本发明涉及一种二萜类化合物的制备方法，特别涉及该二萜类化合物在制备抗丙型肝炎病毒药物中的应用。
背景技术：
粘小奥德磨（oudemansiellamucida<schradexfr.>），别名粘长根菇，白环菌，白粘密环菌。隶属担子菌纲（basidiomycetes）伞菌目（agaricales）白蘑科（tricholomataceae）小奥德蘑属（oudemansiella）。其形态特征为：子实体中等，白色。菌盖直径4-10cm，半球形至渐平展，水浸状，粘滑或胶粘，边缘具稀疏而不明显条纹。菌肉白色，软，薄。菌褶白色，略带粉色，直生至弯生，宽，稀，不等长。菌柄长4-6cm，粗0.3-1cm，白色，圆柱形，基部膨大带灰褐色，纤维质，内实。菌环生柄的上部，白色，膜质。孢子印白色。孢子无色，光滑，近球形，16-22.9µm×15-20µm。褶缘和褶侧囊体无色，梭形至长筒形，顶端钝圆，65.7-113.8µm×17.7-20.2µm。生态习性：夏秋季生。南方可春冬季在树桩或倒木、腐木上群生或近丛生，有时单生，可引起木材腐朽。主要分布在河北、山西、黑龙江、福建、广西、陕西、云南、西藏等省。可食用，不过味道较差，并带有腥味。近期的研究表明，该菌种所含的化学成分具有抗菌、抗癌等活性。因而，进一步分离出其中的化学成分，并分析其药理活性具有重要的意义。
萜类化合物是指存在与自然界中、分子式为异戊二烯单位的倍数的烃类及其含氧衍生物。这些含氧衍生物可以是醇、醛、酮、羧酸、酯等。在天然药物化学成分的研究中，萜类成分的研究一直是较为活跃的领域，亦是寻找和发现天然药物生物活性成分的重要来源。二萜类化合物是由4个异戊二烯单位构成、含20个碳原子的化合物类群。它们的结构显示多样性，但都是由焦磷酸香叶基香叶酯（geranylgeranylpyrophosphate,ggpp）衍生而成，几乎都成环状结构。二萜类化合物广泛分布于植物界和微生物界中，许多二萜的含氧衍生物具有多方面的生物活性，有的已是重要的药物。
丙肝病毒全球感染近1亿7千万人，具有很高的发病率（2%–3%）和死亡率。hcv是一种由包膜的正链rna病毒，共有9.6kb基因组。hcv生命周期包括进入宿主细胞、翻译、多聚蛋白加工、rna复制、组装和释放等过程。hcv基因组的翻译提供了3000多个氨基酸的长多聚蛋白，有宿主和病毒蛋白酶进行加工。hcv一般是用核苷类似物利巴韦林（ribavirin）联合人α-干扰素（α-ifn）进行广谱的抗病毒治疗。但患者耐受性差，不能对各型hcv病毒均等起效，由于疗效不佳，副作用大的原因，有必要研发具有抗丙肝病毒活性的新化合物。
技术实现要素：
本发明的目的在于从粘小奥德磨的发酵液中分离出一种二萜类化合物，该二萜类化合物对hcv病毒具有较强的抑制作用。
本发明涉及的二萜类化合物的结构式为：
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
所述化合物从粘小奥德磨菌的发酵液中分离而得。
优选的，所述分离步骤包括：（1）粘小奥德蘑的液体发酵培养；（2）发酵液的提取分离。
优选的，所述粘小奥德蘑的液体发酵培养的方法具体为：将粘小奥德蘑菌种于培养基中进行活化培养，随后取活化好的粘小奥德蘑菌菌丝体进行发酵培养。
优选的，所述发酵液的提取分离的具体方法为：将发酵液进行浓缩，有机溶剂萃取，有机相浓缩后得到的粗提物进行柱层析分离，并经制备型hplc纯化得到目标产物。
优选的，所述培养基为斜面改良pda培养基，发酵培养的条件为：培养温度为20-28℃，优选25℃，转速为130-200rpm，优选180rpm，培养时间为15-25天，优选20天。
优选的，所述有机溶剂为乙酸乙酯，所述柱层析为：先以硅胶柱层析进行分离，后再以凝胶柱lh-20进行分离。
优选的所述柱层析方法具体为：将粗提物首先经硅胶柱层析进行粗分，以正己烷-乙酸乙酯（v/v，100:1至4:1）为洗脱剂进行梯度洗脱，其中的馏分l5再以二氯甲烷-丙酮（v/v，50:1至2:1）作为洗脱剂利用硅胶柱层析进行梯度洗脱分离，获得的洗脱馏分l5-2进一步通过凝胶柱lh-20（溶剂为甲醇）进行分离。
本发明的化合物还具有抗病毒的活性，尤其是具有抗丙型肝炎病毒（hcv）的活性。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点及有益效果：首次从粘小奥德磨中分离得到具有新颖结构的二萜类结构化合物，经活性测试，发现该化合物具有抗丙型肝炎病毒的活性，可作为先导化合物及药物候选物进一步研究开发。
具体实施方式
以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：
本发明实施例中所涉菌种粘小奥德磨购买而得，本发明实施例所用试剂和仪器如无特别说明均为市售商品。
实施例1
1.1粘小奥德蘑的液体发酵培养
粘小奥德磨菌丝体的活化方法：将粘小奥德蘑菌种接种于斜面改良pda培养基中，于25℃活化培养10天，直至培养基上长满菌丝体。改良pda培养基：每升培养基含200g土豆，20g葡萄糖，16g琼脂粉，5g蛋白胨，1.5g硫酸镁，3g磷酸二氢钾，10mgvb1。
