控制玉米穗长QTL位点的分子标记引物及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一个新的控制玉米穗长qtl位点的分子标记及应用。

背景技术：

玉米产量是由产量构成因子每穗粒数和籽粒重构成。其中每穗粒数又可以剖析为穗行数和行粒数等相关性状。一般而言，穗长越长、行粒数越多，则为籽粒发育提供的可能性空间越大。定位产量构成因子相关性状的qtl，克隆关键基因以及剖析其遗传调控途径长期以来一直是分子育种学家的研究热点。随着对玉米基因组的深入研究，分子标记技术的革新换代，以及作图群体统计方法的不断优化，目前对于玉米产量qtl定位的研究已取得较大进展。

产量性状由主效和微效qtl共同控制，属于复杂的数量性状。目前，基于连锁作图和关联分析的方法，已经鉴定到140个qtls和87个tavs与穗长变异相关，47个qtls和14个tavs与行粒数变异相关，而且利用玉米花序突变体定位到的部分幼穗发育的基因多数与已知的产量相关性状的数量变异位点紧密连锁。brown等(2011)利用nam群体结合连锁和群基因组关联分析，在7个花序结构相关的性状中，共鉴定到236个qtls和1966个gwas/snps位点。li(2011)等利用由dan340衍生的自交系dan232和爆裂玉米自交系n04组配衍生的包含258个家系的ril，在全基因组范围内共检测到14个qtl影响穗长性状，分别分布在玉米第1、2、3、4和7号染色体上，可解释的表型变异为4.5％～8.7％。王邦太等(2012)以综3为供体亲本、87-1为轮回亲本，利用分子标记辅助选择(mas)技术构建了51份sssl，利用t测验分析法，共检测出20个控制穗长的qtl。zhou等(2014)以玉米骨干自交系ye478和一个以ye478为遗传背景的染色体片段代换系sl17-1为亲本构建了f2群体及其f2:3家系，在黄冈和潍坊两个环境中，在第7染色体7.02-7.03bin约6.3m的染色体区段内一致性的检测到1个同时控制行粒数和穗长的主效qtl，命名qel7.02，在两个环境中该位点所解释的行粒数表型变异分别为38.68％和21.61％，所解释的穗长的表型变异分别为51.77％和37.71％。

穗长及行粒数是玉米产量性状的重要组成因子，属于复杂的数量性状，对于这些性状的遗传解析及优良基因型的挖掘，不仅能够加快对穗长和行粒数性状的遗传机制的剖析，也为育种工作提供优良的基因资源和可用的分子标记，具有很重要的理论及应用意义。该性状的基因定位克隆虽是研究热点，但是玉米中图位克隆的相关基因目前甚少报道或进展缓慢，而且有育种价值的穗长位点更少见报道，需要加快相关性状的研究并充分评价其育种中的利用价值。在此背景下，本课题组利用近等基因系材料精细定位了一个控制玉米穗长性状的新的qtl，命名为zmel-1，并对zmel-1进行了准确的育种效应评价，为zmel-1在育种中应用奠定了良好基础；同时开发了与zmel-1紧密连锁的分子标记用于分子育种。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一个与玉米穗长发育相关的新的主效qtl位点，zmel-1，并开发了与此qtl紧密连锁的分子标记：1.10-131_f：cagctaggagcgatgagca、1.10-131_r：tccaccaccacctcctactc、1.10-91_f：acatcggagtgcctatcctg和1.10-91_r：cctggtctccaccaccac。

本发明的另一个目的在于提供了与玉米穗长主效qtlzmel-1紧密连锁的分子标记的应用，该标记可用于玉米穗长的分子育种。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一个与玉米穗长主效qtl紧密连锁的分子标记的获得：

1)本发明首先通过初定位，在第一条染色体长臂1.10bin的位置检测到控制穗长、行粒数、穗重性状的新主效qtl位点，并将其命名为zmel-1。

2)通过连续几代回交，并利用分子标记进行前景和背景选择，构建了zmel-1的近等基因系。

3)申请人利用穗长qtl近等基因系和来源于玉米不同杂种优势群的9个不同的优良玉米自交系进行杂交，考察f1穗长等产量相关性状的配合力，评价zmel-1位点的育种效应。

