一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶及其编码基因、重组载体、重组工程菌及应用的制作方法

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体而言，涉及一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶及其编码基因、重组载体、重组工程菌及应用。

背景技术：

福建金线莲(anoectochilusroxburghii)是多年生草本植物，生长在福建地区，属兰科开唇兰属金线莲种。福建金线莲中重要药理活性的物质主要为：黄酮类化合物，甾体类化合物，三萜类化合物，糖类成分，生物碱，强心甙类，酯类，牛磺酸，多种氨基酸，微量元素及无机元素等。在民间素有“药王”、“金草”、“神草”、“鸟人参”等美称。其中，福建金线莲中的多糖、黄酮类化合物、甾体等被认为是重要的活性物质，这些物质的合成直接影响了福建金线莲的药用价值。

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase，pal)是黄酮类物质合成代谢途径中关键的酶基因。黄酮类化合物合成代谢途径中，最先催化的酶就是苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,pal)，它可以催化l-苯丙氨酸(l-phenylalanine)生产反式肉桂酸(trans-cinnamicacid)。产生的反式肉桂酸，在氧和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadeninedinucleotidephosphate,nadph)同时存在的条件下，经过肉桂酸4-羟基酶(cinnamicacid4-hydroxyenzyme,c4h)催化，可以生成4-羟基香豆酸(4-hydroxycinnamateacid)。接着4-羟基香豆酸-辅酶a连接酶(4-hydroxycinnamateacid-coenzymealigase,4cl)催化连接，将前一步骤生成的4-羟基香豆酸转化为4-羟基香豆酰-coa等硫酯，此步骤需要atp提供能量。产生的4-羟基香豆酰-coa可与丙二酰-coa在查尔酮合酶的作用下反应，生成查尔酮(chalcone)。之后进入黄酮合成代谢的5条支路(异黄酮支路、橙酮支路、黄酮支路、花青素支路和黄酮醇支路)。因此，苯丙氨酸解氨酶是植物连接主生和次生代谢的重要限速酶，在黄酮类化合物合成代谢途径中起重要作用，其活性与各种黄酮类化合物的合成代谢和积累密切相关。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶。

本发明的第二目的在于提供一种福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因。

本发明的第三目的在于提供一种含有福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因的重组载体。

本发明的第四目的在于提供一种含有福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因的重组工程菌。

本发明的第五目的在于提供一种福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因在表达苯丙氨酸解氨酶中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶，酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。

一种编码如上述的福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因。

一种含有上述的福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因的重组载体。

一种含有上述的福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因的重组工程菌。

上述福建金线莲的苯丙氨酸解酶的编码基因在表达苯丙氨酸解氨酶中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶，其序列是一种新的苯丙氨酸解氨酶基因序列，是金线莲主要药用成分黄酮类物质合成过程中的关键酶基因，在黄酮类化合物合成代谢途径中起重要作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为基因cds序列电泳检测结果图；

