本发明涉及一种曲普瑞林的纯化方法，属于分离纯化技术领域。
背景技术：
曲普瑞林，英文名称：triptorelinacetate，药物别名达必佳、达菲林等，氨基酸序列为：l-焦谷氨酰-l-组氨酰-l-色氨酰-l-丝氨酰-l-酪氨酰-d-色氨酰-l-亮氨酰-l-精氨酰-l-脯氨酰-甘氨酰胺。
曲普瑞林(triptorelin)是合成的促性腺激素释放激素的类似物，其结构改造是将天然分子结构中的第六个甘氨酸被d-色氨酸所取代，使其促效作用更为显著及血浆半衰期更长。曲普瑞林临床用于治疗激素依赖性前列腺癌、子宫肌瘤、子宫内膜异位症、中枢性性早熟等，也可用于体外受精术。
中国专利cn101357936a采用c18柱纯化，流动相：0.1mnh4ac：乙腈(7.5:2.5，体积比)，流速为：500ml/min，检测波长：280nm，合格品去盐冻干，约得20克白色块状物，总收率25.4％(以树脂60mmol计)。该方法未提及成品纯度及单杂情况，难以达到药用所需的纯度。
中国专利cn103012564b采用离子交换色谱纯化曲普瑞林并转盐，后经十八烷基硅烷键合硅胶柱除去溶剂，浓缩冻干得曲普瑞林。总收率为27.6％，单杂0.07％，总杂0.23％。
中国专利cn103122023b采用c18柱纯化，流动相a为磷酸或硫酸的缓冲盐，流动相b为乙腈，梯度洗脱，后经醋酸转盐，浓缩冻干得曲普瑞林成品。纯度大于99.7％，单杂小于0.05％，总收率为30％以上。
为控制曲普瑞林原料杂质限量，提高纯度及收率，需要进一步研究分离纯化方法。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种曲普瑞林的纯化制备方法，该方法成本低廉、样品杂质少且稳定可控、纯化收率及总收率高，有利于实现产业化生产。
本发明的第一个目的是提供一种曲普瑞林的纯化方法，包括如下步骤：
(1)粗肽溶解：将曲普瑞林粗肽加入到含有5％-10％有机溶剂的水溶液中，在28-32℃进行溶解，然后过滤；
(2)一次纯化：将步骤(1)的滤液经过反相聚合物填料进行一次分离纯化，其中a相为磷酸三乙胺溶液，b相为甲醇，收集主峰样品；
(3)二次纯化：将步骤(2)收集得到的样品经过十八烷基硅烷键合硅胶填料进行二次分离纯化，其中a相为三氟乙酸水溶液，b相为乙腈，收集主峰样品；
(4)转盐：将步骤(3)收集得到的样品经过反相十八烷基硅烷键合硅胶填料进行两阶段洗脱转盐，其中一阶段采用的流动相a为醋酸铵水溶液，流动相b为乙腈；二阶段采用的流动相a为醋酸水溶液，流动相b为乙腈；收集主峰样品；
(5)将步骤(4)收集的样品进行浓缩冻干得到曲普瑞林产品。
进一步地，在步骤(1)中，所述的有机溶剂为甲醇或乙腈。
进一步地，所述的反相聚合物填料的规格优选为10μm、
进一步地，在步骤(1)中，溶解的时间为1～1.5h。申请人发现，由于曲普瑞林本身结构组成的特征，在合成裂解过程中，色氨酸的保护基团容易脱除不完全，在分析仪器上会出现双峰的情况，对纯化收率有很大的影响，经申请人反复摸索，当粗肽完全溶解后，水浴28-32℃恒温加热1-1.5小时，效果最佳，可将保护基团完全去除。温度过低达不到完全去除的目的，温度过高则影响粗肽溶液稳定性，杂质变大。
进一步地，在步骤(1)中，采用0.45μm混合滤膜过滤。
进一步地，在步骤(2)中，磷酸三乙胺为0.15％的磷酸缓冲盐(v/v)用三乙胺调ph至2.0-2.5。申请人对不同流动相体系进行分析对比，发现体积比0.15％的磷酸缓冲盐(v/v)对于杂质分离效果明显，一次纯化收率高达88％以上。将纯度小于94％大于70％样品合并回收再次纯化，最终一纯总收率高达93％以上。
进一步地，在步骤(2)中，b相的洗脱梯度为37％-47％，洗脱时间为50～70min。收集纯度大于94％，单杂小于1％的样品。
进一步地，在步骤(3)中，十八烷基硅烷键合硅胶优选规格为8μm、
进一步地，在步骤(3)中，三氟乙酸的体积浓度为0.1～0.15％(v/v)。对曲普瑞林一次纯化合格品进行二次纯化过程中，申请人发现用体积比0.1％-0.15％的三氟乙酸水溶液(v/v)作流动相分离效果明显，收率高且损失少，二纯总收率在91％以上。
进一步地，在步骤(3)中，b相的洗脱梯度为20％-25％，洗脱时间50～70min。收集纯度大于99.9％，单杂小于0.02％的样品。
进一步地，在步骤(4)中，醋酸铵水溶液的浓度为40～60mmol/l，在一阶段洗脱时，醋酸铵水溶液与乙腈按照体积比为90～100:5进行等度洗脱10～20min。
