一种西瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法与流程

本发明涉及植物遗传学和基因工程领域中，一种西瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法。

背景技术：

西瓜(citrulluslanatus(thunb.)mansfeld.etnakai)为葫芦科(cucurbitaceae)西瓜属一年生草本蔓生植物，是一种重要的园艺作物。西瓜遗传基础狭窄，种质资源缺乏，很多重要的性状无法通过常规育种方法进行改良。基因工程技术就成为对常规育种的有效补充手段。随着生物技术的不断发展，利用转基因技术及基因编辑技术对遗传物质进行人为操作开始广泛应用于各种植物中，为创制新种质提供了新方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何进行西瓜的遗传转化。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了农杆菌介导的西瓜遗传转化方法，所述方法包括：

1)采用含有重组农杆菌的侵染液侵染西瓜外植体，将侵染后的西瓜外植体于共培养培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述重组农杆菌含有载有目的基因和basta基因的重组表达载体；

2)将所述共培养后的外植体于筛选培养基上培养，得到含有阳性芽的植物组织；

3)将所述阳性芽的植物组织于芽伸长培养基上培养，得到具有西瓜地上部分的幼苗；

4)将所述具有西瓜地上部分的幼苗于生根培养基上培养，得到西瓜植株；

5)从所述西瓜植株中筛选含有所述目的基因的植株，得到完成遗传转化的西瓜植株。

上述方法中，步骤5)可包括51)或52)：

51)利用basta试纸条筛选所述西瓜植株，产生目标阳性线的植株即为所述完成遗传转化的西瓜植株，无目标阳性线的植株不为完成遗传转化的西瓜植株；

52)向步骤4)得到的西瓜植株或其任意部位涂抹草铵膦，不发生枯死的植株或涂抹草铵膦部位不发生枯死的植株即为所述完成遗传转化的西瓜植株，发生枯死的植株或涂抹草铵膦部位不发生枯死的植株不为完成遗传转化的西瓜植株。

上述方法中，所述西瓜外植体可为a1)或a2)或a3)：

a1)西瓜子叶；

a2)西瓜未展子叶；

a3)西瓜未展子叶中段。

所述西瓜未展子叶中段具体可为子叶叶尖和叶柄基部间的组织。

所述外植体的大小可根据需要调整。在本发明的一个实施例中，所述外植体的大小为1.5mm×1.5mm。

上述方法中，所述共培养培养基可含有6-ba，6-ba在所述共培养培养基中的浓度可为1-2mg/l。

所述筛选培养基可含有6-ba、特美汀(timentin)和草铵膦(basta)，6-ba、特美汀和草铵膦在所述筛选培养基中的浓度分别可为1-2mg/l、100-300mg/l和1-3mg/l。

所述芽伸长培养基可含有6-ba、naa、特美汀和草铵膦，6-ba、naa、特美汀和草铵膦在所述芽伸长培养基中的浓度分别可为0.05-0.2mg/l、0.01-0.02mg/l、100-300mg/l和1-3mg/l。

所述生根培养基可含有iba和特美汀，iba和特美汀在所述生根培养基中的浓度分别可为1-2mg/l和100-200mg/l。

上述方法中，所述共培养培养基可含有6-ba，6-ba在所述共培养培养基中的浓度为1.5mg/l。

所述筛选培养基可含有6-ba、特美汀和草铵膦，6-ba、特美汀和草铵膦在所述筛选培养基中的浓度分别可为1.5mg/l、100mg/l和2mg/l。

所述芽伸长培养基可含有6-ba、naa、特美汀和草铵膦。所述芽伸长培养基中6-ba与naa的浓度比大于等于5小于等于20。6-ba、naa、特美汀和草铵膦在所述芽伸长培养基中的浓度分别可为0.1mg/l、0.01mg/l、100mg/l和2mg/l。

所述生根培养基可含有iba和特美汀，iba和特美汀在所述生根培养基中的浓度分别可为1mg/l和100mg/l。

上述方法中，所述共培养培养基可为由ms培养基和6-ba组成的固体培养基。

所述筛选培养基可为由ms培养基与6-ba、特美汀和草铵膦组成的固体培养基。

所述芽伸长培养基可为由ms培养基与6-ba、naa、特美汀和草铵膦组成的固体培养基。

所述生根培养基可为由ms培养基与iba和特美汀组成的固体培养基。

所述共培养培养基的ph可为5.7-5.9。所述共培养培养基的ph具体可为5.8。

所述筛选培养基的ph可为5.7-5.9。所述筛选培养基的ph具体可为5.8。

所述芽伸长培养基的ph可为5.7-5.9。所述芽伸长培养基的ph具体可为5.8。

所述生根培养基的ph可为为5.7-5.9。所述生根培养基的ph具体可为5.8。

上述方法中，步骤1)中共培养可在无光环境中进行，共培养的时间可为a1)或a2)：

a1)2.5-3.5天；

a2)3天。

所述农杆菌可为农杆菌菌株ehal05。

所述重组表达载体可为向具有bar抗性的植物双元载体导入所述目的基因得到的重组载体。所述具有bar抗性的植物双元载体具体可为植物双元载体pyba1302。所述重组表达载体能用于所述目的基因和所述basta基因的遗传转化。