4)近等基因系幼穗im以及小花分化数目的统计分析。

5)申请人利用图位克隆的方法对zmel-1进行了精细定位，将zmel-1定位于chr1:279925380-283401913物理区间内，位于标记1.10-131和1.10-91之间，上述两个紧密连锁的标记可用于后续穗长zmel-1位点的分子育种。针对该标记，申请人设计引物如下：

1.10-131_f：cagctaggagcgatgagca

1.10-131_r：tccaccaccacctcctactc

1.10-91_f：acatcggagtgcctatcctg

1.10-91_r：cctggtctccaccaccac。

与玉米穗长主效qtl紧密连锁的分子标记的应用，包括利用本发明提供的引物用于玉米的育种实践，或直接用于玉米穗长性状材料的筛选鉴定。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明鉴定了一个新的控制玉米穗长的主效qtl并利用qtl-nil进行了连续多年多点的精细定位，将该主效qtl定位于1号染色体长臂，位于标记1.10-131与1.10-91之间，物理区间为：chr1:279925380-283401913，该区间首次发现控制穗长的主效qtl，并且存在着较高的表型贡献率和加性效应值，分别为42％以及1.58cm。具有很好的潜在育种价值；通过zmel-1近等基因系与多个优良玉米自交系进行组配发现，该位点能够显著地增加穗长、行粒数、穗重以及穗粒重等重要产量性状，从而达到增产的效果；开发的与qtlzmel-1紧密连锁的分子标记可用于分子标记辅助选择育种。

现有已发表的控制穗长的主效qtl大多处于初级定位阶段，qtl的真实性和可靠性还需要进一步验证，进而继续开展精细定位工作。而我们不仅通过多年多点的数据将qtlzmel-1定位于标记1.10-131与1.10-91之间，而且通过育种效应评价，证实了该位点对产量的贡献或增效作用，明确了其育种价值；因此该位点是真实可靠的控制穗长的基因位点，并具有很大的应用潜力。

附图说明

图1为w138及近等基因系w138^ty6表型示意图；

其中：a：近等基因系的株型，w138^ty6(左)、w138(右)，bar＝15cm；

b：近等基因系的成熟果穗，w138^ty6(左)、w138(右)，bar＝1cm；

c和d：近等基因系穗长以及行粒数统计比较，el代表穗长，knr代表行粒数；

e和f：近等基因系散粉以及吐丝期统计比较，dta代表散粉期，dts代表吐丝期；t-test用于显著性检验。

*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著。

图2为w138及近等基因系w138^ty6幼穗im大小以及小花分化数目示意图；

其中：a和b：5mmw138^ty6(左)和w138(右)幼穗显微镜照片，bar＝2mm；

c：小花分化完成后的w138^ty6(上)和w138(下)照片，bar＝1cm；

d和e：近等基因系(w138^ty6、w138)5mm幼穗im的直径以及长度统计对比；

f：近等基因系(w138^ty6、w138)小花数目统计对比，t-test用于显著性检验。

*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著。

图3为zmel-1的精细定位示意图；

其中：a：2015年四川、海南两个地点跨叠系子代测验结果；b：2016年四川、黄冈两个地点跨叠系子代测验，na代表缺失，el代表穗长，sc代表四川，hn代表海南，hg代表黄冈，t-test用于显著性检验。*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著。

图4为zmel-1的育种效应评价示意图；

其中，a：穗长在9个自交系分别与近等基因系(w138与w138^ty6)构建的杂交组合的成对比较；

b：行粒数在9个自交系分别与近等基因系构建的杂交组合的成对比较；

c：穗重在9个自交系分别与近等基因系构建的杂交组合的成对比较；

d：穗粒重在9个自交系分别与近等基因系构建的杂交组合的成对比较，el代表穗长，knr代表行粒数，ew代表穗重，ekw代表穗粒重。t-test用于显著性检验。*、**、***分别代表0.05、0.01、0.001水平上显著，ns代表不显著。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道，或已公开的材料。

实施例1：

与玉米穗长主效qtl紧密连锁的分子标记开发：

1材料与方法

1.1实验材料

玉米自交系w138、zmel-1近等基因系w138^ty6及近等基因系构建的后代定位群体。

1.2试验方法

1.2.1目标区段分子标记开发

根据b73基因组，下载zmel-1区间序列，利用redb网站的ssrscan工具进行ssr序列查找，然后根据ssr侧翼序列进行特异性引物的设计，然后根据在亲本材料w138和ty6中进行扩增，通过毛细管电泳进行多态性分析，选取有多态性、条带清晰的标记进行群体基因型分析。