进一步地，在步骤(4)中，醋酸水溶液中醋酸体积浓度为0.03％-0.05％(v/v)，在二阶段洗脱时，b相洗脱梯度为10％-30％，线性洗脱时间为30～50min。申请人发现，醋酸体积比浓度低于0.03％时，成品溶解性不好；醋酸体积比浓度高于0.05％时，成品中醋酸含量超标。转盐总收率可达97％以上。
说明书中(v/v)称之为体积比，指相同体积单位的两种溶剂比，例如0.1％的三氟乙酸水溶液指0.001l的三氟乙酸与1l水的混合溶液。
本发明的有益效果是：
本发明曲普瑞林纯化制备方法，成品纯度可达99.9％，单杂小于0.02％，纯化收率大于80％，总收率大于50％，其解决了目前该产品纯化及总收率不高，成品纯度低等问题，且工艺稳定可控，适合产业化生产，有着显著的社会经济效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：
称取40mmol曲普瑞林粗肽，共56.4克，用5％乙腈水溶液按5mmol/l溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解，放入28℃恒温水浴锅90min，用0.45μm混合滤膜过滤，收集滤液，hplc检测定量含目的肽39.1克。
一次纯化：色谱柱：反相聚合物填料10μm、
二次纯化：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料8μm、
转盐：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料，柱子直径和长度为50mm×250mm；上样量：目的肽7.0克/针；流动相a：50mmol/l醋酸铵水溶液，流动相b：乙腈；流速：80ml/min；检测波长：230nm；按体积比95:5等度洗脱15min。后用流动相a：0.03％醋酸水溶液(v/v)，流动相b：乙腈；流速：80ml/min；检测波长：230nm；梯度：b％相10％-30％，线性洗脱40min，收集纯度大于99.9％，单杂小于0.02％的样品，hplc检测定量含目的肽34.0克，转盐收率为98.0％。将合格品于32℃水温条件下减压旋蒸浓缩，冻干，得醋酸曲普瑞林33.6克。纯度为99.91％，最大单杂0.01％，总纯化收率为85.9％，总收率为64.1％。
实施例2：
称取40mmol曲普瑞林粗肽，共56.4克，用10％乙腈水溶液按5mmol/l溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解，放入28℃恒温水浴锅60min，用0.45μm混合滤膜过滤，收集滤液，hplc检测定量含目的肽39.0克。
一次纯化：色谱柱：反相聚合物填料10μm、
二次纯化：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料8μm、
转盐：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料，柱子直径和长度为50mm×250mm；上样量：目的肽6.9克/针；流动相a：50mmol/l醋酸铵水溶液，流动相b：乙腈；流速：80ml/min；检测波长：230nm；按体积比95:5等度洗脱15min。后用流动相a：0.03％醋酸水溶液(v/v)，流动相b：乙腈；流速：80ml/min；检测波长：230nm；梯度：b％相10％-30％，线性洗脱40min，收集纯度大于99.9％，单杂小于0.02％的样品，hplc检测定量含目的肽33.7克，转盐收率为98.0％。将合格品于32℃水温条件下减压旋蒸浓缩，冻干，得醋酸曲普瑞林33.1克。纯度为99.90％，最大单杂0.02％，纯化收率为84.9％，总收率为63.1％。
实施例3：
称取200mmol曲普瑞林粗肽，共282.1克，用5％乙腈水溶液按5mmol/l溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解，放入30℃恒温水浴锅90min，用0.45μm混合滤膜过滤，收集滤液，hplc检测定量含目的肽195.2克。
一次纯化：色谱柱：反相聚合物填料10μm、
二次纯化：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料8μm、
转盐：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料，柱子直径和长度为150mm×250mm；上样量：目的肽18.7克/针；流动相a：50mmol/l醋酸铵水溶液，流动相b：乙腈；流速：400ml/min；检测波长：230nm；按体积比95:5等度洗脱15min。后用流动相a：0.04％醋酸水溶液(v/v)，流动相b：乙腈；流速：400ml/min；检测波长：230nm；梯度：b％相10％-30％，线性洗脱40min，收集纯度大于99.9％，单杂小于0.02％的样品，hplc检测定量含目的肽163.5克，转盐收率为97.5％。将合格品于32℃水温条件下减压旋蒸浓缩，冻干，得醋酸曲普瑞林162.7克。纯度为99.92％，最大单杂0.01％，纯化收率为83.3％，总收率为62.0％。
