用于癌症疗法的抗体药物缀合物的皮下施用的制作方法
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本发明涉及皮下施用抗体-药物缀合物(adc)，所述抗体-药物缀合物包含与抗体或抗原结合抗体片段缀合的一个或多个细胞毒性药物部分。优选地，所述抗体是优选地与sn-38缀合的抗trop-2、抗ceacam5、抗cd20、抗cd74、抗cd22、抗cd30、抗cd46或抗hla-dr抗体。更优选地，可使用诸如cl2a的接头将药物附接至所述抗体或抗体片段。然而，可使用其他接头、某些其他已知的细胞毒性药物以及将药物缀合至抗体的其他已知的方法。最优选地，所述抗体或其抗原结合片段结合至人抗原。所述抗体或片段可与每个抗体或片段，药物部分或药物-接头部分的1-12、1-6、1-5、6-8或7-8个拷贝附接。所述adc用于治疗实体癌，如乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、上皮癌、尿路上皮癌和头颈癌；或液体瘤，如淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)、白血病(淋巴性和骨髓性)和多发性骨髓瘤。adc可特别用于治疗对一种或多种标准抗癌疗法具有耐药性的癌症，如三阴性乳腺癌、转移性胰腺癌、转移性胃肠癌、转移性尿路上皮癌、转移性结肠直肠癌、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病或多发性骨髓瘤。adc可单独使用或与一种或多种选自由以下组成的组的治疗方式一起作为组合疗法使用：外科手术、放射疗法、化学疗法、免疫调节剂、细胞因子、化学治疗剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、细胞毒性剂、药物、毒素、放射性核素、rnai、sirna、第二抗体或抗体片段以及免疫缀合物。在优选的实施方案中，adc与其他治疗方式的组合表现出协同作用，并且比单独adc或其他治疗方式或单独施用的adc和其他治疗方式的作用果的总和更有效地诱导癌细胞死亡。出人意料地，adc的皮下施用不会在施用部位产生不可接受的局部毒性，这是选择在adc中连接的适当药物的基础，因为许多在一定浓度以上具有引起局部组织坏死的毒性概况。如连接在剂中，使用sn-38作为adc中的选择的药物，沙西妥珠单抗戈维替康、拉贝珠单抗(抗ceacam5)戈维替康、抗ceacam6/sn-38、依帕珠单抗(抗cd22)戈维替康、抗cd74/sn-38和抗cd20/sn-38由于缺乏在注射部位引起的局部毒性而是优选的。
相关技术
多年来，特定靶向药物治疗领域的科学家一直致力于使用单克隆抗体(mab)将毒性剂特异性递送至人癌症。肿瘤相关mab和合适毒性剂的缀合物已被开发出，但已经在人癌症的治疗中获得各种成功。毒性剂最常见的是化学治疗药物，但是发射粒子的放射性核素或细菌或植物毒素也与mab缀合，特别是用于治疗癌症(sharkey和goldenberg,cacancerjclin.2006年7月-8月；56(4):226-243)，并且最近，放射免疫缀合物用于某些感染性疾病的临床前治疗(dadachova和casadevall,qjnuclmedmolimaging2006；50(3):193-204)。
使用mab-化学治疗药物缀合物的优点是(a)化学治疗药物本身在结构上明确地定义；(b)使用非常明确定义的缀合化学将化学治疗药物连接至mab蛋白，通常在远离mab的抗原结合区的特定位点；(c)mab-化学治疗药物缀合物可比涉及mab和细菌或植物毒素的化学缀合物更可重复地制备并且通常具有更低的免疫原性，并且因此更易于商业开发和监管批准；(d)mab-化学治疗药物缀合物在系统上比放射性核素mab缀合物的毒性低几个数量级，特别是对辐射敏感的骨髓而言。
目前，极少数细胞毒性药物皮下施用以用于癌症治疗(例如leveque等人,2014,anticancerres34:1579-86)。这是因为大多数已知的抗癌细胞毒性剂是刺激剂和/或起疱剂，已知其在外渗后在皮下或真皮下组织中引起局部损伤(leveque等人，2014)。虽然与抗体缀合可能降低局部毒性，但单克隆抗体曲妥珠单抗和阿仑单抗的低吸收率也可能表明难以皮下施用抗体-药物缀合物(adc)(leveque等人，2014)。另一个困难是需要维持皮下施用的低注射体积，这进而需要高浓度的adc用于皮下使用(leveque等人，2014)。
对于更有效的制备和施用抗体-药物缀合物，如抗体-sn-38缀合物的方法存在需要。优选地，所述方法包括优化的给药和皮下施用方案，所述给药和皮下施用方案使用于人患者的治疗用途的抗体-药物缀合物的功效最大化并使毒性最小化。
技术实现要素：
在各种实施方案中，本发明涉及用抗体-药物缀合物(adc)治疗癌症，优选地通过皮下施用。所述adc可单独使用或作为与一种或多种其他治疗方式的组合疗法使用，所述其他治疗方式如外科手术、放射疗法、化学疗法、免疫调节剂、细胞因子、化学治疗剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、细胞毒性剂、药物、毒素、放射性核素、rnai、sirna、第二抗体或抗体片段或免疫缀合物。在优选的实施方案中，所述adc可用于治疗标准疗法无效的癌症，如转移性胰腺癌、转移性结肠直肠癌或三阴性乳腺癌。更优选地，adc与其他治疗方式的组合比单独使用或个别治疗的作用的总和更有效。
在具体优选实施方案中，抗trop-2抗体可以是人源化rs7抗体(参见例如，美国专利号7,238,785，其附图和实施例部分以引用的方式并入本文)，其包含轻链cdr序列cdr1(kasqdvsiava，seqidno:1)；cdr2(sasyryt，seqidno:2)；和cdr3(qqhyitplt，seqidno:3)以及重链cdr序列cdr1(nygmn，seqidno:4)、cdr2(wintytgeptytddfkg，seqidno:5)和cdr3(ggfgssywyfdv，seqidno:6)。然而，如下文所讨论，其他抗trop-2抗体是已知的并且可用于主题adc中。许多用于癌症治疗的细胞毒性药物是本领域熟知的，并且任何这种已知的药物均可缀合至目标抗体，只要它不会引起局部部位的严重毒性、刺激或坏死。在更优选的实施方案中，与抗体缀合的药物是喜树碱或蒽环霉素，最优选sn-38或具有纳摩尔毒性的另一种药物(参见，例如，美国专利号9,028,833，其附图和实施例部分以引用的方式并入本文)。药物缀合的抗trop-2抗体可用于治疗任何trop-2阳性癌症，包括但不限于口腔癌、食道癌、胃肠道癌、肺道癌、肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、脑癌、结缔组织癌、甲状腺癌、肝癌、胆囊癌、膀胱(尿路上皮)癌、肾癌、皮肤癌、中枢神经系统癌、尿路上皮癌以及睾丸癌。
在另一个优选的实施方案中，包含抗ceacam5抗体(例如，hmn-14、拉贝珠单抗(labretuzumab))和/或抗ceacam6抗体(例如，hmn-3或hmn-15)的治疗性缀合物可用于治疗表达ceacam5和/或ceacam6的各种癌症中的任一种，如美国专利号7,541,440；7,951,369；5,874,540；6,676,924和8,267,865中所公开；所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。可使用抗ceacam5、抗ceacam6或两者的组合治疗的实体瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、口腔癌和胃癌。大多数癌，包括胃肠癌、呼吸道癌、泌尿生殖系统癌和乳腺癌表达ceacam5并且可用主题adc治疗。hmn-14抗体是包含轻链可变区cdr序列cdr1(kasqdvgtsva；seqidno:9)、cdr2(wtstrht；seqidno:10)和cdr3(qqyslyrs；seqidno:11)以及重链可变区cdr序列cdr1(tywms；seqidno:12)、cdr2(eihpdsstinyapslkd；seqidno:13)和cdr3(lyfgfpwfay；seqidno:14)的人源化抗体。hmn-3抗体是包含轻链可变区cdr序列cdr1(rssqsivhsngntyle，seqidno:15)、cdr2(kvsnrfs，seqidno:16)和cdr3(fqgshvppt，seqidno:17)以及重链cdr序列cdr1(nygmn，seqidno:18)、cdr2(wintytgeptyaddfkg，seqidno:19)和cdr3(kgwmdfnssldy，seqidno:20)的人源化抗体。hmn-15抗体是包含轻链可变区cdr序列sassrvsyih(seqidno:21)、gtstlas(seqidno:22)和qqwsynppt(seqidno:23)以及重链可变区cdr序列dyyms(seqidno:24)、fiankanghttdyspsvkg(seqidno:25)和dmgirwnfdv(seqidno:26)的人源化抗体。