图2为福建金线莲pal预测的蛋白三级结构图；

图3为福建金线莲pal蛋白发生关系树分析；

图4为基因不同组织表达模式图；

图5为基因在4mg/lphe下12h内的表达模式图；

图6为基因在100mmnacl下12h内的表达模式图；

图7为基因在253.7nm紫外胁迫下12h内的表达模式图；

图8为基因在红光胁迫下12h内的表达模式图；

图9为瞬时表达载体pc2300-35s-pal-egfp；

图10为福建金线莲pal蛋白的亚细胞定位；

图11为福建金线莲pal基因southernbotting结果图；

图12为转福建金线莲pal基因拟南芥的筛选图；

图13为转基因拟南芥的pcr检测图；

图14为转基因拟南芥的总黄酮富集情况。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例

一、为金线莲总叶片rna的提取和纯化，总rna提取使用大连宝生物有线公司的trizol提取试剂盒，包括下述步骤：

(1)分别取约100mg研磨后的粉末装入1.5ml离心管，然后立即加入1mlrnaisoplus，颠倒混匀。

(2)将充分混匀的匀浆液在室温静置5min，然后12000g，4℃离心5min。

(3)吸取上清液800ml转入新的离心管中，切勿吸取沉淀，然后加入上清液体积200ml氯仿，并剧烈振荡混匀至匀浆液乳化呈乳白色，然后室温静置5min。

(4)将混合液在12000g，4℃离心15min，此时匀浆液分为三层。从上至下分别是：上清液(含rna)、中间的白色层(大部分为dna)及有颜色的下层有机相。

(5)吸取上清液400ml转移至新的离心管中，切勿触碰中间层。然后加入400ml的异丙醇并颠倒混匀，然后室温下静置10min。

(6)将静置后的溶液在12000g，4℃离心10min，此时可见白色絮状的rna。小心弃掉上清并加入1ml75％乙醇，上下颠倒洗涤rna后弃去上清。

(7)打开离心管盖室温干燥rna几分钟后，加入30μl的rnase-free水溶解rna。

(8)使用超微量分光光度计(bio-rad，美国)测定a260的值来计算总rna的浓度，读取od260/od280的值来估计总rna纯度和完整性。用1.2％琼脂糖凝胶电泳，135v快速检测rna质量。

二、为福建金线莲的转录组测序，方法如下：

提取福建金线莲叶片的总rna，检测rna提取质量，满足建库要求(rna浓度>250ng/μl，总量>20μg，od260/od280在1.8～2.2之间，完整性良好，rin>6.5)。然后，用磁珠富集poly(a)mrna打断成段片段，以此为模板，依次合成第1条cdna链和第2条cdna链，经过纯化、洗脱、末端修复、加poly(a)后连接测序接头。选择200bp～700bp大小的片段进行pcr扩增，建立cdna测序文库，用iiiuminahiseq2000进行测序。该部分实验委托美因科技服务有线公司完成。

使用短reads组装软件trinity(v2.4.0)做denovo组装，得到不含n的contig组装片段后，使用tgicl(v2.1)进行去冗余，除去序列中质量低、不确定的序列。保留大于200bp的序列进行后续分析。利用transdecoder(v2.0.1)对上述拼接结果进行基因结构预测，预测结构后用于后续分析。

三、为福建金线莲cdna第一链合成，方法如下：

以上述实施例1所得的纯化的金线莲叶片总rna作为模板，以oligo(dt)18为逆转录引物，采用primescripttmreversetranscriptase(takarachina)按照smart^tmpcrcdnasynthesiskit(clontechusa)操作说明进行cdna第一链的合成。反应体系总体积为20μl。

(1)在0.2mlpe管中配制逆转录混合液1(表1)；

(2)在另一0.2mlpe管中配制下列逆转录混合液2(表2)；

(3)将第一步配置的逆转录混合液165℃保温5min后迅速在冰上急冷2min，离心数秒钟使模板rna、引物等的混合液聚集于pe管底部；

(4)将第二步配置的逆转录混合液2加入第一步配置的反应液中，用移液枪轻轻混合后42℃反应90min；

(5)80℃保温5min后冰上冷却，得到的cdna溶液可以直接用于后续实验。

表1逆转录混合液1

表2逆转录混合液2

四、为金线莲总叶片dna的提取和纯化，总dna提取使用ctab法，包括下述步骤：

(1)取组织约100mg，加入液氮充分碾磨，加入400μl缓冲液fp1和6μl的rnasea(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min。

(2)加入130μl缓冲液fp2，充分混匀，涡旋振荡1min。

(3)12000r/min离心5min，将上清转移至新的离心管中。

(4)重复步骤3，以除去上清液中的沉淀杂质，使提取基因组dna纯度更高。

(5)向上清液中加入0.7倍体积预冷的异丙醇并充分混匀，此时会出现絮状基因组dna。然后12000r/min离心2min，弃上清并保留沉淀。

(6)加入1ml70％乙醇，涡旋振荡10s后，12000r/min离心2min，弃上清。

(7)重复步骤6。

(8)开盖倒置，室温5～10min，待残余的乙醇彻底挥发后，加入适量洗脱缓冲液te溶解dna，其间颠倒混匀数次，最终得到dna溶液。

五、为福建金线莲pal基因开放阅读框及编码区的克隆，方法如下：

在福建金线莲转录组测序拼接得到pal基因的cds序列的基础上，采用primerpremier5.0软件设计引物(palf/palr:5'-atggaccatgctagggagaacg-3'/5'-ctagcaaatagggagaggagcttca-3')，设计好的引物在oligo6.0中分析物引物的特异性。反应程序为：95℃预变性3min；之后按95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min扩增38个循环。pcr反应采用50μl体系(表3)。

