaaicrdapveltlddivykgedrekvvalfqelgfqsfldkmavqtdegekplagmdfaiadsvtdemladkaalvvevvgdnyhhapivgialanergrfflrpetaladpkflawlgdetkkktmfdskraavalkwkgielrgvvfdlllaaylldpaqaagdvaavakmhqyeavrsdeavygkgakrtvpdeptlaehlvrkaaaiwaleeplmdelrrneqdrllteleqplagilanmeftgvkvdtkrleqmgaelteqlqaverriyelagqefninspkqlgtvlfdklqlpvlkktktgystsadvleklaphheivehilhyrqlgklqstyiegllkvvhpvtgkvhtmfnqaltqtgrlssvepnlqnipirleegrkirqafvpsepdwlifaadysqielrvlahiaeddnlieafrrgldihtktamdifhvseedvtanmrrqakavnfgivygisdyglaqnlnitrkeaaefieryfasfpgvkqymdnivqeakqkgyvttllhrrrylpditsrnfnvrsfaertamntpiqgsaadiikkamidlsvrlreerlqarlllqvhdelileapkeeierlcrlvpevmeqavtlrvplkvdyhygptwydak。

进一步地，在本发明实施例提供的试剂盒中，所述试剂盒包括扩增缓冲液(amplificationbuffer)，所述扩增缓冲液的ph＝7-10，如ph低于7，则dna中连接核酸碱基的化学键会水解；如ph大于10，则形成双螺旋结构的二核苷酸键会被破坏，因此，在ph＝7-10的范围内，可稳定进行hpv扩增。更优选地，ph＝8.8时，整个hpv扩增反应的稳定性最佳。

更进一步地，所述扩增缓冲液含有：tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、20。上述成分中，tris-hcl可以维持扩增缓冲液的ph稳定；kcl可以通过稳定引物与dna模板结合，k⁺可以结合带负电荷的磷酸盐基团，减少其净负电荷，从而使得带负电荷的引物不会和模板排斥；而mgcl2作为一种的辅助因子，也是一种引物与dna模板结合的稳定剂；(nh4)2so4可以防止引物与dna模板的错配，而且在不同的温度和mgcl2浓度条件下，含有(nh4)2so4的扩增反应都很稳定，这样可以调节反应温度和mgcl2浓度，以便更好地优化扩增体系；20为一种非离子洗涤剂，不仅可以稳定酶的活性，还可以抑制二级结构的形成，从而提供扩增效率。因此，本发明实施例的试剂盒中的上述扩增缓冲液，通过对其中的成分进行调节配比，可以得到适合恒温扩增hpv的扩增体系，最终使得本发明实施例的该试剂盒可以准确、效率地检测hpv，并且降低其他dna/背景信号的干扰，从而提高检测时间，显著降低检测成本。具体地，针对目标hpv的长度，dna的浓度，所需各种酶的作用浓度等等因素，可进行优化得到合适扩增缓冲液。

优选地，在本发明实施例中，针对目标hpv16和hpv18的检测，本发明实施例的扩增缓冲液的ph＝8.8，且该扩增缓冲液含有：20mm的tris-hcl、10mm的(nh4)2so4、50mm的kcl、2mm的mgso4和0.1％(质量百分含量)的20。该条件下的扩增缓冲液，可更好地适合对目标hpv16和hpv18的检测。

进一步地，在本发明实施例提供的试剂盒中，所述试剂盒还包括阳性对照组，且所述阳性对照组含有如seqidno.9和seqidno.10所示的阳性对照引物。该阳性对照引物可同时扩增hpv16型和hpv18型，具体序列如下：

seqidno.9：5’-catagaaataacctgtgtatattgcaagac-3’；

seqidno.10：5’-cacagattcaaaaagacgacctaagttgcc-3’。

进一步地，在本发明实施例提供的试剂盒中，所述试剂盒在37-40℃的扩增条件下对hpv进行检测。更优选地，所述试剂盒检测hpv的时间为10-20min。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

实施例1用于检测hpv的试剂盒

一种基于重组高敏扩增法检测hpv的试剂盒，包括：

用于扩增hpv16的第一引物对(seqidno.1和seqidno.2)和用于扩增hpv18的第二引物对(seqidno.3和seqidno.4)；uvsx(seqidno.5)、uvsy(seqidno.6)、ssb(seqidno.7)和dna聚合酶(seqidno.8)；以及扩增缓冲液：20mmtris-hcl、10mm(nh4)2so4、50mmkcl、2mmmgso4和0.1％20(ph＝8.8)。

实施例2dna提取(萃取法)

检测样本中dna的提取，包括如下步骤：

1.将宫颈组织(cervicaltissue)细胞加入1mlextractionbuffer(100mmtris-hcl，ph＝8.0；50mmedta，ph＝8.0；500mmnacl，+0.07％巯基乙醇)，充分混合。

2.加入130ul10％sds，以及少量蛋白质分解脢k，倒置摇晃数次，置于65℃水浴槽中水浴1小时。

3.加入300ul5m醋酸钾(potassiumacetate)，充分混和，然后置于冰上30分钟，以利于蛋白质沉淀。

4.12000rpm离心30分钟，取出上清液移到新的离心管(eppendorftube)中。

5.加入异丙醇两倍体积，12000rpm离心30分钟。

6.倒掉上清液，加入70％乙醇，12000rpm离心30分钟。

7.倒掉上清液，至于室温风干，30分钟。

8.加入50ul蒸馏水(distilledwater)溶解dna，存于零下20度。

利用上述方法，根据宫颈组织细胞的感染状态：hpv16感染、hpv18感染、未被hpv感染，分别提取到三个dna样本：即hpv16-positive(hpv16感染dna样本)、hpv18-positive(hpv18感染dna样本)和hpv-negativesamples(阴性对照dna样本)。

实施例3hpv检测

将实施例1中的试剂盒和实施例2中的提取得到dna样本按照以下表1中的比例，加入到微量试管中(最终体积为：50ul)，在37-40℃的环境下均质摇晃300rpm反应10-20分钟。

表1

待反应结束后，将反应产物在3～4％的洋菜胶中进行电泳，判读dna的产物大小(其中加入追踪染剂，与对照组进行对比电泳，并放入dnamarker进行比较)，将电源插头(注意正负极的位置)连接到电源，电泳过程中，带负电荷的dna分子会由负极移向正极，在100vol中跑胶约10分钟。戴手套把洋菜胶放在强uv透射光源板上，即可对结果拍照存盘，最终的结果图如图1所示。从图1可知：本实施例的试剂盒对hpv16和hpv18的检测具有很好的灵敏度和专一性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>深圳市芯思微生物科技有限公司

<120>用于检测hpv的试剂盒

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

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<212>dna

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<400>3

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<210>4

<211>30

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