本发明属于snp的应用技术领域，具体涉及一种扩增与运动能力相关基因的引物组及检测试剂盒。
背景技术：
运动能力是指人们从事各种身体活动的能力，包括维持生命活动不可缺少的走、跑、跳、投、攀、爬、滚、翻等基本能力和参加体育训练或比赛所具备的特殊运动能力，是人体形态、素质、机能、技能和心理能力等的综合表现。有人研究指出，成为优秀运动员的遗传和后天训练所引起的作用，前者占2/3，后者占1/3。近年来分子遗传学研究多次证实与人类运动能力相关的诸如肌肉力量、耐力、平衡力、协调性、柔韧性、有氧运动能力、无氧运动能力、训练应答以及疲劳的发生发展等都有重要的生物学背景。在环境条件和训练方式大致相同的情况下，不同个体在运动能力、体能、领悟力以及训练应答等方面都存在着明显的差异，其中最根本的原因就在于不同的个体遗传背景不同，即存在运动天赋的差异。通过基因检测能够了解个体与运动相关的先天能力，从而为有针对性的选材与育才提供科学的参考依据。
一个人运动遗传素质的优劣决定其运动能力的上限及可训练性的程度。snp在探索人类健康和癌症诊断扮演着重要角色，至今已发现200多个染色体和18个线粒体的基因多态性位点和人类的肌肉力量、身体活动水平、耐力水平和训练敏感性相关。过去已经发展出多种检测基因多态性的方法，用来预测运动的能力。其中比较全面的就是发明专利(cn201711219812.5)，涵盖了5个与运动相关的基因单核苷酸多态性位点，该专利公开了一种用于检测运动基因snp的引物组，使用的方法是毛细管电泳法，但检测基因不全面，dna模板投入量大，耗时长。发明专利(cn201310115932.6)公开了一种预测优秀冰雪运动员弹跳潜能的分子生物学方法，该方法仅检测actn3和ace2个基因，检测基因不全面，位点增加时，操作复杂。
综上所述，找到一种可以同时检测多个位点snp，操作快速简便，结果准确，特异性好的反应体系和检测方法具有重要的意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种扩增与运动能力相关基因的引物组及检测试剂盒，可同时对肌肉类型、运动动力、运动积极性、爆发力、耐力、疼痛忍受力、软组织受伤保护、有氧能力、无氧能力、恢复、肥胖、肺活量和力量相关的基因进行检测，
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种扩增与运动能力相关基因的引物组，所述引物组包括：特异性引物和单碱基延伸引物；所述特异性引物的核苷酸序列如seqidno.1～52所示；所述单碱基延伸引物的核苷酸序列如seqidno.53～78所示。
优选的，所述引物组根据以下基因设计：vegfa、ppara、bdnf、papss2、intergenic、mstn、agt、acvr1b、adrb2、actn3、adrb2、oprm1、cilp、col1a1、il6、akt1、ampd1、nos3、nat2、ankk1、fto、bmp6、intergenic、prdm11、cntf和ace。
优选的，所述基因的snp位点包括：rs2010963rs4253778、rs6265、rs10887741、rs8097348、rs1805086、rs699、rs2854464、rs1042714、rs1815739、rs1042713、rs563649、rs2073711、rs1800012、rs1800795、rs1130214、rs17602729、rs2070744、rs1208、rs1800497、rs9939609、rs6923462、rs4237643、rs2863171、rs1800169和rs4343。
本发明还提供了一种检测运动能力相关基因的试剂盒，包括上述引物组。
本发明提供了一种扩增与运动能力相关基因的引物组及检测试剂盒，通过利用与运动相关的基因联合，设计出特异性引物和单碱基延伸引物，将所有的位点放在同一个反应中，通过减体系多重pcr进行扩增，使用飞行时间质谱检测，一次同时检测26个位点，减少操作复杂程度，降低成本，节约时间。
具体实施方式
本发明提供了一种扩增与运动能力相关基因的引物组，所述引物组包括：特异性引物和单碱基延伸引物；所述特异性引物的核苷酸序列如seqidno.1～52所示；所述单碱基延伸引物的核苷酸序列如seqidno.53～78所示。
