一种抗皮肤衰老的四肽及其用途的制作方法

本发明属于氨基酸多肽领域，具体涉及一种抗皮肤衰老的四肽glpy及其应用。

背景技术：

延缓皮肤衰老、保持青春常驻是人们，尤其是女人千百年来永恒的梦想。皮肤的衰老机理复杂，是多种因素共同导致的结果，如氧化应激、紫外损伤、糖基化以及基质金属蛋白酶体系的平衡被打破等。

皮肤衰老的表征也是多种多样，主要是皮肤结构和功能的破坏，体现为结构蛋白(胶原蛋白和弹性蛋白)的降解、表皮结构异常。皮肤的衰老导致一系列问题的出现，如干燥、皱纹、松弛、色斑等。

随着对皮肤衰老作用机制研究的深入，科学家们发现基质金属蛋白酶是导致皮肤衰老的关键酶。它能够降解皮肤中细胞间质蛋白，破坏皮肤的结构并导致皮肤真皮层中的重要细胞——成纤维细胞的失巢凋亡，最终引起皮肤系列衰老问题。

基质金属蛋白酶是一类具有降解细胞外基质(ecm)能力的内肽酶家族，包括胶原蛋白酶和弹性蛋白酶等，其生物活性依赖于锌离子。其中弹性蛋白酶(mmp-12)不仅能降解皮肤中的弹性蛋白，还能激活其他基质金属蛋白酶的活性。因此通过抑制弹性蛋白酶的活性，能够有效减少皮肤中结构蛋白的降解，缓解成纤维细胞的失巢凋亡，从而起到皮肤抗衰老的目的。

引起皮肤衰老的原因有很多，比如内源性的衰老(端粒缩短启动的细胞程序性衰老等)以及外源性衰老(如极冷、干燥等极端条件和紫外损伤引起的皮肤老化等)。中国专利申请(申请号201680015792.7)公开了一种延缓皮肤老化的多肽，六肽his-d-trp-ala-trp-d-phe-lys-nh2能够对foxo3asirna转染导致成纤维细胞程序性衰老具有显著的抑制作用。然而，紫外线对皮肤日积月累的损伤也是导致皮肤衰老的元凶之一，上述专利却没有涉及六肽对紫外损伤引起的衰老的影响进行报道。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一种抗皮肤衰老的四肽。

本发明的另一目的在于提供上述四肽的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种四肽，氨基酸序列为gly-lue-pro-tyr(glpy)，分子量为449.2393da。

本发明的四肽glpy可通过现有技术的化学合成法等方式合成。

本发明的四肽glpy能与弹性蛋白酶结合，抑制弹性蛋白酶活性，减少光损伤造成的成纤维细胞凋亡，从而表现出抗皮肤衰老的活性。基于此，本发明的四肽可以用于制备具有抗皮肤衰老功效的保健品和护肤品。

本发明中glpy通过对光老化的成纤维细胞的保护作用以体现抗衰老活性。foxo3asirna导致的衰老(专利201680015792.7)是一种程序性衰老，与光老化衰老的表征和发生机理均不相同，因此虽然两个专利虽然都是抗衰老，但作用机理不一样，或者说不是针对同一种“衰老”。

所述的保健品和护肤品还含有其他具有抗皮肤衰老功效的活性成分和/或可接受的辅料；

所述的保健品可以是各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂等；

所述的护肤品可以是各种剂型，如面霜、面膜、水剂、乳液等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的四肽glpy能与弹性蛋白酶结合，抑制弹性蛋白酶活性，减少光损伤造成的成纤维细胞凋亡，从而表现出抗皮肤衰老的活性，可以用于制备具有抗皮肤衰老功效的保健品和护肤品。

附图说明

图1是glpy和py对光老化成纤维细胞存活率的影响。

图2是glpy和py对光老化成纤维细胞中胶原蛋白、弹性蛋白的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中所涉及的试验指标其实验方法如下：