实施例4：
称取200mmol曲普瑞林粗肽，共282.1克，用10％乙腈水溶液按5mmol/l溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解，放入30℃恒温水浴锅60min，用0.45μm混合滤膜过滤，收集滤液，hplc检测定量含目的肽194.8克。
一次纯化：色谱柱：反相聚合物填料10μm、
二次纯化：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料8μm、
转盐：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料，柱子直径和长度为150mm×250mm；上样量：目的肽18.7克/针；流动相a：50mmol/l醋酸铵水溶液，流动相b：乙腈；流速：400ml/min；检测波长：230nm；按体积比95:5等度洗脱15min。后用流动相a：0.04％醋酸水溶液(v/v)，流动相b：乙腈；流速：400ml/min；检测波长：230nm；梯度：b％相10％-30％，线性洗脱40min，收集纯度大于99.9％，单杂小于0.02％的样品，hplc检测定量含目的肽163.1克，转盐收率为97.4％。将合格品于32℃水温条件下减压旋蒸浓缩，冻干，得醋酸曲普瑞林162.6克。纯度为99.91％，最大单杂0.02％，纯化收率为83.5％，总收率为62.0％。
实施例5：
称取500mmol曲普瑞林粗肽，共705.2克，用5％乙腈水溶液按5mmol/l溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解，放入32℃恒温水浴锅90min，用0.45μm混合滤膜过滤，收集滤液，hplc检测定量含目的肽487.0克。
一次纯化：色谱柱：反相聚合物填料10μm、
二次纯化：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料8μm、
转盐：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料，柱子直径和长度为300mm×300mm；上样量：41.5克/针；流动相a：50mmol/l醋酸铵水溶液，流动相b：乙腈；流速：2000ml/min；检测波长：230nm；按体积比95:5等度洗脱15min。后用流动相a：0.05％醋酸水溶液(v/v)，流动相b：乙腈；流速：2000ml/min；检测波长：230nm；梯度：b％相10％-30％，线性洗脱40min，收集纯度大于99.9％，单杂小于0.02％的样品，hplc检测定量含目的肽402.6克，转盐收率为97.2％。将合格品于32℃水温条件下减压旋蒸浓缩，冻干，得醋酸曲普瑞林401.2克。纯度为99.90％，最大单杂0.02％，纯化收率为82.4％，总收率为61.2％。
实施例6：
称取500mmol曲普瑞林粗肽，共705.2克，用5％乙腈水溶液按5mmol/l溶解粗肽，搅拌使样品完全溶解，放入32℃恒温水浴锅60min，用0.45μm混合滤膜过滤，收集滤液，hplc检测定量含目的肽486.4克。
一次纯化：色谱柱：反相聚合物填料10μm、
二次纯化：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料8μm、
转盐：色谱柱：反相十八烷基硅烷键合硅胶填料，柱子直径和长度为300mm×300mm；上样量：41.3克/针；流动相a：50mmol/l醋酸铵水溶液，流动相b：乙腈；流速：2000ml/min；检测波长：230nm；按体积比95:5等度洗脱15min。后用流动相a：0.05％醋酸水溶液(v/v)，流动相b：乙腈；流速：2000ml/min；检测波长：230nm；梯度：b％相10％-30％，线性洗脱40min，收集纯度大于99.9％，单杂小于0.02％的样品，hplc检测定量含目的肽400.3克，转盐收率为97.0％。将合格品于32℃水温条件下减压旋蒸浓缩，冻干，得醋酸曲普瑞林399.2克。纯度为99.90％，最大单杂0.02％，纯化收率为82.1％，总收率为60.9％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。