所述重组表达载体能表达basta蛋白质。所述basta蛋白质可为序列表中序列1所示的蛋白质。所述重组表达载体含有basta基因。所述basta基因可为序列表中序列2所示的dna片段。

所述含有重组农杆菌的侵染液可为利用侵染液悬浮所述重组农杆菌得到的菌体悬液。所述侵染液可为无菌ms液体培养基。所述含有重组农杆菌的侵染液的od600为0.02-0.1，如0.05。

步骤1)中所述侵染的时间可为10分钟。

将所述共培养后的外植体于筛选培养基上培养时，可根据情况更换新的筛选培养基。

所述共培养培养基、所述筛选培养基、所述芽伸长培养基和所述生根培养基均可为无菌培养基。

所述西瓜可为栽培西瓜或野生西瓜。在本发明的一个实施例中，所述栽培西瓜为栽培西瓜品种97103，所述野生西瓜为野生西瓜品种pi296341。

本发明还提供了下述x1)或x2)的试剂：

x1)培养基，为所述共培养培养基、所述筛选培养基、所述芽伸长培养基或所述生根培养基；

x2)成套培养基，由所述共培养培养基、所述筛选培养基、所述芽伸长培养基和所述生根培养基组成。

所述成套培养基可用于西瓜的遗传转化。

本发明还提供了下述任一应用：

y1)所述农杆菌介导的西瓜遗传转化方法在西瓜育种中的应用；

y2)所述试剂在西瓜遗传转化中的应用；

y3)所述试剂在制备西瓜遗传转化产品中的应用；

y4)所述试剂在西瓜育种中的应用。

本发明建立了一种西瓜遗传转化方法，利用该方法可以实现对西瓜高转化频率、高重复性的农杆菌介导转化；另一方面，通过本发明只需要进行barst试纸条检测，可以方便、快捷、准确的鉴定出阳性植株，后期田间鉴定涂抹法省时省工，为大规模的开展西瓜分子育种工作提供了可能。

附图说明

图1是侵染后的外植体在共培养培养基中的生长情况。

图2是共培养后的外植体在筛选培养基中的生长情况。

图3是含有芽的植物组织或其芽在芽伸长培养基中的生长情况。

图4是幼芽在生根培养基中的生长情况。

图5是利用basta试纸条测定幼苗是否为阳性转基因的情况。阳性表示阳性转基因植株，非阳性表示阴性转基因植株。

图6是移栽到温室中的阳性西瓜转基因植株。

图7为田间遗传转化后的植株经过草铵膦涂抹2天后的反应情况。左图为阳性转基因植株，右图为阴性转基因植株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。

本发明提供了一种农杆菌介导的西瓜遗传转化方法，该方法采用basta作为筛选标记，该方法包括：

1)采用含有重组农杆菌的侵染液侵染西瓜外植体，将侵染后的西瓜外植体于共培养培养基上共培养，得到共培养后的外植体；重组农杆菌含有载有目的基因和basta基因的重组表达载体；basta基因的序列为序列表中序列2，编码序列表中序列1所示的basta蛋白质；

2)将共培养后的外植体于筛选培养基上培养，得到含有阳性芽的植物组织；

3)将含有阳性芽的植物组织于芽伸长培养基上培养，得到具有西瓜完整地上部分的幼苗；

4)将具有西瓜地上部分的幼苗于生根培养基上培养，得到西瓜植株；

5)从上述得到的西瓜植株中筛选含有目的基因的植株，得到完成遗传转化的西瓜植株。

下面具体阐述该方法的具体操作步骤。下述实施例中如无特殊说明，均在28℃下进行。

下述实施例中的栽培西瓜品种97103(guos,zhangj,sunh,etal.thedraftgenomeofwatermelon(citrulluslanatus)andresequencingof20diverseaccessions.naturegenetics,2013,45:51-58.),公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的野生西瓜品种pi296341(guos,zhangj,sunh,etal.thedraftgenomeofwatermelon(citrulluslanatus)andresequencingof20diverseaccessions.naturegenetics,2013,45:51-58.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、农杆菌介导的西瓜遗传转化