1.2.2田间试验及表型的鉴定

用于子代测验的杂合重组单株，每个杂合单株发展成不少于200个子代家系。分别于2015年四川成都(31°n，104°e)及2015海南三亚(18°n，109°e)冬种植，行长2.5m，宽0.6m，每行10棵。收获后晾晒风干，考察穗长、行粒数、穗粗、穗行数四个性状，t-test检验差异显著性。

5种不同交换类型的纯合重组家系分别于2016年湖北黄冈(30°n，115°e)春及2016四川成都(31°n，104°e)春，采取随机区组，3次重复，行长3m，宽0.6m，每行种植12棵。在田间实验中调查包括抽雄期(dth，days)、散粉期(dta，days)、吐丝期(dts，days)进行天数记载，以行为单位，采取50％阈值。成熟后，收获果穗，风干，剔除异常果穗，进行数据测量，包括穗长、行粒数、穗粗、穗行数四个性状，t-test检验差异显著性。

1.2.3基因型分析

基因型分析涉及到dna的提取以及pcr扩增。单株dna的提取采用ctab法，具体步骤：

1.在研钵中加入700μlctab(83.5mmtris-hcl，ph8.0，16.7mmedtaph8.0，1.17mnacl，1.67％ctab)，取适量新鲜幼嫩叶片于冰上研磨至匀浆，转移至2ml的离心管中；

2.65℃水浴40min，期间颠倒混匀几次；

3.冷却至室温后，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1，v/v)，轻摇混匀15min左右后，12000rpm离心10min；

4.取200μl上清至另一新的1.5ml离心管中，加入二倍体积的冰乙醇，轻摇混匀后静置30min；

5.12000rpm离心10min，弃上清。用75％的乙醇洗沉淀2次；

6.离心去上清，室温放置干燥后，加入100μlddh2o溶解，-20℃保存备用。

pcr反应体系

pcr反应程序

单株基因型检测采用毛细管电泳。

2结果与分析

2.1zmel-1的初定位

本申请人前期以ty6和w138构建的f2:3群体，将控制穗长、行粒数、穗重的主效qtl定位于1号染色体长臂1.10bin的位置，并且具有较高的lod值以及表型贡献率(r²)适合下一步的精细定位(表1)。

表1zmel-1初定位结果

2.2zmel-1近等基因系构建

根据f2:3家系定位结果，我们发展了以w138为轮回亲本ty6为供体的回交群体，于2011年冬季在海南华中农业大学南繁基地种植bc3f1群体。利用w138和ty6亲本间89对多态性标记进行前景选择和背景评价筛选(以初定位群体检测到的qtl两侧标记为依据，挑选多态性标记用于mas筛选)，最终确定nil-1986-15为目标单株个体，该个体背景回复率为94.3％，且携带初定位目标区段qtlzmel-1。利用mas技术，对入选单株进行前景选择检测，连续自交，并在bc3f3群体中筛选目标qtl区段纯合且农艺性状表型与轮回亲本一致的家系发展成为一个qtl近等基因系(qtl-nil)(以下用w138^ty6代替)。进而利用w138^ty6与轮回亲本w138杂交构建nil-f3分离群体，用于初定位qtl的验证。与w138相比，其近等基因系w138^ty6在株型等农艺性状上并不存在差异，而生育期与穗部性状差异显著；与轮回亲本w138相比，近等基因系w138^ty6生育期提前2-3天，w138^ty6穗长平均降低约1.4厘米，行粒数平均减少2.5粒，穗重平均降低12克，上述性状在qtl-nil中均达到极显著水平，表明w138^ty6中真实携带一个影响穗部性状的一因多效qtl位点(图1，表2)。此外，我们还对其它农艺性状进行考察，除了穗部及生育期的差异外，其余农艺性状上均不存在差异(表2)。

表2w138及近等基因系w138^ty6重要农艺性状

2.3近等基因系幼穗im以及小花分化数目的统计

前人研究表明，im的直径大小决定spm的横向分化，是影响穗行数的一个重要因素。理论上im的纵向分化能力和持续分化的时间也会影响到每行小花数目，进而影响到穗长和行粒数，因此采集10叶期的w138与其近等基因系w138^ty6约2mm幼穗进行im大小的测定，在体视显微镜下拍照，然后利用软件imagej进行图片的处理，测量im的直径以及长度。结果显示：w138^ty6im的直径为272.4±19.1um，w138im的直径为278.8±18.0um，近等基因系之间差异不显著；w138^ty6im的长度为187.6±25.2um，w138im的长度为207.7±22.3um，p值为1.21e-03，差异显著(图2中a、b、d、e)。