在另一个优选的实施方案中，包含抗hla-drmab(如hl243)的治疗性缀合物可用于治疗淋巴瘤、白血病、皮肤癌、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫内膜癌、宫颈癌、睾丸癌、肾癌、肝癌、黑素瘤或其他产生hla-dr的肿瘤，如美国专利号7,612,180中所公开，其实施例部分以引用的方式并入本文。hl243抗体是包含重链cdr序列cdr1(nygmn，seqidno:27)、cdr2(wintytreptyaddfkg，seqidno:28)和cdr3(ditavvptgfdy，seqidno:29)以及轻链cdr序列cdr1(raseniysnla，seqidno:30)、cdr2(aasnlad，seqidno:31)和cdr3(qhfwttpwa，seqidno:32)的人源化抗体。
所述抗体部分可以是单克隆抗体、抗原结合抗体片段、双特异性或其他多价抗体或其他基于抗体的分子。所述抗体可具有各种同种型，优选地人igg1、igg2、igg3或igg4，更优选地包含人igg1铰链和恒定区序列。所述抗体或其片段可以是嵌合、人源化或人抗体，以及其变型，如半igg4抗体(被称为“单一抗体”)，如由vanderneutkolfschoten等人(science2007；317:1554-1557)所描述。更优选地，所述抗体或其片段可被设计或选择为包含属于特定同种异型的人恒定区序列，其可在所述adc施用至人受试者时导致减小的免疫原性。用于施用的优选同种异型包括非g1m1同种异型(ng1m1)，如g1m3、g1m3,1、g1m3,2或g1m3,1,2。更优选地，所述同种异型选自由以下组成的组：ng1m1、g1m3、ng1m1,2和km3同种异型(jefferies和lefranc,2009,mabs1(4):1-7)。
待缀合至所述抗体或抗体片段的药物可选自由以下组成的组：蒽环类药物、喜树碱、微管蛋白抑制剂、美登木素生物碱(maytansinoid)、刺孢霉素、奥瑞斯他汀、氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、紫杉烷、cox-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、抗代谢物、烷基化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mtor抑制剂、热休克蛋白(hsp90)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、hdac抑制剂、促凋亡剂，只要所述药物具有纳摩尔范围的细胞毒性。
有用的具体药物可选自由以下组成的组：5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普利啶、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类药物、阿西替尼、avl-101、avl-291、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓虫素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、cox-2抑制剂、伊立替康(cpt-11)、sn-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝(dinaciclib)、多西他赛、更生霉素、柔红霉素、dm1、dm3、dm4、阿霉素、2-吡咯啉子基阿霉素(2-pdox)、2-pdox的前药形式(pro-2-pdox)、氰基-吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、内皮抑素、表柔比星葡糖苷酸、埃罗替尼、雌莫司汀、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、依托泊苷(vp16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、依西美坦、芬戈莫德、氟尿苷(fudr)、3’,5’-o-二油酰基-fudr(fudr-do)、氟达拉滨、氟他胺、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、吉尼替彼、gdc-0834、gs-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、伊德利塞、异环磷酰胺、伊马替尼、拉帕替尼、来那度胺、亚叶酸、lfm-a13、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、单甲基奥瑞斯他汀f(mmaf)、单甲基奥瑞斯他汀d(mmad)、单甲基奥瑞斯他汀e(mmae)、诺维本、来那替尼、尼洛替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、pci-32765、喷司他丁、psi-341、雷洛昔芬、司莫司汀、sn-38、索拉非尼、链脲霉素、su11248、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替哌、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春碱、长春新碱、长春花生物碱以及zd1839。优选地，所述药物是sn-38。
在优选的实施方案中，所述治疗剂是abcg2抑制剂，如烟曲酶毒素(fumitremorgin)c、kol43、gf120918、yho-13351、姜黄素、cid44640177、cid1434724、cid46245505、cct129202、青蒿琥酯、st1481、二氢吡啶、富马酸多非喹达(dofequjidarfumarate)、吉非替尼、甲磺酸伊马替尼、拉帕替尼、wk-x-34或yho-13177。
在替代优选的实施方案中，与dna断裂adc(如sn-38抗体缀合物)组合使用的治疗剂是parp抑制剂，如奥拉帕尼、他拉唑帕尼(bmn-673)、鲁卡帕尼、维利帕尼、cep9722、mk4827、bgb-290、abt-888、ag014699、bsi-201、cep-8983或3-氨基苯甲酰胺。
在另一个替代方案中，所述药物可以是酪氨酸激酶抑制剂，如依鲁替尼(pci-32765)、pci-45292、cc-292(avl-292)、ono-4059、gdc-0834、lfm-a13或rn486；或pi3k抑制剂，如伊德利塞、渥曼青霉素、去甲氧基绿胶霉素、哌立福辛、px-866、ipi-145(度维利塞)、bay80-6946、bez235、rp6530、tgr1202、sf1126、ink1117、gdc-0941、bkm120、xl147、xl765、palomid529、gsk1059615、zstk474、pwt33597、ic87114、tg100-115、cal263、pi-103、gne477、cudc-907、aezs-136或ly294002。
或者，药物可以是本领域中已知的微管抑制剂，如长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱)、紫杉烷(例如紫杉醇)、美登木素生物碱(例如美登素)和奥瑞斯他汀。其他已知的微管抑制剂包括秋水仙胺、诺考达唑、埃博霉素、多西他赛、圆皮海绵内酯(discodermolide)、秋水仙碱、康普瑞汀、鬼臼毒素、ci-980、苯基阿夕斯丁、五加前胡素、卡拉新、2-甲氧基雌二醇、e7010、甲氧基苯磺酰胺、长春瑞滨、长春氟宁、长春地辛、尾海兔素、海绵抑制素、根霉素、泰斯多汀、软海绵素、哈米特林(hemiasterlin)、念珠藻素52、mmae以及甲磺酸艾日布林(参见例如，dumontet&jordan,2010,natrevdrugdiscov9:790-803)。
主题adc的优选最佳剂量可包括介于4mg/kg与18mg/kg之间的剂量，优选每周一次、每周两次或每隔一周给与。最佳给药方案可包括以下治疗周期：治疗连续两周、随后停药一周、两周、三周或四周，或交替的治疗周和停药周，或治疗一周、随后停药两周、三周或四周，或治疗三周、随后停药一周、两周、三周或四周，或治疗四周、随后停药一周、两周、三周或四周，或治疗五周、随后停药一周、两周、三周、四周或五周，或每两周一次、每三周一次或每月一次施用。治疗可延长任何数量的周期，优选至少2、至少4、至少6、至少8、至少10、至少12、至少14或至少16个周期。使用的示例性剂量可包括1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、22mg/kg和24mg/kg。优选的剂量是4、6、8、9、10、12、14、16或18mg/kg。更优选的剂量是6-12、6-8、7-8、8-10、10-12或8-12mg/ml。普通技术人员将认识到，在选择adc的最佳剂量时，可考虑多种因素，如年龄、一般健康状况、特定器官功能或重量以及先前疗法对特定器官系统(例如，骨髓)的影响，并且可在治疗过程期间增加或减少施用的剂量和/或频率。可根据需要重复剂量，在少至4至8个剂量后观察到肿瘤缩小的迹象。本文公开的优化的施用剂量和时间表在人受试者中显示出出人意料的优异功效和降低的毒性，这可能是从动物模型研究无法预测的。出人意外地，优异的功效允许治疗先前被发现对一种或多种标准抗癌疗法具有耐药性的肿瘤。更出人意料地，已经发现所述治疗在先前对喜树碱具有耐药性的肿瘤中是有效的，如伊立替康(sn-38的母体化合物)。
