一种梭子蟹科线粒体COI基因通用引物及设计和扩增方法与流程

本发明涉及一种头足类线粒体基因组研究领域，尤其涉及一种梭子蟹科线粒体coi基因通用引物及设计和扩增方法。

背景技术：

dna条形码(dnabarcoding)技术作为近年发展起来的物种鉴定的一门新兴技术，已受到越来越多的关注。其原理是通常利用一段短的线粒体coi(cytochromecoxidasesubunitⅰ)基因序列进行物种鉴定，目前已广泛应用于鱼类、鸟类、爬行类、哺乳类等生物类群，但在蟹类中不是很常见。梭子蟹科蟹类资源丰富，种类较多，具有极高的经济价值；然而，对蟹类的分类主要基于传统形态学和行为学的技术手段，而表型变异受环境因子影响显著，导致表型性状的不确定性。基于分子生物学方法进行物种鉴定，利用物种本身的dna信息，不受环境因子干扰，能够有效补充传统分类方法不足。

中国专利局于2017年9月29日公开了一种蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法的发明授权，授权公开号：cn104531688b，该发明采用提取蜘蛛基因组的总dna，通过线粒体基因组dna的长pcr(l-pcr)扩增和测序对蜘蛛进行鉴定，但其仅能鉴定蜘蛛线粒体dna，不能鉴定头足类线粒体coi基因，并需要设计多对引物对基因组全序列进行扩增，耗时较长不够方便高效。

技术实现要素：

为解决上述现有技术中并没有利用dna条形码技术对梭子蟹科进行鉴定的方法，本发明提供了一种可以高效快捷扩增多种梭子蟹科线粒体coi基因的通用引物，并提供其设计和扩增方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种梭子蟹科线粒体coi基因通用引物，所述的梭子蟹科线粒体coi基因通用引物能够一次性批量扩增梭子蟹科线粒体coi基因，其正向引物为seqidno.1：5’-tcnacaaaycataaagayatygg-3’，反向引物为seqidno.2：5’-tanacytcwggrtghccraaraayca-3’。

作为优选，所述的梭子蟹科包括钝齿蟳、晶莹蟳、斑蟳、双斑蟳、善泳蟳、蓝蟹、锯缘青蟹、拟穴青蟹、远海梭子蟹以及红星梭子蟹。

一种如前所述的梭子蟹科线粒体coi基因通用引物的设计，从genbank数据库中下载目前所有已经公布的梭子蟹科coi基因序列，对这些序列进行多重比对，找出比较保守的区域以及变异较大的区域，在两段保守区域设计通用引物，扩增出中间的变异序列，通用引物扩增长度为600-700bp。

一种前所述的梭子蟹科线粒体coi基因通用引物的扩增方法，所述梭子蟹科线粒体coi基因通用引物的扩增方法包括以下步骤：

（1）dna抽提试剂盒法提取待测梭子蟹科线粒体coi基因；

（2）采用权利要求1中所述的梭子蟹科线粒体coi基因通用引物；

（3）以梭子蟹科线粒体coi基因为模版，进行pcr扩增；

（4）扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒法割胶回收扩增片段，进行测序。

作为优选，步骤（3）所述pcr扩增的反应体系组成为：2.5mm的dntp2μl、10×taqdna聚合酶buffer2.5μl、10μm的正向引物seqidno.1和反向引物seqidno.2各1μl、5u/μl的taqdna聚合酶0.2μl、100g/μl的dna模版溶液1μl及灭菌双蒸水17.3μl。

作为优选，所述的步骤（3）中的pcr扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。

作为优选，所述的待测梭子蟹科包括钝齿蟳、晶莹蟳、斑蟳、双斑蟳、善泳蟳、蓝蟹、锯缘青蟹、拟穴青蟹、远海梭子蟹以及红星梭子蟹。

本发明的有益效果是：

1）本发明提供的梭子蟹科线粒体coi基因通用引物，可以一次性高效批量对多种梭子蟹科进行扩增，能够为梭子蟹科物种鉴定提供极大的便利；

2）本发明在梭子蟹科线粒体coi基因两段保守区域设计通用引物，扩增出中间的变异序列，扩增长度在600-700bp左右，既有足够的信息位点用于物证鉴定区分，又能保证一个测序反应就能完成，操作简单，节约成本。