(1)体外弹性蛋白酶抑制活性测定

取200μltris-hcl缓冲液(ph值8.0,0.1m)或一定浓度的样品、50μl底物(n-succinyle-ala-ala-ala-pna,1mm)置于96孔紫外酶标板中，在一定温度下孵育5min，加入50μl弹性蛋白酶溶液(60u/l)启动反应，在410nm处测定尿酸含量的增加情况，每30s扫描一次，直至尿酸含量不再增加后，加入一定量1mol/lhcl终止反应。以吸光值为纵坐标，时间为横坐标计算酶解产物对硝基苯胺生成速度。

抑制活性＝v样/v空白

v样：样品组对硝基苯胺生成速度

v空白：tris-hcl缓冲液组对硝基苯胺生成速度

(2)成纤维细胞实验

(a)受试药物及试剂

人皮肤成纤维细胞(hff，中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；dmem高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青/链霉素(美国gibco公司)；；mtt、dmso、edta(美国sigma公司)。

(b)受试药对光老化成纤维细胞修复作用

取对数生长期的hff细胞，接种于96孔板培养24h后，弃去旧培养液用pbs洗涤1次，加入少量pbs，使覆盖到培养皿底部，紫外灯下(距紫外灯20厘米处)照射10min，照射后更换新鲜dmem培养液(含一定浓度样品)继续培养24h。mtt法测定细胞存活率。

(c)受试药对光老化成纤维细胞中胶原蛋白、弹性蛋白的影响

培养细胞后，弃去含有eh的dmem培养基，并用pbs将残留细胞清洗干净。加入0.25％的胰酶消化，轻轻将细胞吹打下来，收集细胞并离心(1000×g，3min)，弃上清液并加入200μlpbs重悬细胞。重复上述离心，弃上清，加入200μlripa裂解液处理15min以裂解细胞(冰浴)。所得混合物在13000×g,4℃条件下离心5min，收集上清裂解液。根据相关试剂盒说明书测定裂解液中i型胶原蛋白、弹性蛋白含量。

实施例1

四肽glpy，浓度为10mmol/l时，其弹性蛋白酶抑制活性为51.18％。

对比例1

二肽py，浓度为10mmol/l时，其弹性蛋白酶抑制活性为25.22％。

可见，本发明四肽的弹性蛋白酶抑制活性较高。

实施例2

四肽glpy，浓度为200μmol/l，做光损伤下成纤维细胞的存活率试验，结果如图1所示。

对比例2

二肽py，浓度为200μmol/l，做光损伤下成纤维细胞的存活率试验，结果如图1所示。

由图1可知，被紫外照射后的成纤维细胞(模型组)存活率急剧降低至仅31.64％，而用glpy培养时，细胞存活率高达77.74％。而用二肽py培养时，成纤维细胞存活率仅36.09％，与模型组无显著性差异(p<0.05)。说明glpy能够有助于光老化后成纤维细胞的修复，存在具有抗皮肤衰老的潜力。

实施例3

四肽glpy，浓度为200μmol/l时对光老化成纤维细胞中胶原蛋白、弹性蛋白的影响如图2所示。

对比例3

二肽py，浓度为200μmol/l时对光老化成纤维细胞中胶原蛋白、弹性蛋白的影响如图2所示。

根据图2可知，uv损伤的成纤维细胞中胶原蛋白含量显著减少(p<0.05)至空白组的78.91％。用200μm的样品处理uv损伤的细胞后，细胞胶原蛋白含量均有不同程度的提升，其中以glpy效果最为明显，较模型组提升了1.73倍，甚至高于空白组，其次是py提升至空白组的111.36％。此外，py等两个肽均显著(p<0.05)提升了细胞中弹性蛋白水平，其中glpy对弹性蛋白含量影响最大(提升至119.47％)，而py的增加趋势较弱，仅增加了7.38％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。