鉴定梨和苹果属间杂交种的分子标记引物组合物及其应用的制作方法

本发明属于分子遗传育种领域，提供了鉴定梨和苹果属间杂交的分子标记引物组合物及其应用。

背景技术：

苹果(malusdomesticaborkh)和梨(pyrusl.)属于蔷薇科，是世界性栽培的重要果树树种，同时我国是梨和苹果最主要的起源地，具有非常悠久的栽培历史，而且遗传多样性丰富，有不少地方品种品质优良，仍是目前的主栽品种。但是随着经济发展和人民生活水平的不断提升，市场需要更加丰富和高品质的梨和苹果的品种以满足消费需求。

远源杂交，作为一种突破本种群基因库、从其他物种中获得优异遗传物质的育种方法，可以使基因组的遗传组成丰富扩大，形成杂种优势，更有利于创新优质新品种。因此，远源杂交培育新品种长期以来都是果树育种工作者关注的研究方向。但是，远缘杂交的成功率并不高，而杂交育种往往面临着大量的栽培管理和财力、物力投入，那么如何从产生的杂交配组中尽早鉴定出具有优异性状的真正的杂交后代，实现早期预测，显得尤为重要。

在传统的远源杂交后代鉴定方法中，通常包括形态鉴定、染色体鉴定、同工酶标记鉴定、分子标记鉴定。一般依据形态学观察的方法，通常主要根据叶、花、果实的形态特征来进行鉴定，虽然方法上简单直观，但是鉴定过程受观察者主观影响的因素较大；同时，观察指标往往受外界环境因素影响，也会干扰鉴定结果；而果树通常具有5-8年的童期，针对果实形态的观察要等待较长的时间，难以在短时间内得到鉴定。采用染色体鉴定方法，具有染色体数目差异的物种容易得到鉴定，然而梨和苹果同属蔷薇科，具有相同的染色体条数(2n＝34)，难以区分。同工酶标记的方法曾经应用于鉴定远缘杂交品种，但是其多态位点少，操作繁琐费时，制约了其发展。

随着高通量测序技术的兴起，蔷薇科果树，例如草莓、苹果、梨、梅、桃等物种都已公布了从头组装的全基因组测序数据和基因注释信息，为我们获得多年生果树完整的遗传信息、在全基因组层面科学解析物种特征提供了更加快捷的途径；同时，dna分子标记技术具有遗传稳定、标记数量丰富、不影响目标性状表达、多态性高等优点，因此近年来在分子鉴定中得到了迅速发展和利用，因此利用全基因组遗传信息进行物种特异的分子标记开发，成为高效、准确的解析植物遗传密码的有效方法。

本研究通过利用梨和苹果基因组的差异片段设计特异引物，筛选并开发出了新型的梨和苹果属间特异引物，来鉴定属间杂交种的真实性，达到在杂交苗的幼苗期就能成功鉴定远缘杂交种的目的，从而大大减少了杂种苗的培育和人力物力耗费，进一步推动了分子标记技术在远缘杂交育种鉴定中的应用，提高了育种效率。

技术实现要素：

本发明的主要目的是通过探究梨和苹果的全基因组差异序列，提供基于基因组特异序列鉴定梨和苹果属间杂交种的分子标记引物组合物。

本发明的另一目的是提供该分子标记引物组合物的应用。

本发明的又一目的是提供一种鉴定梨和苹果属间杂交种的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

基于基因组特异序列鉴定梨和苹果属间杂交种的分子标记引物组合物，所述的引物组合物由在梨中能扩增出特异条带而在苹果中不能扩增出特异条带的引物对和在苹果中能扩增出特异条带而在梨中不能扩增出特异条带的引物对组成；所述的在梨中能扩增出特异条带而在苹果中不能扩增出特异条带的引物对选自p13：seqidno.1/seqidno.2、p31：seqidno.3/seqidno.4、p33：seqidno.5/seqidno.6中的任意一对；所述的在苹果中能扩增出特异条带而在梨中不能扩增出特异条带的引物对选自a31：seqidno.7/seqidno.8、a33：seqidno.9/seqidno.10、a34：seqidno.11/seqidno.12、a37：seqidno.13/seqidno.14中的任意一对。

所述的基于基因组特异序列鉴定梨和苹果属间杂交种的分子标记引物组合物优选由引物对p33和a31、p31和a31或p33和a33组成。

本发明所述的分子标记引物组合物在鉴定梨和苹果属间杂交种中的应用。

一种鉴定梨和苹果属间杂交种的方法，包括提取杂交种、父、母本dna，以权利要求1～2中任一项所述的分子标记引物组合物进行pcr扩增，按照扩增产物的琼脂糖凝胶电泳中父本、母本和子代杂交种中在目的片段位置出现苹果特异带型、梨特异带型的情况，以判断杂交种是否属于梨和苹果属间杂交种，判断标准为：苹果中只出现苹果的特异条带，梨中只出现梨的特异条带，子代中梨和苹果特异条带均出现的是真实梨和苹果属间杂交种；只出现苹果特异性条带或者梨特异性条带的是假的杂交种；其中，父本和母本独立的选自梨或苹果，且二者为不同物种。