发酵培养：取活化好的粘小奥德蘑菌菌丝体挖块接种于装有120ml液体培养液的500ml锥形瓶中，并在25℃下于旋转振荡器上以180rpm旋转温育20天，发酵共得20l发酵液。液体培养液：不加琼脂，其余同改良pda培养基。
1.2化合物的提取分离
将步骤1.1中所得发酵液用旋转蒸发仪45℃下减压浓缩至2l，然后用同体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯萃取相利用旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩得到粗提物21.8g。粗提物首先经硅胶柱层析进行粗分，以正己烷-乙酸乙酯（v/v，100:1至4:1）为洗脱剂进行梯度洗脱，依次获得8个馏分l1-l8。然后馏分l5再以二氯甲烷-丙酮（v/v，50:1至2:1）作为洗脱剂利用硅胶柱层析进行梯度洗脱分离，依次获得10个馏分l5-1至l5-10。将二氯甲烷-丙酮（v/v，20:1）洗脱馏分l5-2（1.2g）通过凝胶柱lh-20（溶剂为甲醇）后进一步用制备型hplc（70%甲醇水溶液）纯化得到化合物1（7.1mg，tr23.5min）。
化合物1的理化性质：c25h36o6，白色固体，熔点为75-77℃，1h和13cnmr（cdcl3）数据见表1。
表1：化合物1的nmr数据
实施例2
2.1粘小奥德蘑的液体发酵培养
粘小奥德磨菌丝体的活化方法：将粘小奥德蘑菌种接种于斜面改良pda培养基中，于25℃活化培养10天，直至培养基上长满菌丝体。改良pda培养基：每升培养基含200g土豆，20g葡萄糖，16g琼脂粉，5g蛋白胨，1.5g硫酸镁，3g磷酸二氢钾，10mgvb1。
发酵培养：取活化好的粘小奥德蘑菌菌丝体挖块接种于装有120ml液体培养液的500ml锥形瓶中，并在28℃下于旋转振荡器上以150rpm旋转温育15天，发酵共得20l发酵液。液体培养液：不加琼脂，其余同改良pda培养基。
2.2化合物的提取分离
同实施1中的方法分离得到了化合物1。
实施例3
3.1粘小奥德蘑的液体发酵培养
粘小奥德磨菌丝体的活化方法：将粘小奥德蘑菌种接种于斜面改良pda培养基中，于25℃活化培养10天，直至培养基上长满菌丝体。改良pda培养基：每升培养基含200g土豆，20g葡萄糖，16g琼脂粉，5g蛋白胨，1.5g硫酸镁，3g磷酸二氢钾，10mgvb1。
发酵培养：取活化好的粘小奥德蘑菌菌丝体挖块接种于装有120ml液体培养液的500ml锥形瓶中，并在20℃下于旋转振荡器上以130rpm旋转温育25天，发酵共得20l发酵液。液体培养液：不加琼脂，其余同改良pda培养基。
3.2化合物的提取分离
同实施1中的方法分离得到了化合物1。
实施例4
在本实施例中，对化合物1的体外抗hcv活性进行评价，采用人肝癌细胞株huh7.5.1进行体外细胞水平抗hcv活性评价，活性评价方法采用本领域通用的方法，具体如下所述：
mtt法检测药物细胞毒性：取对数生长期的huh7.5.1细胞，9×103个细胞/孔铺于96孔板，贴壁5小时后，加入2μldmso梯度稀释药物，5倍稀释，5个稀释度，每个梯度设有三个重复孔，终体积200μl/孔。将培养板置于37℃、5％co2培养箱进行培养。第三天于实验孔加入20μl的5mg/mlmtt溶液，37℃、5％co2孵育4小时。弃去上清，加入150μl/孔的dmso，振荡溶解10分钟后，于酶标仪上测定od490的值，并以graphadprism5.0计算药物ic50(ic50：半数抑制浓度，将细胞生长抑制50％所需的浓度)的值。计算公式为细胞生长抑制率(％)＝(1-试验孔od值/对照孔od值)×100％。
hcv复制抑制试验：取对数生长期的huh7.5.1细胞，以9×103个细胞/孔铺于96孔板，贴壁5小时后，加入2μldmso梯度稀释药物，5倍稀释，5个稀释度，每个梯度设有三个重复孔，同时加入病毒，终体积200μl/孔。将培养板置于37℃、5％co2培养箱进行培养，3天后收集上清3000rpm/min离心10min，取澄清上清进行rna载量检测。以graphadprism5.0计算hcv复制抑制率及ec50(ec50：半数效应浓度，引起受试对象50％个体产生一种特定效应的药物剂量)。计算公式为hcv复制抑制率(％)＝(1-试验孔hcvrna载量/对照孔hcvrna载量)×100％。
抗hcv药效评价：治疗指数(therapeuticindex，ti)为药物对细胞的半数抑制浓度ic50和对病毒的半数效应浓度的比值，比值越高，表明药物的安全性越高。
经检测，化合物1的ic50（μg/ml）、ec50（μg/ml）分别为15.26、0.1589，,ti值为96.03。可见，该化合物对hcv病毒复制具有明显抑制作用，并具有一定的安全性，可作为抗hcv的先导化合物及药物候选物进一步研究开发。
申请人声明，本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，只要其在不脱离本发明的精神，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。