待转西瓜为：栽培西瓜品种97103和野生西瓜品种pi296341。实验重复三次。

1、外植体的制备

选取栽培西瓜品种97103和野生西瓜品种pi296341的饱满、外观正常的种子，小心的去除种壳，不要伤到子叶及生长点、灭菌后，在ms固体培养基中28℃黑暗下种植生长3天左右。选择处于胚根伸长、但两片子叶尚未分开的时期的植株，切取子叶中段，去除叶尖及靠近叶柄的部分，并将其切为1.5mm×1.5mm的小块作为外植体。

2、侵染液的制备

重组表达载体的制备：将目的基因1(序列表中序列3所示的dna片段)全长pcr扩增后通过ecori和xhoi双酶切连入具有的bar抗性的植物双元载体pyba1302(yanx,wangh,yey,zengg,mar,mif,yaol.2012.pyba100:anease-ofusebinaryvectorwithloxp-frtrecombinasesiteforplanttransformation.molecularplantbreeding10:371–379.)的多克隆位点中，使得重组载体中包含目的基因1，将该重组载体命名为rv。植物双元载体pyba1302含有序列2所示的basta基因，能表达序列表中序列1所示的basta蛋白质。

重组菌的制备：将上述重组载体rv导入农杆菌菌株ehal05(hoodee，gelvinsb，melchersls，hoekemaa.newagrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfetoplants.transgenicresearch.1993,2:208-218)中得到的重组菌命名为ehal05-rv；将空载体pyba1302导入农杆菌菌株ehal05中，将得到的重组菌命名为ehal05-v。

侵染液的制备：将ehal05-rv或ehal05-v活化并进行培养，在菌株浓度为在od600＝0.6-0.8之间时，离心，收集菌体，将菌体利用ms液体无菌培养基重悬，分别得到含有ehal05-rv的侵染液和含有ehal05-v的侵染液，含有ehal05-rv的侵染液和含有ehal05-v的侵染液的od600均为0.05。

3、侵染

将步骤1得到的外植体置于步骤2得到的含有ehal05-rv的侵染液或含有ehal05-v的侵染液中，并使外植体浸没在液体中，室温侵染10分钟，侵染过程中伴有间或摇动，然后取出外植体，将液体吸干，得到侵染后的外植体。

4、共培养

步骤3完成后，将侵染后的外植体于共培养培养基中，暗培养3天，得到共培养后的外植体，生长情况如图1所示。所用共培养培养基为由ms固体培养基和6-ba组成的无菌培养基，6-ba在共培养培养基中的浓度为1.5mg/l，ph为5.8。

在进行共培养时，通过调整上述共培养培养基中6-ba的浓度发现，在共培养培养基中不含有6-ba时，侵染后的外植体在共培养期间不会发生明显膨大，生长势弱，状态差；将共培养培养基中6-ba浓度提高到1mg/l时，外植体发生膨大；在共培养培养基中6-ba浓度提高到1.5mg/l后，经三天的暗培养后侵染后的外植体有较显著的膨大生长，易于后期筛选；但在共培养培养基中6-ba的浓度为3mg/l时，侵染后的外植体在共培养后生长稍显畸形，生长状态转差。

5、筛选

步骤4完成后，将共培养后的外植体于筛选培养基上培养，每个平板上放25个左右的外植体。每周更换一次培养基，约4周后，可观察到阳性幼芽从子叶块边缘长出，即得到含有芽的植物组织，生长情况如图2所示。所用筛选培养基为由ms固体培养基与6-ba、特美汀(timentin，北京酷来搏科技有限公司)和草铵膦(basta，西格玛奥德里奇中国公司)组成的无菌培养基，6-ba、特美汀和草铵膦在筛选培养基中的浓度分别为1.5mg/l、100mg/l和2mg/l，ph为5.8。

在筛选培养基上培养共培养后的外植体时，通过调整筛选培养基中6-ba、特美汀和草铵膦的浓度，得到的最佳筛选培养基。在筛选培养基中6-ba的浓度>2mg/l时，会诱发出现很多不正常的愈伤结块,而较低的6-ba的浓度(<1mg/l)时，芽原基的诱导分化效果很慢,而若继续降低浓度，则不能分化出叶芽，在筛选培养基中6-ba的浓度为1-2mg/l时，均可以诱导分化出正常的芽原基，在6-ba的浓度为1.5mg/l时最利于芽原基的诱导分化。在筛选培养基中特美汀的浓度为100、200和300mg/l时，均能对共培养后的外植体进行筛选，特美汀的浓度大于300mg/l时，则不利于共培养后代的外植体的生长。在筛选培养基中草铵膦的浓度为0.2mg/l时会引起植株变黄，但所需处理时间较长，在草铵膦浓度为5mg/l时会很快导致非阳性植株黄化，但也会使阳性株生长缓慢，在筛选培养基中草铵膦的浓度为1、2和3mg/l浓度时利于植株的筛选和生长，其中，在筛选培养基中草铵膦的浓度为2mg/l浓度时最利于植株的筛选和生长。