附图说明

图1为本发明所提供的梭子蟹科coi扩增效果图。

其中：m：dl2000；1：钝齿蟳（charybdishellerii）；2晶莹蟳（charybdislucifera）；3锈斑蟳（charybdisferiatus）；4双斑蟳(charybdisbimaculata)；5善泳蟳（charybdisnatator）；6：蓝蟹（callinectessapidus）；7锯缘青蟹（scyllaserrata）；8拟穴青蟹(scyllaparamamosain)；9远海梭子蟹（portunuspelagicus）；10红星梭子蟹(portunussanguinolentus）。

具体实施方式

主要材料、试剂和仪器设备：

软件及序列资源：premierprimer5.0引物设计软件（下载自生物软件网http://www.bio-soft.net/），海水鱼类线粒体基因组序列资源（下载自ncbi中genbank数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），序列分析软件mega5.0（下载自生物软件网http://www.bio-soft.net/）。

pcr扩增检测相关试剂仪器：海洋动物基因组dna提取试剂盒（tiangen，北京），琼脂糖凝胶dna回收试剂盒（tiangen，北京），常规台式离心机（thermo），bio-radc1000tmthermalcycler扩增仪器（bio-rad，美国），微量移液器（enppdorf，德国），96孔pcr板（axygen），dntp（tiangen，北京），10×taqdna聚合酶buffer（tiangen，北京），taqdna聚合酶（tiangen，北京），灭菌双蒸水，dl2000dnamarker（tiangen，北京），琼脂糖（biowest，香港），电泳仪（dyy-6c型，北京六一），凝胶成像仪（bio-radgd2000，美国）。

克隆测序相关试剂仪器：高压蒸气灭菌锅（sanyo，日本），加氨苄（amp）抗生素的灭菌lb培养基，lb固体培养平皿（上海生工），超净工作台（sw—cj—1g型，名牌之星，中国），恒温水浴锅（上海精宏），dh5α感受态细胞（tiangen），amp抗生素（上海生工），5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷（上海生工），异丙基硫代-β-d-半乳糖苷（上海生工），pgem-t载体（promega，美国），恒温培养箱（ph070a型，上海一恒科学仪器有限公司），恒温振荡摇床（培英，太仓市实验设备厂）自动dna测序仪（abi3730型，美国）。

实施例中未注明具体条件的实验方法，是按照常规条件，例如sambrook等作者的分子克隆实验室手册（newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989）中所述的条件，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1

1、梭子蟹科线粒体coi基因通用引物及设计和扩增方法

（1）梭子蟹科样品的采集、鉴定和保存

实施例中所用梭子蟹科样品均采自野外自然环境中，所采标本均带回实验室进行信息登记，均用体视显微镜鉴定，以确定种类。种类鉴定好的梭子蟹科样品用100%的纯酒精浸泡并保存于4℃的冰箱中备用。所采集的梭子蟹科种类包括：钝齿蟳、晶莹蟳、斑蟳、双斑蟳、善泳蟳、蓝蟹、锯缘青蟹、拟穴青蟹、远海梭子蟹以及红星梭子蟹。

（2）梭子蟹科线粒体coi基因的提取

采用dna抽提试剂盒法提取待测头足类样品线粒体coi基因，提取的线粒体coi基因保存于-20℃条件下备用。

（3）梭子蟹科线粒体coi基因的通用引物的设计和合成

从genbank数据库中下载目前所有已经公布的头足类物种coi基因序列，对这些序列进行多重比对，找出比较保守的区域以及变异较大的区域，并在两段保守区域设计通用引物，扩增出中间的变异序列。所合成的通用引物为：

正向引物seqidno.1所示：5’-tcnacaaaycataaagayatygg-3’

反向引物seqidno.2所示：5’-tanacytcwggrtghccraaraayca-3’。

（4）pcr扩增线粒体coi基因

pcr扩增的反应体系组成为：2.5mm的dntp2μl、10×taqdna聚合酶buffer2.5μl、10μm的正向引物seqidno.1和反向引物seqidno.2各1μl、5u/μl的taqdna聚合酶0.2μl、100g/μl的dna模版溶液1μl及灭菌双蒸水17.3μl；

pcr扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。

（5）pcr产物的序列测定

pcr产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳图谱如图1所示，均得到大小在600～700bp之间的片段，所扩增的片段均采用试剂盒法割胶回收，对回收产物进行测序，测序结果与genbank上同源序列进行比较，证实为头梭子蟹科粒体coi基因的扩增产物。