所述adc用于治疗癌症，如乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、上皮癌或头颈癌。所述adc可特别用于治疗对一种或多种标准抗癌疗法具有耐药性的癌症，如转移性结肠癌、三阴性乳腺癌、her+、er+、黄体酮+乳腺癌、转移性非小细胞肺癌(nsclc)、转移性胰腺癌、转移性肾细胞癌、转移性胃癌、转移性前列腺癌或转移性小细胞肺癌。
最出人意料地，有效剂量的adc可通过皮下施用来递送，而不会诱导不可接受的局部不良反应。基于先前证明的皮下施用抗体和/或抗体-药物缀合物的困难，可能不能预测此结果(参见例如，leveque等人,2014,anticancerres34:1579-86)。
附图说明
图1.使用hrs7(抗trop-2)、hpam4(抗muc5ac)、hmn-14(抗ceacam5)或非特异性对照ha20(抗cd20)的sn-38缀合物，携带capan1人胰腺癌的无胸腺裸鼠的临床前体内治疗。
图2.与对照相比，使用抗trop2-cl2a-sn-38缀合物，携带bxpc3人胰腺癌的无胸腺裸鼠的临床前体内治疗。
图3a.cl2-sn-38和cl2a-sn-38的结构。
图3b.使用colo205结肠腺癌，连接至cl2对cl2a接头的抗trop-2adc对比ha20adc和盐水对照的比较功效。如箭头所示，每周两次处理动物，持续4周。将colo205小鼠(n＝6)用0.4mg/kgadc处理并且每周两次测量肿瘤。
图3c.使用capan-1胰腺癌，连接至cl2对cl2a接头的抗trop-2adc对比ha20adc和盐水对照的比较功效。如箭头所示，每周两次处理动物，持续4周。将capan-1小鼠(n＝10)用0.2mg/kgadc处理并且每周测量肿瘤。
图4a.hrs7-sn-38adc在若干实体瘤-异种移植物疾病模型中的治疗功效。在携带人非小细胞肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤或鳞状细胞肺肿瘤异种移植物的小鼠中研究hrs7-cl2-sn-38和hrs7-cl2a-sn-38adc处理的功效。所有adc和对照以指定的量施用(表示为每剂量sn-38的量；长箭头＝缀合物注射液，短箭头＝伊立替康注射液)。将携带calu-3肿瘤的小鼠(n＝5–7)每4天注射hrs7-cl2-sn-38，共注射4次(q4dx4)。
图4b.hrs7-sn-38adc在若干实体瘤-异种移植物疾病模型中的治疗功效。在携带人非小细胞肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤或鳞状细胞肺肿瘤异种移植物的小鼠中研究hrs7-cl2-sn-38和hrs7-cl2a-sn-38adc处理的功效。所有adc和对照以指定的量施用(表示为每剂量sn-38的量；长箭头＝缀合物注射液，短箭头＝伊立替康注射液)。将携带colo205肿瘤的小鼠(n＝5)用adc注射8次(q4dx8)或每2天用伊立替康的mtd注射总共5次(q2dx5)。
图4c.hrs7-sn-38adc在若干实体瘤-异种移植物疾病模型中的治疗功效。在携带人非小细胞肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤或鳞状细胞肺肿瘤异种移植物的小鼠中研究hrs7-cl2-sn-38和hrs7-cl2a-sn-38adc处理的功效。所有adc和对照以指定的量施用(表示为每剂量sn-38的量；长箭头＝缀合物注射液，短箭头＝伊立替康注射液)。将capan-1(n＝10)用指示的剂每周两次处理，持续4周。
图4d.hrs7-sn-38adc在若干实体瘤-异种移植物疾病模型中的治疗功效。在携带人非小细胞肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤或鳞状细胞肺肿瘤异种移植物的小鼠中研究hrs7-cl2-sn-38和hrs7-cl2a-sn-38adc处理的功效。所有adc和对照以指定的量施用(表示为每剂量sn-38的量；长箭头＝缀合物注射液，短箭头＝伊立替康注射液)。将携带bxpc-3肿瘤的小鼠(n＝10)用指示的剂每周两次处理，持续4周。
图4e.hrs7-sn-38adc在若干实体瘤-异种移植物疾病模型中的治疗功效。在携带人非小细胞肺肿瘤、结肠直肠肿瘤、胰腺肿瘤或鳞状细胞肺肿瘤异种移植物的小鼠中研究hrs7-cl2-sn-38和hrs7-cl2a-sn-38adc处理的功效。所有adc和对照以指定的量施用(表示为每剂量sn-38的量；长箭头＝缀合物注射液，短箭头＝伊立替康注射液)。除了每周给予两次adc持续4周外，携带sk-mes-1肿瘤(n＝8)的小鼠接受cpt-11的mtd(q2dx5)。
图5a.hrs7-cl2a-sn-38在swiss-webster小鼠中的耐受性。向五十六只swiss-webster小鼠相隔3天给予缓冲液或hrs7-cl2a-sn-38的2个腹膜内剂量(每个剂量4、8或12mg/kg的sn-38；每个剂量250、500或750mg缀合蛋白/kg)。在最后一次注射后7天和15天，将来自每组的7只小鼠实施安乐死，进行血细胞计数和血清化学分析。图表示出每组中具有升高的ast水平的动物的百分比。
图5b.hrs7-cl2a-sn-38在swiss-webster小鼠中的耐受性。向五十六只swiss-webster小鼠相隔3天给予缓冲液或hrs7-cl2a-sn-38的2个腹膜内剂量(每个剂量4、8或12mg/kg的sn-38；每个剂量250、500或750mg缀合蛋白/kg)。在最后一次注射后7天和15天，将来自每组的7只小鼠实施安乐死，进行血细胞计数和血清化学分析。图表显示每组中具有升高的alt水平的动物的百分比。
图5c.hrs7-cl2a-sn-38在食蟹猴中的耐受性。将每组6只猴用缓冲液(对照)或0.96mg/kg的hrs7-cl2a-sn-38或1.92mg/kg的sn-38当量/剂量(60和120mg/kg缀合物蛋白)间隔3天注射两次。所有动物在第-1天、第3天和第6天取血。在第11天在0.96mg/kg组中和在第3天在1.92mg/kg组中将4只猴子放血。食蟹猴中的嗜中性粒细胞计数的变化。
图5d.hrs7-cl2a-sn-38在食蟹猴中的耐受性。将每组6只猴用缓冲液(对照)或0.96mg/kg的hrs7-cl2a-sn-38或1.92mg/kg的sn-38当量/剂量(60和120mg/kg缀合物蛋白)间隔3天注射两次。所有动物在第-1天、第3天和第6天取血。在第11天在0.96mg/kg组中和在第3天在1.92mg/kg组中将4只猴子放血。食蟹猴中血小板计数的变化。
图6.抗trop-2-紫杉醇adc针对mda-mb-468人乳腺癌的体外功效。
图7.抗trop-2-紫杉醇adc针对bxpc-3人胰腺癌的体外功效。
图8a.抗trop-2adc(hrs7-sn-38对mab650-sn-38)在capan-1人胰腺癌中的体外功效的比较。
图8b.抗trop-2adc(hrs7-sn-38对mab650-sn-38)在bxpc-3人胰腺癌中的体外功效的比较。
图8c.抗trop-2adc(hrs7-sn-38对mab650-sn-38)在nci-n87人胃腺癌中的体外功效的比较。
图9a.裸或sn-38缀合的hrs7对162-46.2抗体在bxpc-3人胰腺癌中的细胞毒性的比较。
图9b.裸或sn-38缀合的hrs7对162-46.2抗体在mda-mb-468人乳腺癌中的细胞毒性的比较。
图10.根据recist标准最佳应答的immu-132i/ii期数据。
图11.用于进展时间和最佳应答(recist)的immu-132i/ii期数据。
图12.将雌性ncr无胸腺nu/nu小鼠以指示剂量的immu-132每周两次皮下注射，持续四周。圆圈指示注射部位。在向小鼠施用最终注射后24小时拍摄照片。
图13.将雌性ncr无胸腺nu/nu小鼠以指示剂量的immu-132每周两次皮下注射，持续四周。圆圈指示注射部位。在向小鼠施用最终注射后7天拍摄照片。
图14.用immu-132的静脉内注射液处理的小鼠在第82天的平均肿瘤体积为0.066±0.076cm3，其显著小于在第15天开始实验时(0.263±0.058cm3；p＝0.0017，双尾t-检验)。同样，immu-132的皮下施用导致肿瘤显著小于实验开始时(0.111±0.057cm3对比0.247±0.055cm3；p＝0.0179，双尾t-检验)。当将静脉内施用与皮下比较时，最终肿瘤体积没有显著差异，因为两者都产生等效抗肿瘤作用。
具体实施方式
定义
除非另外指明，否则一个/种(a/an)意指一个(种)或多个(种)。
如本文所用，“约”意指加或减10％。例如，“约100”将包括介于90与110之间的任何数字。
如本文所描述，抗体是指全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组方法形成的)免疫球蛋白分子(如，igg抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。