行粒数是由有效小花分化数目所决定的，因此我们对近等基因系幼穗的小花分化数目进行了统计。统计结果显示：w138^ty6小花数目为39.3±2.4,w138的小花分化数目为44.3±2.4，p值为3.0e-09，达到极显著水平差异(图2中c、f)。因此我们推测：幼穗im的长度决定了小花分化数目，进而决定了穗长以及行粒数，从而影响到产量的形成。

2.4zmel-1精细定位以及连锁标记的开发

2014年武汉，以zmel-1初定位区间的两侧标记(hchr1-66，mjd-73)对500株bc5f1群体进行的基因型分析，用于重组交换单株筛选，我们获得了50株交换单株，并将这些重组单株全部自交留种。与此同时，我们对该区间成功开发了6个在双亲中具有多态性的ssr标记，用于重组单株的标记加密与基因型分析。通过重组单株标记的加密，我们获得了6种重组类型，并构建了zmel-1的跨叠系。将这6个重组家系在海南自交繁种，用于子代测验。通过2015年四川以及海南两个点重组家系的子代测验，判断包含zmel-1位点杂合单株子代是否分离，差异是否显著，即纯合的nil^w138基因型与nil^ty6基因型个体之间的穗长是否存在差异。

结果表明：mjd52-mjd73标记之间，两类基因型个体之间的穗长在两个不同的环境下均存在显著差异。因此根据子代测验的结果，我们将zmel-1定位于标记mjd52与mjd73之间，根据b73参考基因组显示，两个标记之间的物理距离为8.5mbp(图3中a)。

接下来我们采用以zmel-1区间两侧的标记(mjd52，mjd73)，通过对1000株bc6f1进行基因型分析，用于重组交换单株筛选，筛选到了42个重组单株，并将这些重组单株全部自交留种与此同时，我们对该区间成功开发了6个在双亲中具有多态性的ssr标记，用于重组单株的标记加密与基因型分析。通过重组单株标记的加密，我们获得了5种重组类型，并构建了zmel-1的跨叠系。将这5个重组家系在海南自交繁种，用于子代测验。通过2016年四川以及黄冈两个点重组家系的子代测验，判断包含zmel-1位点杂合单株子代是否分离，差异是否显著，即纯合的nil^w138基因型与nil^ty6基因型个体之间的穗长是否存在差异。结果表明：1.10-131-1.10-91标记之间，两类基因型个体之间的穗长在两个不同的环境下均存在显著差异。因此根据子代测验的结果，我们将zmel-1定位于标记1.10-131与1.10-91之间，根据b73参考基因组显示，两个标记之间的物理距离3.4mbp(图3b)，针对这两个标记设计引物，如下：

1.10-131_f：cagctaggagcgatgagca

1.10-131_r：tccaccaccacctcctactc

1.10-91_f：acatcggagtgcctatcctg

1.10-91_r：cctggtctccaccaccac。

实施例2：

与玉米穗长主效qtlzmel-1紧密连锁的分子标记引物在玉米育种中的应用：

1、材料与方法

1.1实验材料

玉米自交系w138以及其近等基因系w138^ty6，9个优良的玉米自交系：hl78f(华良种业培育的华良78的父本自交系)，501，hz4，sheng62(为圣瑞公司培育的圣瑞999的父本自交系)，chang7-2，ye478，zheng58，4cv，6wc。

1.2试验方法

1.2.1根据分子标记选出zmel-1近等基因系w138及其近等系w138^ty6与优良自交系组配杂组合

选择了来源于玉米不同杂种优势群的9个玉米优良自交系(hl78f，501，hz4，sheng62，chang7-2，ye478，zheng58，4cv，6wc)，分别与含优良zmel-1基因型自交系w138(采用分子标记1.10-131,1.10-91进行辅助选择，扩增条带大小分别为109bp以及212bp)以及含有不良位点的近等基因系w138^ty6(采用分子标记1.10-131,1.10-91进行辅助选择，扩增条带大小分别为102bp以及192bp)杂交，得到18个杂交组合，并对f1的穗长(el)、行粒数(knr)、穗重(ew)和穗粒重(ekw)进行考察。