6、芽的培养

步骤5完成后，将含有芽的植物组织或其芽于芽伸长培养基中进行培养，每瓶4个芽左右，每周更换一次培养基，至幼芽长大，生长情况如图3所示。所用芽伸长培养基为由ms固体培养基与6-ba、naa、特美汀和草铵膦组成的无菌培养基，6-ba、naa、特美汀和草铵膦在芽伸长培养基中的浓度分别为0.1mg/l、0.01mg/l、100mg/l和2mg/l，ph为5.8。

在芽伸长培养基中培养含有芽的植物组织或其芽时，通过调整培养基中6-ba和naa的浓度比值，确定了最佳芽伸长培养基。在芽伸长培养基中6-ba:naa的浓度比为10:1(二者在芽伸长培养基中的浓度分别为0.1mg/l、0.01mg/l)时植株地上部分生长势最好,幼芽能迅速长大。其中6-ba、naa的在浓度分别为0.05-0.2mg/l、0.01-0.02mg/l时，幼芽可以正常生长，但要注意控制6-ba与naa的浓度比，当该比值<5时会促进根的不正向生长，而该比值>20时会诱导不正常的细胞分裂。

7、生根

步骤6完成后，将得到的具有完整地上部分的植株(包含茎、叶及定端生长点)置于生根培养基中进行培养，每瓶2个芽左右，至幼芽生根长成完整幼苗植株，即得到西瓜植株，生长情况如图4所示。生根培养基为由ms固体培养基与iba和特美汀组成的无菌培养基，iba和特美汀在生根培养基中的浓度分别为1mg/l和100mg/l，ph为5.8。

在生根培养基中培养具有完整地上部分的植株时，通过调整生根培养基中iba的浓度确定了最佳生根培养基。实验发现，在生根培养基中不含iba时，西瓜幼苗也会缓慢生长出根部，但所需周期长，在生根培养基中iba的浓度为1-2mg/l时会促进根的健康生长，其中在生根培养基中iba的浓度为1mg/l时，植株整体长势最好。

步骤5-7均在16h日/8h夜的光周期下进行，光强度为约6000lx。

8、阳性植株的鉴定

阳性植株采用basta试纸条或草铵膦涂抹的方法进行。

basta试纸条(北京奥创金标生物技术有限公司)：选取步骤7得到的西瓜植株的叶片，按照试纸条的说明书进行，产生目标阳性线的植株即为完成遗传转化的西瓜植株，含有目的基因，不产生目标阳性线的植株非完成遗传转化的西瓜植株，不含有目的基因，如图5所示。在温室生长的阳性转基因植株如图6所示。

草铵膦涂抹：利用40mg/l的草铵膦农药溶液涂抹叶片任意部位，两天后观察到特定部位叶片生长情况，仍然生长正常的植株为含有目的基因的完成遗传转化的西瓜植株(即阳性转基因植株)，涂抹部位发生枯死的植株非完成遗传转化的西瓜植株(即阴性转基因植株)，不含有目的基因，如图7所示。

利用识别出发载体上的启动子区间的正向引物与转入目的基因1上的反向引物分别对上述两种方法检测的完成遗传转化的西瓜植株和非完成遗传转化的西瓜植株的基因组dna进行扩增，并对得到的扩增产物进行测序。结果显示，上述两种方法鉴定出的完成遗传转化的西瓜植株在利用目的基因上的引物检测时，发现，这类植株均能扩增处目的条带，且序列正确，表明植株含有目的基因；而上述两种方法鉴定出的非完成遗传转化的西瓜植株在利用目的基因上的引物检测时，发现，这类植株均不能得到目的条带，表明植株不含有目的基因。所用引物为：

p35s-f：gaagttcatttcatttggagagg；

1-456r：ctgaacgatgccgaggaaggaac。

本实施例将目的基因转化栽培西瓜品种97103和野生西瓜品种pi296341，均得到了含有目的基因的阳性转基因植株。利用栽培西瓜品种97103获得的阳性转基因植株的百分比(阳性转基因植株数/(阳性转基因植株数+阴性转基因植株数)*100％)平均为45％，利用野生西瓜品种pi296341获得的阳性转基因植株的百分比平均为55％。

<110>北京市农林科学院

<120>一种西瓜高效遗传转化及转基因植株鉴定方法

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