表3pcr反应体系

取所得扩增产物50ul经1％非变性琼脂糖凝胶180v电泳30min，goldenview染色后紫外线检查扩增片段，结果如图1(a为开放阅读课扩增，b为基因编码区(含内含子)扩增，m为marker，1为台湾金线莲，2为福建金线莲)。说明福建金线莲和台湾金线莲开放阅读框和编码区片段大小相似。

目的片段的回收：

将扩增出来的特异条带用干净的刀片在紫外灯下快而准的从琼脂糖中挖出，置于1.5ml离心管中，用凝胶回收试剂盒(omega公司的e.z.n.a.tmgelextractionkit)回收胶中的dna片段。

连接反应：

将回收的dna片段克隆与takara公司的pmd19-t载体中。连接反应采用连接试剂盒(takara公司)，连接体系总体积10ul，16℃连接过夜。

感受态细胞的制备：

从lb平板上挑取新活化的e.colidh5a单菌落，接种于3-5mllb液体培养基中，37℃，225r/min振荡培养12h左右，直至对数生长后期。将该菌液悬浮液以1：:10-1:50的比例接种于100mllb液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至od600＝0.35-0.5左右。

将培养液转入离心管，冰上放置10min，然后于4℃下3000r/min离心10min.

弃去上清，用预冷的0.05mol/l的cacl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000r/min离心10min。

弃上清，加入4ml预冷含15％甘油的0.05mol/l的cacl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬浮液。

感受态细胞分装成100ul的小份，贮存于-70℃可保存半年。

质粒dna的转化：

从-70℃冰箱中取出一管大肠杆菌感受态细胞dh5a，置于冰上融化。

在无菌条件下加入10ml连接反应液，轻轻震荡混匀后，在冰上放置30min。

42℃水浴热击90s，不要摇动，之后迅速放入冰浴冷却2-3min.

加入890ul无amp的lb液体培养基，混匀后，37℃、150r/min摇床振摇培养，温育1h。

取100ul已转化的菌液涂于一个lbamp的培养平板上，正面朝上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住，然后倒转培养皿，37℃避光培养12-16h；随后筛选阳性菌落。

重组菌落的鉴定和保存

从外观上看，一般白色且圆的菌落为阳性，通过菌液pcr进行进一步鉴定。

在过夜培养的平板上用灭菌的小枪头挑取几个白色菌落，分别点种于0.1g/lamp的lb液体培养基的1.5ml离心管中，37℃，150r/min振摇培养4-6h。

取1ul菌悬液作为模板，用引物palf/palr进行pcr扩增，pcr反应条件中裂解时间延长至5min，用1％的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。如果产物为目的条带时，此菌落为阳性克隆，否则为阴性。同时设不加菌悬液的阴性对照。

取已经鉴定的阳性克隆的菌落悬浮液750ul，加入250ul的灭菌甘油，混匀后，用液氮速冻，置于-70℃冰箱中保存备用。

最后送英俊生物技术公司测序，所得序列在ncbi的blastn进行比对分析，验证克隆片段正确。

扩增得到的产物为arpal基因cdna开放阅读框序列和编码区序列，其中，氨基酸序列为seqidno.1，编码区核苷酸序列为seqidno.2，开放阅读框核苷酸序列为seqidno.3。

六、为arpal蛋白生物信息学分析，方法如下：

使用protparam(http://web.expasy.org/protparam/)对其物理和化学性质进行分析。福建金线莲pal基因全长2148bp，编码区序列同为2733bp，第408至993bp之间插入1个长585bp的内含子，编码715氨基酸。pal蛋白具有2个pal典型的保守域，苯丙氨酸和组氨酸结构功能域(gtitasgdlvplsyia)和ala-ser-gly活性位点形成的mio区域。此外，严格保守位点(y109,l137,s202,n259,q347,y350,r353,f399和q487)，脱氨作用位点(l205,v206,l255,和a256)，催化活性位点(n259,g260,ndn381–383aa,h395和hnqdv485-488aa)以及磷酸化位点(vakrvltf542-549aa)都能在福建金线莲pal蛋白相应位置找到。利用expasyproteomicsserver提供的在线工具protparam对pal基因编码蛋白的理化性质进行预测，推测该蛋白相对分子质量为77.4kda，等电点pi6.26。

使用goriv(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_gor4.html)；对pal基因的二级结构进行预测。二级结构在线预测的结果表明，α-螺旋(alphahelix)，占总氨基酸的48.67％，伸展链(extendedstrand)，占所有氨基酸的9.79％，无规则卷曲(randomcoil)，占总氨基酸的41.54％。