1.2.2回交导入与分子标记辅助选择

1)分子标记多态性分析：通过将标记1.10-131以及1.10-91在w138以及zheng58中进行扩增，通过毛细管电泳对比我们可以发现，1.10-131在w138扩增长度为109bp，而在zheng58中扩增长度为102bp，因此在电泳的时候，w138片段条带在上，zheng58片段条带在下，杂合的有双条带；1.10-91在w138扩增长度为212bp，而在zheng58中扩增长度为192bp，w138片段条带在上，zheng58片段条带在下，杂合的有双条带。

因此，分子标记1.10-131以及1.10-91扩增条带大小分别为109bp以及212bp时表示携带zmel-1优良基因型，11个自交系利用本发明提供分子标记的引物扩增结果如表3所示，可以看到，仅w138具有优良基因型。

分子标记1.10-131的序列为：

1.10-131_f：cagctaggagcgatgagca

1.10-131_r：tccaccaccacctcctactc。

分子标记1.10-91的序列为：

1.10-91_f：acatcggagtgcctatcctg

1.10-91_r：cctggtctccaccaccac。

表31.10-131以及标记1.10-91在11个自交系中扩增条带大小

2)采用含有zmel-1优良基因型的玉米自交系w138为父本，与zheng58进行杂交，得f1。

3)以zheng58为轮回亲本，进行回交，得bc1f1，利用分子标记(1.10-131,1.10-91)进行对bc1f1进行基因型鉴定，选择出含有优良zmel-1基因型单株(扩增条带大小分别为109bp以及212bp)；

4)以zheng58为轮回亲本，进行回交，得bc2f1，利用分子标记(1.10-131,1.10-91)进行对bc2f1进行基因型鉴定，选择出含有优良zmel-1基因型单株(扩增条带大小分别为109bp以及212bp)；

5)以zheng58为轮回亲本，进行回交，得bc3f1，利用分子标记(1.10-131,1.10-91)进行对bc1f1进行基因型鉴定，选择出含有优良zmel-1基因型单株(扩增条带大小分别为109bp以及212bp)；

6)然后将含有优良zmel-1基因型单株的bc3f1自交，得bc3f2，利用分子标记(1.10-131,1.10-91)进行对bc3f2进行基因型鉴定，选择出只含有优良zmel-1基因型单株(扩增条带大小分别为109bp以及212bp)，至此，我们得到了优良zmel-1基因型改良的zheng58.

1.2.3穗部性状的考察

1.2.1获得的18个f1组合种植于2017湖北黄冈(30°n，115°e)，采取随机区组，三次重复，行长3m，宽0.6m，每行种植12株。成熟后，收获果穗风干并剔除异常果穗，测量并收集穗长、行粒数、穗重和穗粒重等性状数据，利用t-test检验差异显著性。

用将zheng58以及改良后的zheng58植于2018湖北黄冈(30°n，115°e)，采取随机区组，三次重复，行长3m，宽0.6m，每行种植12株。成熟后，收获果穗风干并剔除异常果穗，测量并收集穗长、行粒数、穗重等性状数据，利用t-test检验差异显著性。

2、结果与分析

2.1、来自于w138的zmel-1优良等位基因型显著地提高杂交组合产量

基于18个杂交组合的表型统计表明，含有zmel-1优势基因的自交系w138与9个自交系f1杂交组合，相对于含有zmel-1不利基因的近等基因系w138^ty6所得f1穗长平均增加0.8cm，行粒数平均增加1.5粒，穗重平均增加16g，穗粒重平均增加12g，平均增产7％(图4)。

2.2、zheng58改良系穗部性状显著优于zheng58

通过对改良后的zheng58穗部性状进行考察，结果发现，与zheng58相比，导入zmel-1优良基因型的zheng58穗长显著增长1.6cm，行粒数显著增加3.2粒，穗重显著增加12.3g(表4)，因此zmel-1位点对于玉米穗部性状的改良具有潜在的应用价值。

表4zheng58以及改良zheng58穗部性状

序列表

<110>华中农业大学

<120>控制玉米穗长qtl位点的分子标记引物及应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cagctaggagcgatgagca19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tccaccaccacctcctactc20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

acatcggagtgcctatcctg20

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cctggtctccaccaccac18