抗体片段是抗体的一部分，诸如f(ab’)2、fab’、fab、fv、sfv等等。抗体片段也可包括单结构域抗体和igg4半分子，如下文所讨论。无论结构如何，抗体片段与全长抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”也包括由抗体的可变区组成的分离片段，如由重链和轻链的可变区组成的“fv”片段，以及其中轻链可变区和重链可变区通过肽接头(“scfv蛋白”)连接的重组单链多肽分子。
嵌合抗体是重组蛋白，其含有包括来源于一种物种的抗体、优选啮齿动物抗体的互补决定区(cdr)可变结构域，而抗体分子的恒定结构域来源于人抗体的恒定结构域。对于兽医学应用，嵌合抗体的恒定结构域可来源于其他物种，如猫或狗的恒定结构域。
人源化抗体是重组蛋白，其中将来自一种物种的抗体(例如啮齿动物抗体)的cdr从啮齿动物抗体的可变重链和可变轻链转移到人重链和轻链可变结构域(例如，框架区序列)中。抗体分子的恒定区来源于人抗体的那些恒定区。在某些实施方案中，可将来自亲本(啮齿动物)抗体的有限数量的框架区氨基酸残基取代到人抗体框架区序列中。
人抗体是例如从转基因小鼠获得的抗体，所述转基因小鼠已被“工程化”以响应于抗原激发产生特异性人抗体。在这种技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入到来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系含有内源性鼠类重链和轻链基因座的靶向破坏。转基因小鼠可合成对特定抗原具有特异性的人抗体，并且小鼠可用于产生分泌人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由green等人,naturegenet.7:13(1994)；lonberg等人,nature368:856(1994)和taylor等人,int.immun.6:579(1994)描述。完全人抗体也可通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建，所有技术都是本领域已知的。参见例如mccafferty等人,nature348:552-553(1990)从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变结构域基因组库(repertoire)体外产生人抗体及其片段)。在这种技术中，将抗体可变结构域基因同框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒的表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链dna拷贝，所以基于抗体的功能性质的选择也导致选择编码表现出这些性质的抗体的基因。以此方式，噬菌体模拟b细胞的一些性质。噬菌体展示可以多种形式进行，关于综述，参见例如johnson和chiswell,currentopinioninstructuralbiology3:5564-571(1993)。人抗体也可通过体外活化的b细胞来生成。参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其实施例部分以引用的方式并入本文。
治疗剂是与抗体部分分开、同时或依序施用或者与抗体部分(即，抗体或抗体片段或子片段)缀合并且适用于治疗疾病的化合物、分子或原子。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促凋亡剂、抗血管生成剂、硼化合物、光敏剂或染料以及放射性同位素。所使用的治疗剂在下文更详细地描述。
免疫缀合物是与至少一种治疗剂和/或诊断剂缀合的抗体、抗体片段或融合蛋白。
多特异性抗体是可同时结合至至少两个具有不同结构的靶标(例如，两种不同的抗原、在同一抗原上的两个不同表位或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。多特异性、多价抗体是具有多于一个结合位点的构建体，并且所述结合位点具有不同的特异性。
双特异性抗体是可同时结合至两个不同靶标的抗体。双特异性抗体(bsab)和双特异性抗体片段(bsfab)可具有至少一个特异性地结合至例如肿瘤相关抗原的臂和至少一个特异性地结合至带有治疗剂或诊断剂的可靶向缀合物的其他臂。许多双特异性融合蛋白可使用分子工程化产生。
抗trop-2抗体
主题adc可包括结合至trop-2的抗体或其片段。在具体的优选实施方案中，抗trop-2抗体可以是人源化rs7抗体(参见例如，美国专利号7,238,785，所述专利以引用的方式整体并入本文)，其包含轻链cdr序列cdr1(kasqdvsiava，seqidno:1)、cdr2(sasyryt，seqidno:2)和cdr3(qqhyitplt，seqidno:3)以及重链cdr序列cdr1(nygmn，seqidno:4)、cdr2(wintytgeptytddfkg，seqidno:5)和cdr3(ggfgssywyfdv，seqidno:6)。
rs7抗体是针对人原发性鳞状细胞肺癌的粗膜制备而产生的鼠igg1。(stein等人,cancerres.50:1330,1990)。rs7抗体识别表征为簇13的46-48kda糖蛋白。(stein等人,int.j.cancersupp.8:98-102,1994)。所述抗原被命名为egp-1(上皮糖蛋白-1)，但也称为trop-2。
trop-2是i型跨膜蛋白，并且已从人(fornaro等人,intjcancer1995；62:610-8)和小鼠细胞(sewedy等人,intjcancer1998；75:324-30)二者克隆。除了作为肿瘤相关钙信号转导蛋白(ripani等人,intjcancer1998；76:671-6)的作用之外，人trop-2的表达还显示出对于肿瘤发生和结肠癌细胞的侵袭性是必要的，这可有效地减少针对trop-2的细胞外结构域的多克隆抗体(wang等人,molcancerther2008；7:280-5)。
trop-2作为实体癌的治疗靶标的日益增长的兴趣(cubas等人,biochimbiophysacta2009；1796:309-14)由另外的报告证明，所述报告记录了过表达的trop-2在乳腺癌(huang等人,clincancerres2005；11:4357-64)、结肠直肠癌(ohmachi等人,clincancerres2006；12:3057-63；fang等人,intjcolorectaldis2009；24:875-84)和口腔鳞状细胞癌(fong等人,modernpathol2008；21:186-91)中的临床意义。表达高水平的trop-2的前列腺基底细胞被富集以获得体外和体内干细胞活性的最新证据尤其值得注意(goldstein等人,procnatlacadsciusa2008；105:20882-7)。
流式细胞术和免疫组织化学染色研究已经显示，rs7mab检测许多肿瘤类型上的抗原，与正常人组织的结合有限(stein等人，1990)。trop-2主要由癌，如肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌和前列腺癌表达。在动物模型中使用放射性标记的鼠rs7mab进行的定位和治疗研究已证明肿瘤靶向和治疗功效(stein等人，1990；stein等人，1991)。
在来自肺、乳腺、膀胱、卵巢、子宫、胃和前列腺的肿瘤中显示出强rs7染色。(stein等人,int.j.cancer55:938,1993)肺癌病例包括鳞状细胞癌和腺癌二者。(stein等人,int.j.cancer55:938,1993)两种细胞类型均被强染色，从而表明rs7抗体不能鉴别非小细胞肺癌的组织学分类。
rs7mab快速内化到靶细胞中(stein等人，1993)。rs7mab的内化速率常数介于两种其他快速内化mab的内化速率常数之间，其已被证明可用于免疫毒素产生。(同上)已充分证明免疫毒素缀合物的内化是抗肿瘤活性的要求。(pastan等人,cell47:641,1986)药物adc的内化已被描述为抗肿瘤功效的主要因素。(yang等人,proc.nat'lacad.sci.usa85:1189,1988)因此，rs7抗体表现出治疗应用的若干重要性质。
虽然hrs7抗体是优选的，但其他抗trop-2抗体是已知的和/或可公开获得的，并且在替代实施方案中可用于主题adc中。虽然人源化或人抗体对于降低的免疫原性是优选的，但在替代实施方案中可使用嵌合抗体。如下文所讨论，抗体人源化的方法是本领域熟知的，并且可用于将可用的鼠或嵌合抗体转化为人源化形式。
抗trop-2抗体可从许多来源商购获得，并且包括ls-c126418、ls-c178765、ls-c126416、ls-c126417(lifespanbiosciences,inc.,seattle,wa)；10428-mm01、10428-mm02、10428-r001、10428-r030(sinobiologicalinc.,beijing,china)；mr54(ebioscience,sandiego,ca)；sc-376181、sc-376746，santacruzbiotechnology(santacruz,ca)；mm0588-49d6(novusbiologicals,littleton,co)；ab79976和ab89928(