通过swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)来对于福建金线莲的pal基因进行蛋白三级结构的预测，通过pymolviewer作图，三维模型见图2。

最后先找到同源性较高植物的pal氨基酸序列，利用clustalw方法进行氨基酸序列的比对，通过mega7.0构建neighbor-joining系统进化树如图3(框体为福建金线莲所处位置)。

七、为arpal内源表达检测，方法如下。

(1)材料处理

将培养4个月的福建金线莲组培苗移栽至装有营养土(营养土:蛭石＝3:1)的花盆中，在温度25℃(昼)/20℃(夜)、相对湿度60～70％和光照200μmol/m²·s(14h)/黑暗(10h)的条件下培养。适应3～5天，长势均匀一致的未处理幼苗取根、茎、叶样品，液氮速冻-70℃保存。其余长势均匀的幼苗分为两组，一组进行紫外光照射处理，另一组进行红光照射处理。紫外光照射处理：将盆栽的金线莲放置于紫外和红光培养箱中，紫外辐射波长253.7nm，红光波长650nm，分别处理0h、0.5h、1h、2h、4h、8h和12h。每个各处理重复3次，在各处理时间点立即取样液氮速冻-70℃保存。

将培养4个月的福建金线莲组培苗移至带孔的塑料泡沫板上，用hoagland营养液培养3～5d，选长势均匀一致的幼苗进行苯丙氨酸和盐胁迫处理。苯丙氨酸和盐胁迫处理即是将phe和nacl加入hoagland营养液至终浓度4mg/l和100mmol/l，分别处理0h、0.5h、1h、2h、4h、8h和12h。每个各处理重复3次，在各处理时间点立即取样液氮速冻-70℃保存。

(2)rna提取

取上述3种胁迫处理及对照组幼苗的叶片，分别液氮速冻研磨，使用总rna提取试剂盒trizol(takara，大连)并按照其说明书提取总rna。步骤如实施例1。

(3)cdna第一链合成

以提取的rna为模板，按照表4体系加样，42℃反应2min，去除可能的基因组dna(gdna)，用primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒(takara，大连)，按表5体系加样，37℃温浴30min，85℃保持5s终止反应以反转录合成cdna，并于-20℃保存备用。

表4gdna去除反应体系

表5cdna合成体系

(4)qrt-pcr引物的特异性检测

以0h对照cdna样品3倍稀释后用作qrt-pcr反应的模板，采用50～65℃的退火温度梯度进行qrt-pcr反应来确定最佳的退火温度，采用20μl反应体系(表6)。黄酮合成代谢途径中关键酶基因的引物序列如表7。

表6qrt-pcr反应体系

表7qrt-pcr引物序列

反应管采用百乐硅化后的0.2mlpcr板。qrt-pcr在iq^tm5thermalcycler(bio-radusa)进行。反应程序为：95℃预变性10s；然后按95℃变性10s，50～65℃退火20s，72℃延伸20s，并在此温度收集荧光，读板(plateread)的程序进行46个循环。之后从50℃开始，以每步0.5℃的温度梯度升高至95℃，每步温度保持5s。

(5)qrt-pcr反应

将逆转录的cdna样品3倍稀释后用作qrt-pcr扩增的模板，反应管采用硅化后的0.2ml的pcr板，采用20μl反应体系(表6)，并设立以ddh2o为模板的阴性对照。单个逆转录的cdna样品设三次重复。

qrt-pcr反应程序为：95℃预变性10s，然后按95℃变性10s，最适退火温度退火20s，72℃延伸20s，并在此温度收集荧光，读板(plateread)的程序进行46个循环。之后最后从50℃开始，以每步0.5℃的速度升高至95℃，每个温度保持5s，绘制熔解曲线。

(6)qrt-pcr数据分析

本实验采用双标准曲线法对黄酮代谢合成途径中的关键酶基因的表达水平进行相对定量。采用δδct(normalizedgeneexpression)法计算基因的相对表达量。