本发明所述的鉴定梨和苹果属间杂交种的分子标记引物组合物的开发方法，包括：

(1)对苹果基因组序列与西洋梨基因组序列进行全局比对；将苹果基因组序列无法比对上西洋梨的序列提取出来；再将西洋梨基因组序列无法比对上苹果的序列提取出来，对各自提取出来的特异序列进行过滤，选取特定序列长度为150bp-500bp，将提取出来的150bp-500bp的特异序列分别比对到苹果和西洋梨基因组上验证其特异性；将苹果的特异序列比对到西洋梨基因组上，如果能比对上，则删除；在比对到苹果基因组上，若不是唯一匹配，则删除；同理，西洋梨的特异序列也执行相同删选；最终得到苹果和西洋梨的高度可信的特异序列，进而设计引物；其中，所述的基因组差异序列，苹果基因组品种为‘金冠’，所述的梨基因组品种为‘考密斯’；

(2)在上一步获得的苹果与梨基因组的特异序列中，选取250bp大小的特异片段，使用primer5设计特异引物，初步验证引物特异性，随后筛选出的特异引物进行pcr扩增，同时扩增杂交种父母本，设置对照组，使用通用引物扩增父母本作对照，利用通用引物扩增，当父母本均可扩增出条带时，表明实验所用的dna可用于pcr扩增。同时，筛选出只在父母本的苹果或梨品种中能扩增出条带的引物，即为特异性引物；重复至少3次，以确保引物特异性。

所述的pcr扩增的实验体系，优选采用20μl，包含0.6μl30-50ng/ul的模板dna，正、反向引物各0.8μl,mix(taqdnapolymerase、mg²⁺、dntp)10μl，ddh2o7.8μl。pcr反应程序为：94℃变性3min；39个循环包括94℃变性40s，60℃退火50s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；25℃冷却10min。

有益效果

(1)本发明首次对梨和苹果基因组进行序列全局比对的方法检测差异序列，p-value设置为1e-5，通过筛选150bp-500bp特异区间长度序列，过滤并删除非单一比对区间，可信度高，这为实现属间杂交种的鉴定奠定了重要的基础和必要的前提。

(2)本发明在梨和苹果基因组差异序列上设计分子标记特异引物，新开发的引物特异性好，区分度高，结果稳定可靠，七对特异性引物可以在梨和苹果上进行很好的分型，为梨和苹果的属间杂交种的鉴定预先选择提供了可靠的分子标记来源，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。

附图说明

图1为苹果、梨的特异引物pcr扩增条带。新开发的p13、p31、p33、a31、a33、a34、a37七对特异引物在‘砀山酥梨’(梨)、‘考密斯’(梨)、‘金冠’(苹果)、‘红星’(苹果)、‘富士’(苹果)上的pcr扩增的特征条带，对苹果、梨进行很好的分型鉴定，以p开头的为梨上的特异引物，以a开头为苹果上的特异引物。

图2为新开发引物在‘金冠’ב砀山酥梨’上的杂交后代鉴定。苹果上的特异引物a31和梨上的特异引物p33可以利用特征条带，对苹果、梨、属间杂交后代进行很好的分型鉴定，在杂交后代中同时具有母本‘金冠’和父本‘砀山酥梨’的代表性特征谱带，以p开头的为梨上的特异引物，以a开头为苹果上的特异引物。

图3为新开发引物在‘红星’ב考密斯’上的杂交后代鉴定。苹果上的特异引物a31和梨上的特异引物p31可以利用特征条带，对苹果、梨、属间杂交后代进行很好的分型鉴定，在杂交后代中同时具有母本‘红星’和父本‘考密斯’的代表性特征谱带，以p开头的为梨上的特异引物，以a开头为苹果上的特异引物。

图4为新开发引物在‘富士’ב考密斯’上的杂交后代鉴定。苹果上的特异引物a33和梨上的特异引物p33可以利用特征条带，对苹果、梨、属间杂交后代进行很好的分型鉴定，在杂交后代中同时具有母本‘富士’和父本‘考密斯’的代表性特征谱带，以p开头的为梨上的特异引物，以a开头为苹果上的特异引物。

具体实施方式

实施例1：

基于基因组特异序列鉴定梨和苹果属间杂交种的分子标记，是通过以下方法获得的：

a)利用‘红星’ב考密斯’，‘金冠’ב砀山酥梨’，‘富士’ב考蜜斯’进行属间杂交，分别获得73株、37株、201株——总共311株苹果和梨的f1后代单株。

b)基于ctab法提取出的dna浓度较高，质量较好，提取dna的操作步骤为：

(1)于春季4月份采集父母本和杂交后代的无病虫、干净幼叶，利用自封袋保存，液氮速冻。取100mg叶片，于研钵中加入液氮充分研磨；随后将研磨好的叶片转移到1.5ml离心管中，加入400μlctab缓冲液，充分混匀后放入65℃水浴锅中水浴30min，每隔10min摇匀一次，使叶片细胞在缓冲液中得到充分裂解；