测序所得结果如下：

钝齿蟳（charybdishellerii）的测序结果如seqidno.3所示：

5’-atagttggaacatcattaagattaattattcgagcagaattaggtcaaccaggtactttaattggcaatgatcaaatttacaatgtcgtagttacagctcatgcatttgttataattttctttatagttatgccaattatgattggaggatttggtaattgactcgtacctttaatattaggagcccctgatatagcattccctcgaataaataatataagattctgactccttcctccctcactaactttactattaataagaggaatagttgaaagaggtgttggtaccggttgaacagtataccctcccttagcggctgccatcgcccatgcaggtgcctctgtagatctaggaattttctctcttcatttagcaggtgtttcttctattttaggggccgttaattttataacaactgttattaatatacgctcctttggtataagtatagaccaaatacctttatttgtttggtcagttttcattactgcaatccttctacttctgtcacttcctgtattagctggcgctattactatactattaacagaccgaaatttaaatacttcattctttgatcctgctggaggaggagaccccgttctttaccaacatttattttgattttttggcaccc-3’。

晶莹蟳（charybdislucifera）的测序结果如seqidno.4所示：

5’-atagttggaacatcattaagactaattattcgagcagagttaggtcagccaggaacgttaattggtaatgaccagatttataatgttgtagtcacagctcatgcatttgtcataatttttttcatagttataccaattataattggagggtttggtaattgacttgtacctttaatattaggagctcctgatatagcctttccccgtataaacaatataagattctgactccttcctccttcattaactttactattaataagtggtatagtcgaaagaggtgtaggtactggttggacagtttatcctcctctagcagctgctattgcccacgcaggggcctctgtagatttgggaattttctctcttcacttagcaggggtttcttctattttaggagccgttaatttcataacaactgttattaatatacgttccttcggtataagtatagatcaaatacctttatttgtttgatcagtcttcattactgcaattctccttttactttcacttcctgttctagccggagctattactatattactaacagatcgaaacttaaatacttcattttttgatcctgctgggggaggggaccctgttctttatcaacatttattctgattttttggccccc-3’。

锈斑蟳（charybdisferiatus）的测序结果如seqidno.5所示：

5’-atggttgggacatcattaagactaattattcgagccgaactaggtcaaccaggtaccctaattgggaatgatcaaatttataatgttgttgttactgcccatgcatttgttataattttctttatagttataccaattataattggaggatttggtaactgacttgtacctttaatattaggagctcctgatatagcatttcctcgtataaataatataagattttgacttcttcctccttctttaacattactcctaataagagggatagttgaaagaggtgtcggtactggatgaaccgtgtaccctcctttagcagccgctattgcccacgcaggtgcttctgttgatcttggtattttctctcttcacctggccggtgtttcctctattttaggagctgtaaattttataactactgttattaacatacgctcttttggtataagaatagatcaaatacctctatttgtatgatcagtatttattaccgcaattctccttttattatctctccctgtcctggctggagctattactatattattgacagaccgtaatttaaatacttcattttttgatcctgcaggaggaggagatcctgttctctaccaacacttattttgattttttggtcccc-3’。

双斑蟳(charybdisbimaculata)的测序结果如seqidno.6所示：

5’-atagttggaacttctttaagattaattattcgagctgaacttggtcaacccggaaccttaattggtaatgatcaaatttataatgttgtagttacagcacacgcatttgttataattttcttcatagttataccaattataattggaggatttggaaactgacttgttcctttaatacttggggctcctgatatagcattccctcgtataaataatataagattttgacttctacctccttctttaactttattattaataagaggaatggttgaaagaggtgtaggtaccggatgaacagtttaccctcctttggcagctgccattgctcatgcaggtgcctctgtagatttaggtattttttctcttcatcttgcaggtgtttcttctattttaggagctgtaaattttataactactgttattaatatacgatcttatggtataacgatggatcaaatacccttatttgtctgatcagttttcattaccgctattcttcttcttttatcattacccgttttagctggagctattacaatactattaactgatcgtaatttaaacacttcattttttgatcctgccggaggtggagaccctgttctttatcaacatttattctgattttttggtcatc-3’。