其他抗trop-2抗体已经公开于专利文献中。例如，美国公开号2013/0089872公开了保藏在日本筑波的国际专利生物保藏中心(internationalpatentorganismdepositary,tsukuba,japan)的抗trop-2抗体k5-70(登录号fermbp-11251)、k5-107(登录号fermbp-11252)、k5-116-2-1(登录号fermbp-11253)、t6-16(登录号fermbp-11346)和t5-86(登录号fermbp-11254)。美国专利号5,840,854公开了抗trop-2单克隆抗体br110(atcc号hb11698)。美国专利号7,420,040公开了以登录号141205-05保藏在idac(加拿大国际保藏机构，温尼伯，加拿大)的杂交瘤细胞系ar47a6.4.2产生的抗trop-2抗体。美国专利号7,420,041公开了以登录号141205-03保藏在idac的杂交瘤细胞系ar52a301.5产生的抗trop-2抗体。美国公布号2013/0122020公开了抗trop-2抗体3e9、6g11、7e6、15e2、18b1。编码代表性抗体的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc)，登录号pta-12871和pta-12872。美国专利号8,715,662公开了以保藏号pd08019、pd08020和pd08021保藏在aid-iclc(genoa,italy)的杂交瘤产生的抗trop-2抗体。美国专利申请公布号20120237518公开了抗trop-2抗体77220、km4097和km4590。美国专利号8,309,094(wyeth)公开了通过序列表鉴定的抗体a1和a3。本段落上述引用的每个专利或专利申请的实施例部分以引用的方式并入本文。非专利公布lipinski等人(1981,procnatl.acadsciusa,78:5147-50)公开了抗trop-2抗体162-25.3和162-46.2。king等人的出版物(investnewdrugs,2018年1月15日付印前的电子版)公开了pf-06664178抗trop-2抗体-药物缀合物。strop等人的出版物(2016,molcancerther15:2698-708)公开了rn927c抗trop-2adc。
许多抗trop-2抗体是本领域已知的和/或可公开获得的。如下文所论述，用于制备针对已知抗原的抗体的方法是本领域常规的。人trop-2蛋白的序列也是本领域已知的(参见例如，genbank登录号caa54801.1)。用于产生人源化、人或嵌合抗体的方法也是已知的。普通技术人员在根据本领域的一般知识阅读本公开时将能够将能够在主题adc中制造和使用抗trop-2抗体的种属。
已经公开了除adc以外的免疫治疗剂的抗trop-2抗体的用途。鼠igg2a抗体依决洛单抗
抗cea抗体
某些实施方案可涉及使用针对ceacam5或ceacam6的缀合的抗体。cea(ceacam5)是一种通常在许多上皮癌中表达的癌胚抗原，最通常在结肠中出现的那些，但也在乳腺、肺、胰腺、甲状腺(髓质型)和卵巢中出现(goldenberg等人,j.natl.cancerinst.57:11-22,1976；shively等人,crit.rev.oncol.hematol.2:355-399,1985)。人cea基因家族由属于ceacam亚组的7种已知基因组成。这些亚组成员主要与细胞膜相关，并且在正常组织和癌组织中显示复杂的表达模式。ceacam5基因(也称为cd66e)编码cea蛋白(beauchemin等人,expcellres252:243,1999)。ceacam5在1965年首次描述为胃肠癌胚抗原(gold等人,jexpmed122:467-481,1965)，但现在已知在大多数癌中过表达，包括胃肠道、呼吸系统和泌尿生殖系统以及乳腺癌症的那些(goldenberg等人,jnatlcancerinst.57:11-22,1976；shively和beatty,critrevoncolhematol2:355-99,1985)。
ceacam6(也称为cd66c或nca-90)是非特异性交叉反应糖蛋白抗原，其与ceacam5共有一些但非全部抗原决定簇(kuroki等人,biochembiophysrescomm182:501-06,1992)。ceacam6在来自各种器官的粒细胞和上皮细胞上表达，并且与正常粘膜以及许多人癌症相比，在增生性结肠息肉和腺瘤的增殖细胞中具有更宽的表达区(scholzel等人,amjpathol157:1051-52,2000；kuroki等人,anticancerres19:5599-5606,1999)。在患有肺癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌和肝细胞癌的患者中发现相对高的ceacam6血清水平。ceacam6的量与表达的ceacam5的量不相关(kuroki等人,anticancerres19:5599-5606,1999)。
ceacam6在结肠直肠癌中的表达与细胞分化呈负相关(ilantzis等人,neoplasia4:151-63,2002)，并且是与较高复发风险相关的独立预后因素(jantscheff等人,jclinoncol21:3638-46,2003)。ceacam5和ceacam6两者均在细胞粘附、侵袭和转移中起作用。ceacam5已显示参与同嗜性(cea至cea)和异嗜性(cea与非cea分子的结合)相互作用(bechimol等人,cell57:327-34,1989；oikawa等人,biochembiophysrescomm164:39-45,1989)，从而向一些人表明它是参与癌症侵袭和转移的细胞间粘附分子(thomas等人,cancerlett92:59-66,1995)。这些反应通过抗ceacam5抗体的fab'片段完全抑制(oikawa等人,biochembiophysrescomm164:39-45,1989)。ceacam6还表现出与cea家族的其他成员的同型结合以及与整联蛋白受体的异型相互作用(stanners和fuks,于：celladhesionandcommunicationbytheceafamily,(stanners编辑)第5卷,第57-72页,harwoodacademicpubl.,amsterdam,1998)。靶向ceacam6的n-结构域的抗体干扰细胞-细胞相互作用(yamanka等人biochembiophysrescomm219:842-47,1996)。许多乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和非小细胞肺癌(nsclc)细胞系表达ceacam6，并且抗ceacam6抗体抑制抗原阳性细胞的体外迁移、侵袭和粘附(blumenthal等人,cancerres65:8809-17,2005)。
抗cea抗体取决于它们与除cea以外的抗原的交叉反应性分为不同类别。抗cea抗体分类由primus和goldenberg，美国专利号4,818,709描述(所述专利以引用的方式从第3栏、第5行至第26栏、第49行并入本文)。抗cea抗体的分类通过它们与cea、胎粪抗原(ma)和非特异性交叉反应抗原(nca)的结合来确定。i类抗cea抗体结合至所有三种抗原。ii类抗体结合至ma和cea，但不结合至nca。iii类抗体仅结合至cea(u.s.4,818,709)。已知各类抗cea抗体的实例，如mn-3、mn-15和np-1(i类)；mn-2、np-2和np-3(ii类)；以及mn-14和np-4(iii类)(u.s.4,818,709；blumenthal等人bmccancer7:2(2007))。
还鉴定了各种抗cea抗体的表位结合位点。mn-15抗体结合至cea的a1b1结构域，mn-3抗体结合至cea的n-末端结构域，并且mn-14抗体结合至cea的a3b3(cd66e)结构域(blumenthal等人bmccancer7:2(2007))。表位结合位点与抗cea抗体的类别之间没有直接相关性。例如，mn-3和mn-15都是i类抗cea抗体，与nca、ma和cea反应，但分别结合至cea的n-末端和a1b1结构域。primus和goldenberg(us4,818,709)报告了不同抗cea抗体之间的交叉阻断活性的复杂模式，其中np-1(i类)和np-2(ii类)交叉阻断与彼此的cea的结合，但不阻断np-3(ii类)的结合。然而，根据定义，i类抗cea抗体结合至ceacam5和ceacam6两者，而iii类抗cea抗体仅结合至ceacam5。