(2)水浴结束后，取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇混合溶液(v:v＝24:1)，在漩涡混合器上震荡5min，充分混匀后使离心机在10000rpm下4℃离心10min，如果需要更纯的dna可以再用氯仿/异戊醇混合溶液(v:v＝24:1)再抽提一次；

(3)用移液器小心吸取上清液，转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置在-20℃冰箱中低温静止20min，直至出现絮状沉淀后，在10000rpm下室温离心10min；

(4)小心去除上清液，沉淀用70％的乙醇重复洗涤3次，最后彻底去除乙醇后，静置干燥；

(5)加入40μl超纯水溶解，65℃水浴15min促溶；

(6)加入1μlrnaase至dna溶液中，放置在37℃培养箱中孵育1h消除其中的rna；

(7)用移液器轻轻吸取2μldna溶液，将其与2μlloadingbuffer混匀后在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，并利用紫外分光光度计检测dna浓度。

c)通过梨和苹果的全基因组比对，区别获得梨和苹果的特异序列：

(1)首先利用blastn对苹果基因组序列与西洋梨基因组序列进行全局比对；

(2)将苹果基因组序列没有比对上西洋梨的序列(p-value>1e-5)提取出来；再将西洋梨基因组序列没有比对上苹果的序列(p-value>1e-5)提取出来；

(3)对各自提取出来的特异序列进行过滤，只选取序列长度在150-500bp之间的序列；

(4)再次将提取出来的150-500bp的特异序列分别比对到苹果和西洋梨基因组上进行再次验证其特异性，苹果的特异序列比对到西洋梨基因组上，如果能比对上(p-value≤1e-5)，则删除；同时比对到苹果基因组上，若不是唯一匹配，同样删除。与此同时，西洋梨的特异序列也执行相同筛选方法；

(5)最终得到苹果和西洋梨的高度可信的特异序列，进而设计引物。

d)利用获取的梨和苹果的基因组差异序列设计特异性引物

筛选出差异序列后，从中随机挑选250bp大小的片段，使用primer5设计特异引物7对(表1)，初步验证引物特异性。随后筛选出的特异引物进行pcr扩增，扩增杂交种父母本(图1)，同时设置对照组，使用通用引物扩增父母本作对照，通用引物扩增时，当父母本均可扩增出条带时，表明实验所用的dna可用于pcr扩增。同时，筛选出只在父母本的苹果或梨品种中能扩增出条带的引物，即为特异性引物。重复至少3次，以确保引物特异性。

表1梨和苹果基于基因组差异序列设计的特异引物。

e)利用pcr技术对目的片段进行扩增验证

采用的聚合酶链式反应(pcr)体系为20μl，包含0.6μl30-50ng/ul的模板dna，正反引物各0.8μl,mix(taqdnapolymerase、mg²⁺、dntp)10μl，ddh2o7.8μl。pcr反应程序为：94℃变性3min；39个循环包括94℃变性40s，60℃退火50s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；25℃冷却10min。扩增产物保存在4℃冰箱。

琼脂糖凝胶电泳技术流程：

(1)称量：按照pcr产物片段大小要求称量不同质量的琼脂粉；

(2)制胶：将所称量的琼脂粉与1×tae在锥形瓶中混合，在微波炉内加热2～3min至琼脂粉溶解并无气泡，冷却至70℃左右加入微量eb染料，充分混匀，倒入胶槽中，插入梳子，静待凝固；

(3)电泳：琼脂糖凝胶完全凝固后，拔出梳子，放入带有1×tae缓冲液的电泳槽中，取8μl体积的pcr产物，点样，接通电源，120v电泳15分钟左右，在紫外灯下观察琼脂糖凝胶是否存在目标条带并拍照保存。

利用所有7对新开发引物和2对通用引物进行扩增正常，pcr产物符合预测大小。因此，该引物可作为区分鉴定梨和苹果及其杂交后代的分子检测标记。

f)根据标准2000bpdnamarker所指示的大小，按照pcr扩增产物选择清晰的扩增条带进行统计。苹果、梨、属间杂交种鉴定的数据分析可采用以下方法：

使用筛选出的多对特异性引物p33和a31、p31和a31、p33和a33分别扩增父本砀山梨、母本金冠苹果和杂交种子代，按照父母本和子代中在目的片段位置出现苹果特异带型、梨特异带型的情况，以判断扩增的真实性。苹果母本中只出现苹果的特异条带，梨父本中只出现梨的特异条带，子代中梨和苹果特异条带均出现的是真实杂交种；只出现苹果特异性条带或者梨特异性条带的是假的杂交种(图2，图3，图4)。对鉴定的结果进行3次重复，从而分别鉴定苹果、梨、属间杂交种。

序列表

<110>南京农业大学

<120>鉴定梨和苹果属间杂交种的分子标记引物组合物及其应用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agatacattattcgctaatagaccc25

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcagtgctacctcggaaa18

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aaatctccctcacatcactcct22

<210>4

<211>25

<212>dna

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<400>4

ctaatcgtacttctaagcaccatct25

<210>5

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<212>dna

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<400>5

ggcagggcacttagggtt18

<210>6

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<212>dna

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<400>6

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

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