一种高效筛选转基因植株载体的构建方法与流程

本发明涉及基因工程遗传育种学和生物遗传改良技术领域，特别涉及一种高效率从转基因水稻细胞快速筛选的方法。

背景技术：

水稻作为世界上超过一半人口的主食，是最重要的粮食作物之一.在过去的半个多世纪里，水稻育种取得了巨大的成功.水稻的单位产量实现了倍增，部分地方甚至提高至3倍，这为保障世界粮食安全作出了巨大的贡献。

但近十几年来水稻的产量停滞不前，这一方面是由于在育种技术上没有新的突破以及遗传多样性在栽培品种中的逐步变窄，另一方面也是因为频繁发生的病虫害以及旱灾等自然灾害使得水稻生产损失惨重.然而，世界人口的持续增长以及社会经济的快速发展导致对粮食的需求不断增加。

针对这些问题，我国学者提出了培育绿色超级稻的设想，围绕水稻抗病虫、抗旱、营养高效利用、优质、高产等五大重要性状，对水稻品种进行全面改良以实现农业的可持续发展。而转基因技术作为一种新兴的育种手段，在实现绿色超级稻目标上将发挥重要作用。

水稻的转基因研究始于20世纪80年代末期，迄今已有大量的转基因水稻研究被报道。

水稻转基因技术始于原生质体培养，1985年首次成功地从水稻原生质体再生完整植株；1988年在粳稻品种中获得第一批转基因水稻植株；1990年从籼稻品种chinsurahboroii中获得第一例转基因籼稻植株；1990年李宝健等用农杆菌感染水稻组织获得转化愈伤组织；1991年利用水稻幼胚作为受体材料，用基因枪法，成功获得转基因植株，并且转化效率明显提高。

从此，幼胚作为转基因受体材料得到广泛研究应用。1993年用农杆菌法在粳稻品种上获得了转基因植株，此后，基因枪轰击法和农杆菌介导法作为最有价值的转化途径广泛用于水稻转基因研究。

利用转基因方法获得的转基因植株及其产生的后代，怎么证明外源基因已转入受体，或稳定遗传？主要分以下几个层次鉴定：

1).外源基因整合的鉴定，主要有southern杂交和pcr法检测阳性。

2).外源基因转录水平的鉴定，有northern杂交和rt-pcr(reversetranscribedpcr)检测法。

3).外源基因表达蛋白的检测，主要有三种：①生化反应检测法：主要通过酶反应来检测；②免疫学检测法：通过目的蛋白(抗原)与其抗体的特异性结合进行检测，如western杂交；③生物学活性的检测。

4).报告基因的酶法检测，常用的报告基因有：gus、nos、ocs等。

当然最后转基因植株必须移栽于大田，进行田间鉴定，不仅对改良性状还要对其它农艺性状进行评价，选育综合性状优良的株系。这样会花费大量的财力和人力，而且会花费较长的时间。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种高效筛选转基因植株载体的构建方法。本发明方法将潮霉素抗性基因与红色荧光基因进行连锁后转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织，在愈伤组织细胞培养筛选阶段加入潮霉素，同时结合红色荧光检测，快速、有效的的筛选。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种高效筛选转基因植株载体的构建方法，包括以下步骤：

a、dsred基因的获得；

b、dsred基因连接到pcambia1300植物双元表达载体上。

所述步骤b进一步包括：

第一步，以含有dsred片段的pgdr质粒为模板，利用引物进行扩增，获得dsred片段；

第二步，pcambia1300双元载体双酶切处理；

第三步，将引入xbai和bamhi酶切位点的dsred片段插入到双酶切后的pcambia1300双元载体上；

第四步，将含有dsred基因的pcambia1300载体的融合质粒导入到农杆菌中，形成可以用于介导转化植物细胞的工程菌农杆菌菌株eha105。

所述第一步中，扩增体系包括：

双蒸水定容到20μl。

所述第一步中，扩增程序包括：

所述第二步中，pcambia1300双元载体双酶切处理酶切体系包括：

双酶切程序：

37℃2h

70℃10min

4℃保存。

所述第四步中，农杆菌感受态细胞的制备包括：

取-70℃保存的农杆菌于含50μg/ml利福平平板划线，28℃培养；

挑取单菌落接种于5mlym液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12-16hr；

取2ml菌液转接于100mlym液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至od600＝0.5；