0h对照与处理间的表达差异以及各处理间的表达差异用spss(version10.0inc.chicago，il)统计分析软件进行分析。设立p＝0.05和p＝0.01两个差异显著性水平。福建金线莲pal基因不同组织表达模式图如图4(浅色柱子表示福建金线莲pal基因的表达量，深色柱子表示台湾金线莲的表达量，*表示差异显著，**表示差异极显著)，福建金线莲pal基因在4mg/lphe下12h内的表达模式图如图5(浅色柱子表示福建金线莲pal基因的表达量，深色柱子表示台湾金线莲的表达量，*表示差异显著，**表示差异极显著)，100mmnacl下12h内的表达模式图如图6(浅色柱子表示福建金线莲pal基因的表达量，深色柱子表示台湾金线莲的表达量，*表示差异显著，**表示差异极显著)，福建金线莲pal基因在253.7nm紫外胁迫下12h内的表达模式图如图7(浅色柱子表示福建金线莲pal基因的表达量，深色柱子表示台湾金线莲的表达量，*表示差异显著，**表示差异极显著)，福建金线莲pal基因在红光胁迫下12h内的表达模式图如图8(浅色柱子表示福建金线莲pal基因的表达量，深色柱子表示台湾金线莲的表达量，*表示差异显著，**表示差异极显著)。福建金线莲pal基因与台湾金线莲pal基因虽然片段大小氨基酸数目，所含结构功能与相同，但是它们在苯丙氨酸、盐、紫外和红光胁迫下，pal基因表达量不同。

八、为arpal蛋白的亚细胞定位，首先为瞬时表达载体的构建。

根据福建金线莲pal基因orf序列，在其5’和3’端添加瞬时表达载体(图9)构建所需的限制性酶切位点及保护碱基，用premier5.0软件设计不含有终止密码子的特异引物[5′-tcccggg(smai)atggaccatgctagggagaacg-3′/5′-cgcactagt(spei)gcaaatagggagaggagcttca-3′]。

(1)以上述插入pal基因orf的pdm19-t质粒为模板，按表4反应体系加样，进行pcr扩增。pcr温度循环体系程序设置为：94℃，3min；98℃10s，62℃30s，72℃60s，扩增循环38次；最后72℃延伸5min。

(2)扩增产物用1％非变性琼脂糖凝胶电泳分离，chemidoc^tmxrs型凝胶成像系统(bio-rad，美国)成像，用凝胶回收试剂盒(天根，北京)回收纯化目的片段。

(3)按表8反应体系加样，使用快切酶在30℃条件下酶切0.5h。酶切产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，用凝胶回收试剂盒(天根，北京)回收纯化。

表8目的片段smai/spei双酶切反应体系

(4)按照表9反应系统加样，用t4dna连接酶连接回收纯化的双酶产物，16℃连接8h。

表9连接反应体系

(5)用热激转化法将连接产物转化并对重组菌落进行pcr鉴定。

(6)提取上述步骤中的质粒dna，经过对应快切酶smai和spei双酶切鉴定后，取少量质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，验证载体构建正确。接着，在洋葱鳞茎表皮细胞中的瞬时表达检测。

(7)取新鲜洋葱鳞茎第5层鳞片，切成2cm×2cm方块，取内表皮铺于1/2ms平板，25℃培养4h。

(8)称取60mg金粉(直径60μm)放置于1.5ml离心管中，向装有金粉的离心管中加1ml70％乙醇，在涡旋振荡上剧烈震荡15min，以1300g的转速，室温下离心1min，取弃离心管中的上清液体，重复该步骤三次。最后加入无菌水，放入-20℃保存备用。

(9)取5μl金粉悬浮液于1.5ml的进口离心管中，加入1μl瞬时表达载体dna(1.0μg/μl)、8μl高压灭菌的2.5mol/lcacl2、4μl抽滤灭菌的0.1mol/l亚精胺，混合后，在涡旋振荡器上剧烈震荡3min，并在冰浴静置15min。

(10)以1200g的转速，室温条件下，瞬间离心10s，取弃上清液体，加入100μl分析纯浓度的无水乙醇，在涡旋振荡器上震荡重悬金粉。

(11)以12000g的转速，室温条件下，瞬间离心10s，除弃上清液，加入15μl分析纯浓度的无水乙醇，在涡旋振荡器震荡重悬，使液体均匀。

(12)基因枪使用pds-1000/he型基因枪(bio-rad，美国)，设置条件为：样品室真空度26inhg，可裂膜压力为1100psi，在靶距6cm处。取10μl悬浮液平均点涂在转化载片的中央区域，在上述条件下，将转化载片中央区域包裹着瞬时表达载体的金粉均匀打入培养好的洋葱鳞茎内表皮细胞。