已经提出抗cea抗体用于治疗性治疗多种癌症。例如，局限于甲状腺的甲状腺髓样癌(mtc)通常通过全甲状腺切除术和中央淋巴结清扫术治疗。然而，疾病在大约50％的这些患者中复发。此外，患有不可切除的疾病或远处转移的患者的预后较差，少于30％存活10年(rossi等人,amer.j.surgery,139:554(1980)；samaan等人,j.clin.endocrinol.metab.,67:801(1988)；schroder等人,cancer,61:806(1988))。这些患者几乎没有治疗选择(principlesandpracticeofoncology,devita,hellman和rosenberg(编辑),newyork:jblippincottco.,第1333-1435页(1989)；cancer等人,currentproblemssurgery,22:1(1985))。iii类抗cea抗体mn-14据报告当与促凋亡剂如dtic、cpt-11和5-氟尿嘧啶结合使用时，在动物异种移植物模型系统中对人甲状腺髓样癌的治疗有效(美国专利申请序列号10/680,734，其实施例部分以引用的方式并入本文)。iii类抗cea抗体据报告使癌细胞对使用化学治疗剂的治疗敏感，并且据报告与单独抗体或化学治疗剂相比，抗体与化学治疗剂的组合对肿瘤具有协同作用(ussn10/680,734)。已经提出不同类别的抗cea抗体(如mn-3、mn-14和mn-15)用于治疗多种肿瘤。
在一个优选的实施方案中，包含抗ceacam5抗体(例如，hmn-14、拉贝珠单抗)和/或抗ceacam6抗体(例如，hmn-3或hmn-15)的治疗性缀合物可用于治疗表达ceacam5和/或ceacam6的各种癌症中的任一种，如美国专利号7,541,440；7,951,369；5,874,540；6,676,924和8,267,865中所公开；所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。可使用抗ceacam5、抗ceacam6或两者的组合治疗的实体瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、口腔癌和胃癌。大多数癌，包括胃肠癌、呼吸道癌、泌尿生殖系统癌和乳腺癌表达ceacam5并且可用主题adc治疗。hmn-14抗体是包含轻链可变区cdr序列cdr1(kasqdvgtsva；seqidno:9)、cdr2(wtstrht；seqidno:10)和cdr3(qqyslyrs；seqidno:11)以及重链可变区cdr序列cdr1(tywms；seqidno:12)、cdr2(eihpdsstinyapslkd；seqidno:13)和cdr3(lyfgfpwfay；seqidno:14)的人源化抗体。hmn-3抗体是包含轻链可变区cdr序列cdr1(rssqsivhsngntyle，seqidno:15)、cdr2(kvsnrfs，seqidno:16)和cdr3(fqgshvppt，seqidno:17)以及重链cdr序列cdr1(nygmn，seqidno:18)、cdr2(wintytgeptyaddfkg，seqidno:19)和cdr3(kgwmdfnssldy，seqidno:20)的人源化抗体。hmn-15抗体是包含轻链可变区cdr序列sassrvsyih(seqidno:21)、gtstlas(seqidno:22)和qqwsynppt(seqidno:23)以及重链可变区cdr序列dyyms(seqidno:24)、fiankanghttdyspsvkg(seqidno:25)和dmgirwnfdv(seqidno:26)的人源化抗体。
尽管优选使用mn-14、mn-15或mn-3，但是针对ceacam5或ceacam6的其他抗体是本领域已知的，并且可用作adc，如sn-38缀合物。针对ceacam5的另一种示例性抗体是抗ceacam5cc4抗体(例如，zheng等人,2011,plosone6:e21146)。针对ceacam5或ceacam6的抗体可从许多商业来源获得，包括ls-c6031、ls-b7292、ls-c338757(lsbio,seattle,wa)；sab1307198、gw22478、hpa019758(sigma-aldrich,st.louis,mo)；sc-23928、sc-59872、sc-52390(santacruzbiotechnology,santacruz,ca)；以及ab78029(
抗hla-dr抗体
人白细胞抗原-dr(hla-dr)是主要组织相容性复合物(mhc)ii类抗原的三种同种型之一。hla-dr在多种血液恶性肿瘤中高度表达，并且已经积极地用于基于抗体的淋巴瘤治疗(brown等人,2001,clinlymphoma2:188-90；denardo等人,2005,clincancerres11:7075s-9s；stein等人,2006,bloood108:2736-44)。人hla-dr抗原以比典型b细胞标志物(包括cd20)显著更高的水平在非霍奇金淋巴瘤(nhl)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)和其他b细胞恶性肿瘤中表达。初步研究表明，抗hla-drmab在淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤的体外和体内实验中明显比目前临床上感兴趣的其他裸mab更有效(stein等人，未发表的结果)。
hla-dr也在正常免疫细胞的亚群上表达，所述免疫细胞包括b细胞、单核细胞/巨噬细胞、朗格汉斯细胞、树突细胞和活化的t细胞(dechant等人,2003,seminoncol30:465-75)。因此，也许并不出人意料，开发抗hla-dr抗体的先前尝试一直受到毒性的阻碍，特别是可能与补体活化有关的输注相关的毒性(lin等人,2009,leuklymphoma50:1958-63；shi等人,2002,leuklymphoma43:1303-12)。
在优选的实施方案中，主题抗hla-dr抗体可以是人源化l243抗体。此类抗体与亲本鼠l243抗体结合至hla-dr上的相同表位，但具有降低的免疫原性。ml243已经保藏在美国典型培养物保藏中心，rockville,md，登录号为atcchb55。
人源化l243抗体可包含附接至人抗体fr和恒定区序列的重链cdr序列cdr1(nygmn，seqidno:27)、cdr2(wintytreptyaddfkg，seqidno:28)和cdr3(ditavvptgfdy，seqidno:29)以及轻链cdr序列cdr1(raseniysnla，seqidno:30)、cdr2(aasnlad，seqidno:31)和cdr3(qhfwttpwa，seqidno:32)。在更优选的实施方案中，一个或多个鼠fr氨基酸残基被相应的人fr残基取代，特别是在邻近cdr残基或cdr残基附近的位置。可在人源化设计中被取代的示例性鼠vh残基是在位置：f27、k38、k46、a68和f91。可在人源化设计中被取代的示例性鼠vl残基是在位置r37、k39、v48、f49和g1。
人源化抗体分子的轻链和重链可变结构域可与人轻链或重链恒定结构域融合。可关于所提出的抗体功能选择人恒定结构域。在一个实施方案中，可基于缺乏效应子功能来选择人恒定结构域。与重链可变区融合的重链恒定结构域可以是人iga(αl或α2链)、igg(γ1、γ2、γ3或γ4链)或igm(μ链)的那些。可与轻链可变区融合的轻链恒定结构域包括人λ和κ链。
在本发明的一个特定实施方案中，使用γ1链。在又一个特定实施方案中，使用γ4链。使用γ4链可在一些情况下增加受试者对hl243的耐受性(减少的副作用和输注反应等)。
各种实施方案可涉及主题抗hla-dr抗体或其片段用于治疗或诊断疾病的用途，所述疾病包括但不限于：b细胞非霍奇金淋巴瘤、b细胞急性和慢性淋巴性白血病、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、急性和慢性骨髓性白血病、t细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、癌、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤以及皮肤癌。癌可选自由以下组成的组：口腔癌、胃肠道癌、肺道癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、皮肤癌和睾丸癌。
喜树碱缀合物
用于制备包含附接至抗体或抗原结合抗体片段的喜树碱治疗剂的免疫缀合物的非限制性方法和组合物在下文进行了描述。在优选的实施方案中，通过在药物与抗体之间放置限定的聚乙二醇(peg)部分(即，含有限定数量的单体单元的peg)来增强药物的溶解度，其中限定的peg是优选含有1-30个单体单元、更优选含有1-12个单体单元、最优选含有6-8个单体单元的低分子量peg。
优选地，第一接头在一端连接药物，并且可在另一端用乙炔或叠氮化物基团终止。这种第一接头可包含在一端具有叠氮化物或乙炔基团并且在另一端具有不同的反应性基团(如羧酸或羟基)的限定的peg部分。所述双官能限定的peg可附接至氨基醇的胺基团上，并且后者的羟基可附接至呈碳酸酯形式的药物上的羟基。或者，所述限定的双官能peg的非叠氮化物(或乙炔)部分任选地附接至l-氨基酸或多肽的n-末端，其c-末端附接至氨基醇的氨基，并且后者的羟基附接至分别呈碳酸酯或氨基甲酸酯形式的药物的羟基。
包含抗体偶联基团和与第一接头的叠氮化物(或乙炔)基团互补的反应性基团(即乙炔(或叠氮化物))的第二接头可经由乙炔-叠氮化物环加成反应与药物-(第一接头)缀合物反应以提供最终的双官能药物产品，其可用于缀合至靶向疾病的抗体。抗体偶联基团优选地是硫醇或硫醇反应性基团。