本发明所述引物组根据以下基因设计：vegfa、ppara、bdnf、papss2、intergenic、mstn、agt、acvr1b、adrb2、actn3、adrb2、oprm1、cilp、col1a1、il6、akt1、ampd1、nos3、nat2、ankk1、fto、bmp6、intergenic、prdm11、cntf和ace。所述基因的snp位点包括：rs2010963rs4253778、rs6265、rs10887741、rs8097348、rs1805086、rs699、rs2854464、rs1042714、rs1815739、rs1042713、rs563649、rs2073711、rs1800012、rs1800795、rs1130214、rs17602729、rs2070744、rs1208、rs1800497、rs9939609、rs6923462、rs4237643、rs2863171、rs1800169和rs4343。具体对应关系如表1和表2所示，在表2中正向引物以r表示，反向引物以f表示，单碱基延伸引物以d表示：
表1运动能力相关基因及snp位点
表2引物序列
与运动相关基因的各snp位点多样性解读如表3所示：
表3运动能力相关基因snp位点分型意义解读
本发明还提供了一种检测运动能力相关基因的试剂盒，包括上述引物组。
本发明在应用所述试剂盒时，优选以人基因组dna为模板dna，采用多重pcr技术进行扩增。本发明所述人基因组dna优选采集自口腔，本发明对所述口腔基因组dna的采集方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。
本发明所述多重pcr，优选包括：利用正向引物、反向引物和模板dna进行pcr，得pcr产物；对pcr产物进行碱性磷酸酶处理，之后再进行单碱基延伸，利用树脂纯化单碱基延伸后的产物，上机检测。
本发明所述pcr的体系优选为4μl体系，包括：dna模板2μl，引物mix0.67μl，10×buffer0.33μl，mgcl2(25mm)0.27μl，dntp(25mm)0.07μl，ddh2o0.53μl，pcr酶(5u/μl)0.13μl。本发明对所述pcr体系中的各组分来源并没有特殊限定。本发明所述pcr的程序优选为：95℃预变性2min；(95℃30s，56℃30s，72℃1min)45个循环；72℃5min，4℃保持。
本发明在所述碱性磷酸酶处理前，优选还包括去除所述pcr产物中的游离dntps，所述去除的方法为利用sap(shrimpalkalinephosphatase，虾碱性磷酸酶)处理。本发明所述碱性磷酸酶处理体系优选为5.33μl体系，具体包括：4μlpcr产物，sap×buffer0.11μl，sapenzyme(1u/μl)0.2μl，ddh2o1.02μl。本发明对所述sapmix的来源并没有特殊限定。本发明所述碱性磷酸酶处理的程序优选为：37℃40min；85℃5min；4℃维持。
本发明所述单碱基延伸优选利用sequenom平台配套试剂和操作步骤，完成待测样本snp位点分型结果。配制反应体系：将5.33μl碱性磷酸化酶处理后的pcr产物，延伸引物mix0.63μl，gold×buffer0.13μl，terminationmix0.13μl，iplexenzyme0.03μl，ddh2o0.41μl。反应体系配制好后使用pcr封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于abi9700pcr仪上反应，反应条件：94℃30s，{94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个内部循环}40个外部循环，72℃3min，4℃保持；得到单碱基延伸产物，离心备用。
本发明所述树脂纯化优选sequenom平台配套试剂和操作步骤完成。
本发明所述上机检测优选包括：使用agena公司massarraytmrs1000点样仪转移纯化后的产物至检测芯片，并使用agena公司massarraytm分析仪进行检测。
下面结合实施例对本发明提供的与运动能力相关的引物组及检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
口腔拭子dna提取：利用百泰克磁珠法唾液和拭子dna自动提取试剂盒进行唾液dna提取。往口腔拭子中加入30μlproteinasek，56℃水浴30min，颠倒混匀。撕开96孔深孔板塑封膜，在第一列和第七列分别加入孵育后的样本350μl，再加入10μl核酸助沉剂、300μl异丙醇，放入核酸提取仪，将搅拌棒插入卡槽，设置温度为：裂解温度80℃，洗脱温度65℃，仪器运行结束后，收集dna溶液，质检，4℃保存。
实施例2