转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清液；

加入10ml预冷的0.1m的cacl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；4℃5000rpm离心5min，去上清；

加入4ml预冷的含15％甘油的0.1m的cacl2溶液，轻轻悬浮；

农杆菌悬浮液分装于无菌eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

所述第四步中，转化农杆菌的步骤包括：

取0.8-1.2μg的构建好的质粒dna加入到200ml农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min；

再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlym液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/mlkanamycin的ym平板上；28℃培养到形成单菌落。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如前述任一项所述高效筛选转基因植株载体的构建方法构建的转基因植株载体。

为解决上述技术问题，本发明又提供了一种农杆菌感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：

取-70℃保存的农杆菌于含50μg/ml利福平平板划线，28℃培养；

挑取单菌落接种于5mlym液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12-16hr；

取2ml菌液转接于100mlym液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至od600＝0.5；

转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清液；

加入10ml预冷的0.1m的cacl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；4℃5000rpm离心5min，去上清；

加入4ml预冷的含15％甘油的0.1m的cacl2溶液，轻轻悬浮；

农杆菌悬浮液分装于无菌eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

为解决上述技术问题，本发明再提供了一种转化农杆菌的方法，包括以下步骤：

取0.8-1.2μg的构建好的质粒dna加入到200ml农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min；

再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlym液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/mlkanamycin的ym平板上；28℃培养到形成单菌落。

本发明有益效果包括：

(1)本发明提供了一种基于dsred荧光蛋白基因为报告基因和潮霉素为抗生素筛选的工程菌株的改造。

(2)本发明还提供了一种可以在植物转基因初期可以观察到转基因是否成功的一种快捷的报告基因检测方法。为后续的高效率的阳性植株筛选提供了依据。

(3)本发明提供了一种基于dsred荧光蛋白基因为报告基因和潮霉素抗性基因为筛选基因同时存在的工程菌株。

(4)本发明还提供了一种可以双重筛选转基因是否成功的一种快捷的检测方法。

附图说明

图1为本发明实施例所述pcambia1300载体图谱及潮霉素抗性基因(hygr)图；

图2为本发明实施例所述dsred基因pcr扩增凝胶电泳检测图。

具体实施方式

下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。

本发明将潮霉素抗性基因与红色荧光基因(dsred)基因进行连锁后转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织，在愈伤组织细胞培养筛选阶段加入潮霉素，同时结合红色荧光检测，快速、有效的的筛选。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

a、dsred基因的获得；

dsred基因扩增所需引物

dsred-f5′tctagagccatggcctcctccgagaa-3′；

dsred-r5′-ggatccttacaggaacaggtggtggc-3′

b、dsred基因连接到pcambia1300植物双元表达载体上

各基因表达元件的获取和连接步骤包括：

第一步，以含有dsred片段的pgdr质粒为模板，利用上述引物进行扩增，获得dsred片段。扩增体系如下：

双蒸水定容到20μl

扩增程序：

第二步，pcambia1300双元载体双酶切处理酶切体系如下：

双酶切程序：

37℃2h

70℃10min

4℃保存

第三步，将引入xbai和bamhi酶切位点的dsred片段插入到双酶切后的pcambia1300双元载体上；

连接体系为：

16℃条件下连接过夜

第四步，将含有dsred基因的pcambia1300载体的融合质粒导入到农杆菌中，形成可以用于介导转化植物细胞的工程菌农杆菌菌株eha105。

农杆菌感受态细胞的制备

取-70℃保存的农杆菌于含50μg/ml利福平平板划线，28℃培养。

挑取单菌落接种于5mlym液体培养基中，220rpm28℃振荡培养12-16hr。

取2ml菌液转接于100mlym液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至od600＝0.5。

转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清液。

加入10ml预冷的0.1m的cacl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。

加入4ml预冷的含15％甘油的0.1m的cacl2溶液，轻轻悬浮。

农杆菌悬浮液分装于无菌eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

转化农杆菌

取1μg左右的上述构建好的质粒dna加入到200ml农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min。再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlym液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/mlkanamycin的ym平板上。28℃培养到形成单菌落。

以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。