下文提供了在涉及cpt类似物如sn-38的药物-接头前体制剂中在c-20碳酸酯存在下选择性再生10-羟基的方法。也可使用药物中的反应性羟基的其他保护基团，如sn-38中的酚羟基，例如叔丁基二甲基甲硅烷基或叔丁基二苯基甲硅烷基，并且在将衍生化的药物连接至抗体偶联部分之前通过四丁基氟化铵对这些进行脱保护。除了‘boc’之外，cpt类似物的10-羟基可替代地被保护为酯或碳酸酯，以使得双官能cpt与抗体缀合而没有这种保护基团的先前脱保护。在施用生物缀合物后，保护基团在生理ph条件下容易地脱保护。
在称为‘点击化学’的乙炔-叠氮化物偶联中，叠氮化物部分可在l2上，乙炔部分在l3上。或者，l2可含有乙炔，l3含有叠氮化物。‘点击化学’是指乙炔部分与叠氮化物部分之间的铜(+1)催化的环加成反应(kolbhc和sharplesskb,drugdiscovtoday2003；8:1128-37)，尽管已知并且可使用替代形式的点击化学。点击化学在近中性ph条件下在水溶液中发生，并且因此适合于药物缀合。点击化学的优点在于它是化学选择性的，并且补充其他众所周知的缀合化学如硫醇-马来酰亚胺反应。
示例性的优选实施方案涉及药物衍生物和抗体的具有以下所示的通式(1)的缀合物。
mab-[l2]-[l1]-[aa]m-[a’]-药物(1)
其中mab是靶向疾病的抗体；l2是包含抗体偶联部分和一个或多个乙炔(或叠氮化物)基团的交联剂的组分；l1包含在一端具有与l2中的乙炔(或叠氮化物)部分互补的叠氮化物(或乙炔)的限定的peg以及在另一端的反应性基团如羧酸或羟基；aa是l-氨基酸；m是值为0、1、2、3或4的整数；并且a'是选自乙醇胺、4-羟基苄醇、4-氨基苄醇或取代的或未取代的乙二胺的组的另外的间隔基。‘aa’的l氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸。如果a'基团含有羟基，则它连接至分别呈碳酸酯或氨基甲酸酯形式的药物的羟基或氨基。
在式1的优选实施方案中，a'是衍生自l-氨基酸的取代的乙醇胺，其中所述氨基酸的羧酸基团被羟甲基部分置换。a'可衍生自以下l-氨基酸中的任一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸。
在式1的优选实施方案的缀合物的实例中，m是0，a'是l-缬氨醇，并且药物由sn-38例示。在式1的另一个实例中，m是1并且由衍生化的l-赖氨酸代表，a'是l-缬氨醇，并且药物由sn-38例示。在此实施方案中，使用赖氨酸氨基的正交保护基团首先在氨基酸如赖氨酸的羧酸与缬氨醇的氨基之间形成酰胺键。除去赖氨酸的n-末端上的保护基团，从而保持赖氨酸的侧链上的保护基团完整，并且n-末端与在另一端具有叠氮化物(或乙炔)的限定的peg上的羧基偶联。缬氨醇的羟基然后附接至10-羟基保护的sn-38的20-氯甲酸酯衍生物，并且此中间体与携带抗体结合部分的l2组分以及参与点击环加成化学的互补的乙炔(或叠氮化物)基团偶联。最后，除去赖氨酸侧链和sn-38两者处的保护基团得到此实施例的产物。
虽然不希望受理论束缚，但在细胞内蛋白水解后产生的小mwsn-38产物(即缬氨醇-sn-38碳酸酯)具有通过涉及缬氨醇的氨基和碳酸酯的羰基的分子内环化释放完整sn-38的额外途径。
在另一个优选的实施方案中，具有通式1的a'是a-oh，其中a-oh是可塌缩的部分，如4-氨基苄醇或在苄基位置被c1-c10烷基取代的取代的4-氨基苄醇，并且后者经由其氨基附接至l-氨基酸或包含至多4个l-氨基酸部分的多肽；其中n-末端附接至终止于抗体结合基团中的交联剂。
在优选实施方案的另一个实例中，具有通式1的a'的a-oh衍生自取代的4-氨基苄醇，并且‘aa’由通式1中m＝1情况下的单个l-氨基酸组成，并且药物以sn-38例示。aa的单个氨基酸可选自以下l-氨基酸中的任一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸以及缬氨酸。4-氨基苄醇部分上的取代基r(a'的a-oh实施方案)是氢或选自c1-c10烷基的烷基。此式的实例(其中单个氨基酸aa是l-赖氨酸并且r＝h，并且药物由sn-38例示)被称为mab-cl2a-sn-38(下文所示)。所述结构与接头mab-cl2-sn-38的区别在于单个赖氨酸残基取代cl2接头中发现的phe-lys二肽。将phe-lys二肽设计为溶酶体酶的组织蛋白酶b裂解位点，其被认为对于结合的药物的细胞内释放是重要的。出人意料地，尽管消除组织蛋白酶裂解位点，但包含cl2a接头的免疫缀合物在体内显然比包含cl2接头的那些更有效。
在另一个优选的实施方案中，缀合物的l1组分含有具有1-30个重复单体单元的限定的聚乙二醇(peg)间隔基。在进一步优选的实施方案中，peg是具有1-12个重复单体单元的限定的peg。peg的引入可涉及使用可商购的异双官能化peg衍生物。异双官能peg可含有叠氮化物或乙炔基团。
在优选的实施方案中，l2具有在2-40个、但优选2-20个、并且更优选2-5个范围内的多个乙炔(或叠氮化物)基团和单个抗体结合部分。在代表性实例中，‘l2’组分附加至2个炔属基团，从而导致附接附加两个叠氮化物的sn-38分子。与mab的键合可涉及琥珀酰亚胺。
在优选的实施方案中，当双官能药物含有硫醇反应性部分作为抗体结合基团时，使用硫醇化试剂在抗体的赖氨酸基团上产生抗体上的硫醇。用于通过修饰mab的赖氨酸基团将硫醇基团引入到抗体上的方法是本领域熟知的(wong于chemistryofproteinconjugationandcross-linking,crcpress,inc.,bocaraton,fl(1991),第20-22页中)。或者，使用还原剂如二硫苏糖醇(dtt)轻微还原抗体上的链间二硫键(willner等人,bioconjugatechem.4:521-527(1993))可在抗体上产生7至10个硫醇；其具有在mab的远离抗原结合区的链间区域中并入多个药物部分的优点。在更优选的实施方案中，sn-38附接至还原的二硫化物巯基导致形成抗体-sn-38免疫缀合物，其中每个抗体分子共价附接有6至8个sn-38部分。提供用于附接药物或其他治疗剂的半胱氨酸残基的其他方法是已知的，如使用半胱氨酸工程化的抗体(参见美国专利号7,521,541，其实施例部分以引用的方式并入本文)。
在替代优选的实施方案中，化学治疗部分是选自由以下组成的组：阿霉素(dox)、表柔比星、吗啉代阿霉素(吗啉代-dox)、氰基吗啉代-阿霉素(氰基吗啉代-dox)、cpt、10-羟基喜树碱、sn-38、托泊替康、勒托替康(lurtotecan)、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、紫杉烷、格尔德霉素、安莎霉素和埃博霉素。在更优选的实施方案中，化学治疗部分是sn-38。优选地，在优选实施方案的缀合物中，抗体连接至至少一个化学治疗部分；优选1至约12个化学治疗部分；最优选约6至约8个化学治疗部分。
此外，在优选的实施方案中，接头组分‘l2’包含硫醇基团，所述硫醇基团与在所述抗体的一个或多个赖氨酸侧链氨基处引入的硫醇反应性残基反应。在此类情况下，通过本领域充分描述的程序，将抗体用硫醇反应性基团如马来酰亚胺、乙烯基砜、溴乙酰胺或碘乙酰胺预衍生化。
在这种工作的背景下，出人意料地发现了一种方法，通过所述方法可制备cpt药物-接头，其中cpt另外具有10-羟基。这种方法包括但不限于保护10-羟基作为叔丁氧基羰基(boc)衍生物，随后制备药物-接头缀合物的倒数第二个中间体。通常，除去boc基团需要用强酸如三氟乙酸(tfa)处理。在这些条件下，含有待除去的保护基团的cpt20-o-接头碳酸酯也易于裂解，从而产生未修饰的cpt。事实上，如本领域所阐述的，使用可温和除去的甲氧基三苯甲基(mmt)保护基团用于接头分子的赖氨酸侧链的原理正是为了避免这种可能性(walker等人，2002)。发现通过进行短持续时间的反应，最佳3至5分钟，可能选择性除去酚boc保护基团。在这些条件下，主要产物是去除10-羟基位置的‘boc’、而‘20’位置的碳酸酯为完整的产物。
替代方法涉及用除‘boc’以外的基团保护cpt类似物的10-羟基位置，以使得最终产物准备好与抗体缀合而不需要使10-oh保护基团脱保护。将10-oh转化为酚碳酸酯或酚酯的10-羟基保护基团易容易地在体内施用缀合物后通过生理ph条件或通过酯酶脱保护。he等人已经描述了在生理条件下在10位置处的酚碳酸酯对比10-羟基喜树碱的20位置处的叔碳酸酯的更快除去(he等人,bioorganic&medicinalchemistry12:4003-4008(2004))。sn-38上的10-羟基保护基团可以是‘cor’，其中r可以是取代的烷基如“n(ch3)2-(ch2)n”，其中n是1-10并且其中末端氨基任选地呈季盐形式以增强水溶性；或简单的烷基残基如“ch3-(ch2)n”，其中n是0-10；或者它可以是烷氧基部分，如“ch3-(ch2)n-o-”，其中n是0-10，或“n(ch3)2-(ch2)n-o-”，其中n是2-10，或“r1o-(ch2-ch2-o)n-ch2-ch2-o-”，其中r1是乙基或甲基，并且n是具有0-10的值的整数。如果最终衍生物将是碳酸酯，则通过用所选试剂的氯甲酸酯处理容易地制备这些10-羟基衍生物。通常，使用三乙胺作为碱，用摩尔当量的二甲基甲酰胺中的氯甲酸酯处理含有10-羟基的喜树碱如sn-38。在这些条件下，20-oh位置不受影响。为了形成10-o-酯，使用所选试剂的酰基氯。