善泳蟳（charybdisnatator）的测序结果如seqidno.7所示：

5’-atagtagggacatcactaagattaatcattcgagcagaactcggacagcccggaactctaattggaaatgatcaaatttataatgttgtagttacagcacacgcatttgttataattttctttatagttataccaattataattggaggatttggtaattgactagtacccttaatattaggagcccccgatatagcatttcctcgaataaataatataagattctgacttttacctccttccttaactctattattaataagaggtatagttgaaagaggtgtaggtacaggatgaactgtttaccctcctttagctgctgctattgcccatgcaggagcttctgtagatttgggaattttttctctccatctagcaggtgtatcttctattttaggggccgttaatttcataacaactgttattaatatacgttctttcggaataactatagaccaaatacctttattcgtttgatctgtgtttattactgctattctccttcttttatcccttcccgtcttagccggagcaattactatactattaactgatcgtaatttaaatacttctttctttgatcctgctggaggaggagatcctgttctctatcaacatttattttgattttttggtcacc-3’。

蓝蟹（callinectessapidus）的测序结果如seqidno.8所示：

5’-atagtaggtacatcacttagtttaatcattcgagctgaactaggacaacctggaacccttattggaaacgaccaaatttataacgttgtagtcacagctcacgcctttgttataattttcttcatggttatacctattataattggaggatttggtaattgactagttccccttatactaggagctcctgatatagccttcccacgaataaataacataagattctgactcctacctccatcactaactctattactaataagaggtatggtcgaaagtggagttggtacaggatgaactgtttaccctccccttgctgctgctattgctcacgcaggggcctcagttgatcttggtattttctctctccacttagctggtgtatcatcaattctaggggctgttaactttataactaccgttattaatatacgttcatttggtataagaatagaccaaatacctttattcgtttgatctgtatttattaccgctattcttctacttctttctctacctgtattagcaggtgctattactatacttctcactgatcgaaacttaaatacctcattcttcgacccagctggaggaggcgaccctgttctctaccagcatctattctgatttttcggacatc-3’。

锯缘青蟹（scyllaserrata）的测序结果如seqidno.9所示：

5’-atagtagggacttcattaagtctaattatccgtgctgaattaggacagccaggtacacttattggcaacgatcaaatctataatgttgttgttaccgctcatgcttttgttataatctttttcatagttataccaattataattggaggatttggtaattgattagttccacttatactaggagctcctgatatagcttttcctcgtataaataatataagattctgacttttacctccatctctaactctattattaataagaggtatagtagaaagaggagttggtacaggttgaactgtttatccacctttagcagcagctattgcccatgcaggtgcttcagtcgaccttggtattttttcgctccatcttgcaggtgtctcttcaatccttggtgcagttaattttataactactgtaattaatatacgatctttcggtataagaatagaccaaatacctttattcgtttgatctgttttcattacggcaattcttcttcttttatccctaccagttctagcaggagcaatcactatacttttaaccgaccgaaatcttaatacatcattttttgaccctgctggtggtggagaccctgtcttatatcaacacttattctgattttttggtcacc-3’。

拟穴青蟹(scyllaparamamosain)的测序结果如seqidno.10所示：

5’-atagtaggaacctcattaagtttaattattcgtgctgaactaggacaaccaggaacacttattggtaatgatcaaatttataatgttgttgttaccgctcatgctttcgttataatcttttttatagttataccaattataattggaggatttggtaattgactagtcccccttatattaggagcccctgacatagcattccctcgtataaacaatataagattttgactcttacccccatctctgactctattattaataagaggtatagtagaaagaggtgtcggcacaggttgaactgtctatcccccactagcagcagctattgcccatgcaggggcttcagtcgatctaggtattttctcacttcatcttgcaggtgtctcttctattcttggtgcagttaattttataacaactgtaattaatatacgatcttttggtataagaatagaccaaatacctttatttgtttgatctgtatttattactgcaattctcttacttttatccttaccagttctagcaggagcaattactatacttctaaccgatcgaaaccttaatacatcattttttgaccctgctggcggtggagaccctgttttgtaccagcatttattctgattctttggtcacc-3’。