(13)用黑色塑料袋包裹放有转化后的洋葱内表皮的培养基，在25℃下培养。

(14)16至24h后，取培养基上的洋葱表皮制片，在bx63型荧光显微镜(olimpas,日本)下观察拍照。结果如图10(apc2300-35s–egfp的亚细胞定位，bpc2300-35s-pal-egfp的亚细胞定位)，亚细胞定位于细胞核中。

九、为pal的拷贝数鉴定，具体方法如下：

根据福建金线莲pal基因orf序列，用premier5.0软件设计一对的特异引物(5′-agcaagattacgccttgcct-3′/5′-atgagggggttgtcgttgac-3′)。回收的pcr产物使用地高辛标记(随机引物法)，反应按southernblot试剂盒说明进行，步骤如下：

(1)向200μlpcr管中加入1μg模板dna和高压灭菌的双蒸水，终体积达16μl。

(2)沸水浴10min以变性dna，然后迅速插入冰水混合物中。

(3)充分混合dig-highprime，并取4μl加入到变性dna中，混合并简单离心后置于pcr仪中37℃孵育过夜。

(4)65℃加热10min终止反应。

接着提取福建金线莲总dna，设置反应体系为50μl，分别选取3种限制性内切酶对福建金线莲和台湾金线莲总dna进行酶切消化，最适温度下过夜反应，反应体系见表10。

表10金线莲总dna的酶切

将从上述酶切反应体系中，取2μl(0.8μg)在含goldenview的0.8％琼脂糖凝胶中50v电泳6h，照相记录电泳结果。剩余样品点样于无dna染色剂的0.7％琼脂糖凝胶进行电泳。电泳结束后，使用双蒸水洗涤凝胶两次，去除凝胶多余部分并切去左角标记正反面。加入100ml0.25mol/l的盐酸脱嘌呤，室温震荡15min，至溴酚蓝完全变成黄色，用蒸馏水冲洗2次。再加入变性液室温震荡40min：至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色。在转印迹槽中，倒入20×ssc溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上从下向上依次置入：两张凝胶等宽的滤纸，将滤纸纵向自固相支持物垂于转印迹槽中(简称“桥”)，底面在上的凝胶，尼龙膜(与凝胶等大)，滤纸(与凝胶等大，事先用20×ssc浸湿)，吸水纸(略小于滤纸，5-8cm高)，400-800g重物。将带正电荷的尼龙膜和凝胶置于转印迹装置中，四周用pe薄膜包围防止短路，转膜18h。转膜结束后，滤膜置于2×ssc漂洗5min，用滤纸吸干。尼龙膜置于120℃下固定30min。现将杂交液和杂交仪预热到37℃，尼龙膜置于10ml杂交液预杂交90min(膜置于盒子中，可自由移动)。取5μl标记好的探针于沸水浴中变性5min，并迅速插入冰水混合物中。将变性好的探针加入10ml杂交液中，充分混匀。尼龙膜置于杂交液中42℃温和振荡20h。[探针杂交温度是根据gc含量和探针与靶片段的相似百分数计算获得，公式如下：tm＝49.82+0.41×38(％g+c)–(600/i)，(i＝能够杂交上的片段的长度，以碱基对进行计算)]。使用2×ssc0.1％sds于室温连续振荡洗涤2次，每次5min。之后，用预热到65℃的0.5×ssc0.1％sds连续振荡洗涤2次，每次15分钟。先用洗涤缓冲液淋洗尼龙膜2min；将尼龙膜于50ml1×封阻液中室温静置封阻35min；抗体于12000r/min离心5min，取上层抗体溶液4μl，加入20μl封阻液中混匀，覆盖尼龙膜，室温静置40min；用足量的洗涤缓冲液温和振荡洗涤2次，每次15min；用足量的洗涤缓冲液温和振荡洗涤2次，每次15min；尼龙膜置于15ml显色液中，静置，避光，密闭显色4-16h。使用成像仪对密闭显色的尼龙膜拍照保存，结果如图11(用bamhi和saci两种酶酶切，southernbotting均为三拷贝。)所示。用bamhi和saci两种酶酶切，southernbotting均为三拷贝。说明福建金线莲pal基因为多拷贝基因。