pcr扩增：将实施例1提取的待测样本的dna分别加入到384孔板中，进行多重pcr扩增。按照多重pcr扩增的反应体系(4μl)加入到每个反应孔中，反应体系：模板dna2μl，引物mix0.67μl，10×buffer0.33μl，mgcl2(25mm)0.27μl，dntp(25mm)0.07μl，ddh2o0.53μl，pcr酶(5u/μl)0.13μl。反应体系配制好后使用pcr封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于abi9700pcr仪上反应，反应条件：95℃预变性2min；(95℃30s，56℃30s，72℃1min)45个循环；72℃5min，4℃保持；得到pcr扩增产物，离心备用。
实施例3
sap消化：利用sequenom平台配套试剂和操作步骤，完成待测样本snp位点分型结果。将实施例2中得到的pcr扩增产物，按照sap消化的反应体系(1.33μl)加入到每个反应孔中，反应体系：sap×buffer0.11μl，sapenzyme(1u/μl)0.2μl，ddh2o1.02μl。反应体系配制好后使用pcr封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于abi9700pcr仪上反应，反应条件：37℃40min，85℃5min，4℃保持；得到碱性磷酸化酶处理后的pcr产物，离心备用。
实施例4
单碱基延伸反应：利用sequenom平台配套试剂和操作步骤，完成待测样本snp位点分型结果。将实施例3中得到的碱性磷酸化酶处理后的pcr产物，按照单碱基延伸反应体系(1.33μl)加入到对应的每个反应孔中，反应体系：延伸引物mix0.63μl，gold×buffer0.13μl，terminationmix0.13μl，iplexenzyme0.03μl，ddh2o0.41μl。反应体系配制好后使用pcr封口膜封紧，防止样品蒸发，震荡混匀，离心；将密封的384孔板置于abi9700pcr仪上反应，反应条件：94℃30s，{94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5个内部循环}40个外部循环，72℃3min，4℃保持；得到单碱基延伸产物，离心备用。
实施例5
树脂纯化：利用sequenom平台配套试剂和操作步骤，完成待测样本snp位点分型。将实施例4的单碱基延伸产物的384孔板，轻轻撕下封口膜后，每孔加入16μlddh2o；取干净的a4纸将6mg384板置于其上，用小勺取适量纯化树脂；用塑料板反复左右推平纯化树脂，压实，使每孔树脂含量均匀；将384板倒置压在6mg384板上，两板对调，6mg板在上，敲打6mg板背面，使树脂落入装有单碱基延伸产物的384孔板中；封口膜封好后，15rpm上下颠倒混匀30min，充分纯化。
芯片点样：将树脂纯化后的384孔板离心，启动massarraynanodispenserrs1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip芯片上；点样后的芯片使用maldi-tof分析，检测结果使用typer4.0软件分型并输出结果。实验结果如表4所示：
表4snp位点基因检测结果
由表4可见，26个位点的基因型均能正确检出，检出率100％，基因型分布符合中国汉族人基因型分布频率。
结合表3及表4可对受检样本的运动能力进行分析，以样本1为例进行检测结果解读，见下表(表5)：
表5样本1基因检测结果解读
由表5可知，样本1的为兼顾型肌肉，运动动力、疼痛忍受力、无氧运动能力正常，运动积极性较常人高，但软组织保护能力并不突出，且有氧运动能力、肺活量、力量均较差，需要以此调整运动方式、饮食及营养素补充。本发明的基因检测方法适用于中国汉族人基因型检测及其运动能力的预测。
本发明设计的扩增引物和延伸引物能在同一个反应内检测出26个snp位点，用于开发运动能力检测试剂盒并指导合理运动。在运动指导方面，本发明的基因检测可了解人类机体的耐力、爆发力、力量等能力，为合理运动提供科学的参考依据。本发明将运动相关的基因联合检测，一次检测出所有的项目，是目前为止运动能力基因检测产品中检测基因覆盖面最全面的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>北京北基医学检验实验室有限公司
<120>一种扩增与运动能力相关基因的引物组及检测试剂盒
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