远海梭子蟹（portunuspelagicus）的测序结果如seqidno.11所示：

5’-atagtagggacttcacttagtctgattattcgagcagaactaggtcaacctggtactcttattggtaatgaccaaatttacaatgttgtagttacagctcatgcttttgtgataattttctttatagttataccaattatgattggaggatttggtaactgactagtaccattaatgctaggagcccctgatatggcttttcctcgtatgaacaacataagattttgacttctccctccttctttaactctacttcttataagaggtatggtagaaagaggtgttggtacaggctgaaccgtctatcctcctctttcggcagcgatcgctcacgcaggagcttctgtagatctgggtattttctctttacatctagcaggtgtttcctctattttaggtgcagtaaatttcataaccaccgttattaatatgcgatcttttgggataagaatagaccaaataccattattcgtttgatcagtatttatcactgctattcttctccttttatctctccctgttcttgctggagctattactatgcttcttacagatcgaaatctcaatacttcattctttgaccctgccggtggtggagaccctgtactctaccaacacttattttgattttttggtcccc-3’。

红星梭子蟹(portunussanguinolentus）的测序结果如seqidno.12所示：

5’-atagtaggaacctcactaagtctgatcattcgagctgagttagggcagccaggaactcttattggtaacgatcaaatttataacgttgttgtcaccgctcatgcctttgttataattttctttatagttataccaattataattggtggatttggtaactgacttgtacccttaatgcttggggcccctgatatagcattccctcgtataaataatataagattttgactccttcctccctcactcaccctccttcttataagaggtatggttgaaagtggtgtaggtactggttgaactgtctaccctcctcttgctgccgctattgcccacgctggagcttcagtcgatttggggattttctccttgcatttagctggtgtgtcctctattctaggtgccgtaaactttataactactgtaattaacatacgatccttcggcataagaatggaccagataccgttatttgtgtgatcagtcttcattaccgctattctgctccttctctccctacctgttcttgcaggagctattactatgcttttaacagatcgtaacctcaacacctccttctttgatcctgcaggtggtggagaccctgttttatatcaacacttattctgattttttggtcccc-3’。

序列表

<110>浙江海洋大学

<120>一种梭子蟹科线粒体coi基因通用引物及设计和扩增方法

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>正向引物(primer-f)

<400>1

tcnacaaaycataaagayatygg23

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>反向引物(primer-r)

<400>2

tanacytcwggrtghccraaraayca26

<210>3

<211>640

<212>dna

<213>钝齿蟳(charybdishellerii)

<400>3

atagttggaacatcattaagattaattattcgagcagaattaggtcaaccaggtacttta60

attggcaatgatcaaatttacaatgtcgtagttacagctcatgcatttgttataattttc120

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<210>4

<211>640

<212>dna

<213>晶莹蟳(charybdislucifera)

<400>4

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attggtaatgaccagatttataatgttgtagtcacagctcatgcatttgtcataattttt120

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<210>5

<211>640

<212>dna

<213>锈斑蟳(charybdisferiatus)

<400>5

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attgggaatgatcaaatttataatgttgttgttactgcccatgcatttgttataattttc120

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<210>6

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<212>dna

<213>双斑蟳(charybdisbimaculata)

<400>6

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attggtaatgatcaaatttataatgttgtagttacagcacacgcatttgttataattttc120

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<210>7

<211>640

<212>dna

<213>善泳蟳(charybdisnatator)

<400>7

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attggaaatgatcaaatttataatgttgtagttacagcacacgcatttgttataattttc120

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<210>8

<211>640

<212>dna

<213>蓝蟹(callinectessapidus)

<400>8

atagtaggtacatcacttagtttaatcattcgagctgaactaggacaacctggaaccctt60

attggaaacgaccaaatttataacgttgtagtcacagctcacgcctttgttataattttc120

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cctgttctctaccagcatctattctgatttttcggacatc640

<210>9

<211>640

<212>dna

<213>锯缘青蟹(scyllaserrata)

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<213>拟穴青蟹(scyllaparamamosain)

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<213>远海梭子蟹(portunuspelagicus)

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<213>红星梭子蟹(portunussanguinolentus)

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