十、为pal基因在中的异源表达，具体方法如下：

(1)分别取适量野生型拟南芥种子置于1.5ml离心管中，加入75％酒精浸泡30s，然后弃掉酒精并加入10％naclo消毒10min。

(2)消毒结束后，用无菌水清洗种子3～4次，待种子沉下后，弃上层的水。

(3)将种子播种于1/2ms培养基平上，避光4℃处理48h。

(4)将平板置于培养室，温度20～22℃，湿度60～70％，约2周后将幼苗移栽至装有营养土(营养土:蛙石＝4:l)的培养钵中，营养土在移苗前吸透水。

(5)移栽后的幼苗短日照(10h光照/14h黑暗)培养4周后，长日照培养(16h光照/8h黑暗)，待植株已抽薹且长出花蕾时准备浸染。

(6)取含有pc2300-35s-pal-egfp的重组质粒的农杆菌，在含有50mg/lkan和50mg/lrif的yep平板上划线，28℃培养2～3d。

(7)挑取农杆菌单菌落接种在3mlyep液体培养基中(含kan和rif，浓度均为50mg/l)，28℃，250r/min，振荡培养过夜。

(8)在100ml液体yep培养基中(含kan和rif，浓度均为50mg/l)，接种1ml过夜培养的起始农杆菌菌液，28℃振荡培养至菌液od600值为1.2～1.5。

(9)4℃，5000r/min离心10min收集细胞，用5％蔗糖溶液悬浮菌体并调od600值至0.8～1.0，按1/10000至2/10000的比例加入表面活性剂silwetl-77。

(10)在浸染前剪掉已形成的果荚和已经开放的花，将生长有拟南芥的培养钵侧放，使拟南芥的花蕾完全浸入浸染液中大约1～2min，将浸染后的植株黑暗培养过夜。

(11)黑暗培养结束后，将浸染后的植株放置在培养室继续培养，待其成熟后收集种子，进行下一步的筛选。

(12)将收获的浸染后种子按上述种子表面消毒步骤进行消毒。

(13)将表面消毒后的种子播种至含30mg/lhyg或50mg/l的kan的1/2ms培养基，避光4℃处理2d后，转移至培养室培养。

(14)培养约2周后，阳性转基因植株呈绿色并生长正常，阴性苗则不生长或黄化死亡(图12)。将阳性转基因植株移栽至培养钵中培养，待其成熟并单株收种。

(15)重复上述筛选步骤，直至收获t3代纯合的转基因植株。

十一、为转pal基因水稻的pcr验证，具体方法如下：

(1)取t3代过表达和功能互补的纯合株系的叶片，提取基因组dna。

(2)用primerblast软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)设计特异引物(5’-catttggagaggacagggtacc-3’/5’-ctagcaaatagggagaggagcttca-3’)，并扩增跨启动子2174bp片段。

(3)1.2％非变性琼脂糖凝胶电泳分离，chemidoctmxrs型凝胶成像系统(bio-rad，美国)成像，从再生植株中筛选阳性转基因植株。结果如图13(f-1，f-2和f-3为转台湾金线莲pal基因的过表达拟南芥，r-1和r-2为转福建金线莲pal基因的过表达拟南芥，r表示转福建金线莲pal基因，+表示阳性质粒，-表示未转基因株系)所示。

十二、为转基因拟南芥总黄酮含量检测，具体步骤如下：

(1)称取转福建金线莲pal基因的水稻叶片，烘干研磨粉状样品1.000g于20ml于锥形瓶中，重复3次。

(2)加入95％乙醇10ml，在kq-100dv型超声波仪(昆山市超声仪器有限公司)内，30℃提取30min，用3μm滤纸过滤，收集滤液。

(3)残渣加同样浓度乙醇，按步骤(2)再次超声波提取，3μm滤纸过滤，收集滤液，与步骤(2)滤液合并。

(4)取上述滤液各2ml(空白对照加入2ml95％的乙醇)，加入100g/lal(no3)31ml、9.8g/l醋酸钾1ml，摇匀后静置30min。

(5)用1cm比色杯，在uv-1800型紫外-可见分光光度计(岛津，日本)上，测定415nm吸光值。结果如图14(f-1，f-2和f-3为转台湾金线莲pal基因的过表达拟南芥，r-1和r-2为转福建金线莲pal基因的过表达拟南芥，*表示差异显著，**表示差异极显著)所示。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

sequencelisting

<110>三明学院

<120>一种福建金线莲的苯丙氨酸解氨酶及其编码基因、重组载体、重组工程菌及

应用

<160>3

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