在制备药物衍生物和抗体的具有通式1的缀合物的优选方法中，其中描述符l2、l1、aa和ax如前面部分中所描述，首先制备双官能药物部分[l2]-[l1]-[aa]m-[a-x]-药物，随后将双官能药物部分缀合至抗体(在本文中表示为“mab”)。
在制备药物衍生物和抗体的具有通式1的缀合物的优选方法中，其中描述符l2、l1、aa和a-oh如前面部分中所描述，通过首先经由酰胺键将a-oh连接至aa的c-末端、随后将aa的胺末端偶联至l1的羧酸基团来制备双官能药物部分。如果aa不存在(即m＝0)，则a-oh经由酰胺键直接附接至l1。交联剂[l1]-[aa]m-[a-oh]附接至药物的羟基或氨基，并且其随后经由点击化学通过借助于l1和l2中叠氮化物(或乙炔)与乙炔(或叠氮化物)基团之间的反应而附接至l1部分。
在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体(mab)。在其他实施方案中，所述抗体可以是多价和/或多特异性mab。抗体可以是鼠、嵌合、人源化或人单克隆抗体，并且所述抗体可以是完整、片段(fab、fab’、f(ab)2、f(ab’)2)或亚片段(单链构建体)、或具有igg1、igg2a、igg3、igg4、iga同种型或来自其的亚分子。
抗体制备
用于制备实际上抗任何靶抗原如trop-2的单克隆抗体的技术是本领域熟知的。参见例如，
mab可通过许多广泛接受的技术从所述杂交瘤培养物分离和纯化。此类分离技术包括使用蛋白-a或蛋白-gsepharose的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法。参见例如，coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。此外，参见baines等人,“purificationofimmunoglobuling(igg),”于methodsinmolecularbiology，第10卷，第79-104页(thehumanapress,inc.1992)。
在针对免疫原的抗体的初始产生之后，可对抗体进行测序，并且随后通过重组技术制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域的技术人员已知的，如下文所讨论。
各种技术，诸如制备嵌合或人源化抗体，可涉及抗体克隆和构建的工序。目标抗体的抗原结合vκ(可变轻链)和vh(可变重链)序列可通过各种分子克隆工序，如rt-pcr、5’-race和cdna文库筛选获得。可通过pcr扩增克隆表达鼠mab的细胞的mab的v基因并测序。为确认其保真性，可在细胞培养中以嵌合ab表达克隆的vl和vh基因，如orlandi等人所述(proc.natl.acad.sci.,usa,86:3833(1989))。然后可根据v基因序列设计和构建人源化mab，如leung等人所述(mol.immunol.,32:1413(1995))。
cdna可从任何已知的杂交瘤系或产生鼠mab的转染细胞系通过一般分子克隆技术制备(sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual,第2版(1989))。mab的vκ序列可使用引物vk1back和vk1for(orlandi等人，1989)或由leung等人(biotechniques,15:286(1993))描述的延伸引物组扩增。vh序列可使用引物对vh1back/vh1for(orlandi等人,1989)或由leung等人(hybridoma,13:469(1994))描述的与鼠igg的恒定区退火的引物进行扩增。人源化v基因可通过长寡核苷酸模板合成和pcr扩增的组合构建，如leung等人(mol.immunol.,32:1413(1995))所述。
vκ的pcr产物可亚克隆至分期载体，诸如基于pbr327的包含ig启动子、信号肽序列和简便限制性位点的分期载体vkpbr。vh的pcr产物可亚克隆至类似的分期载体，诸如基于pbluescript的vhpbs。可分别从vkpbr和vhpbs切下含有vκ和vh序列以及启动子和信号肽序列的表达盒，并连接至适当的表达载体，诸如pkh和pg1g中(leung等人,hybridoma,13:469(1994))。表达载体可共转染至适当的细胞，并监测上清液流体中嵌合人源化或人mab的生成。或者，可切下vκ和vh表达盒并亚克隆至单个表达载体，如pdhl2中，如gillies等人(j.immunol.methods125:191(1989)并且还在losman等人,cancer,80:2660(1997)中示出)所描述。
在替代实施方案中，表达载体可转染至宿主细胞，所述宿主细胞预先改造为在无血清培养基中进行转染、生长和表达。可使用的示例性细胞系包括sp/eee、sp/esf和sp/esf-x细胞系(参见例如，美国专利号7,531,327；7,537,930和7,608,425，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。这些示例性细胞系基于sp2/0骨髓瘤细胞系，转染有突变的bcl-eee基因，暴露至甲氨蝶呤以扩增转染基因序列，并且预先改造为用于蛋白质表达的无血清细胞系。
嵌合抗体
嵌合抗体是其中人抗体的可变区被例如小鼠抗体的可变区，包括小鼠抗体的互补决定区(cdr)置换的重组蛋白。当施用至受试者时，嵌合抗体表现出降低的免疫原性和增加的稳定性。用于克隆鼠免疫球蛋白可变区的一般技术已公开于例如orlandi等人,proc.nat'lacad.sci.usa6:3833(1989)中。用于构建嵌合抗体的技术是本领域的技术人员熟知的。作为实例，leung等人,hybridoma13:469(1994)通过将编码鼠ll2(抗cd22单克隆抗体)的vκ和vh结构域的dna序列与相应的人κ和igg1恒定区结构域组合生成ll2嵌合体。
人源化抗体
用于产生人源化mab的技术是本领域熟知的(参见例如，jones等人,nature321:522(1986)；riechmann等人,nature332:323(1988)；verhoeyen等人,science239:1534(1988)；carter等人,proc.nat'lacad.sci.usa89:4285(1992),sandhu,crit.rev.biotech.12:437(1992)以及singer等人,j.immun.150:2844(1993))。嵌合或鼠单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的可变重链和轻链的小鼠cdr转移到人抗体的相应可变结构域中来进行人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠框架区(fr)也被人fr序列置换。由于简单地将小鼠cdr转移到人fr通常会导致抗体亲和力的减少或甚至丧失，另外的修饰对于恢复鼠抗体的初始亲和力可为必须的。这可通过将fr区中的一个或多个人残基取代为其鼠对应部分，以获得对其表位具有良好的结合亲和力的抗体来实现。参见例如tempest等人,biotechnology9:266(1991)和verhoeyen等人,science239:1534(1988)。用于取代的优选残基包括位于cdr残基侧链的1、2或3埃内，位于cdr序列附近，或预期与cdr残基相互作用的fr残基。
人抗体
使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生完全人抗体的方法是本领域已知的(例如，mancini等人,2004,newmicrobiol.27:315-28；conrad和scheller,2005,comb.chem.highthroughputscreen.8:117-26；brekke和loset,2003,curr.opin.pharmacol.3:544-50)。完全人抗体也可通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术构建，所有技术都是本领域已知的。参见例如，mccafferty等人,nature348:552-553(1990)。预期此类完全人抗体表现出比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用并且在体内起基本上内源性人抗体的作用。
在一个替代方案中，可使用噬菌体展示技术来产生人抗体(例如，dantas-barbosa等人,2005,genet.mol.res.4:126-40)。人抗体可从正常人或从表现出特定疾病状态如癌症的人产生(dantas-barbosa等人，2005)。从患病个体构建人抗体的优点在于循环抗体谱系可偏向针对疾病相关抗原的抗体。
在这种方法的一个非限制性实例中，dantas-barbosa等人(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人fab抗体片段的噬菌体展示库。一般来说，从循环血液淋巴细胞获得总rna(同上)。从μ、γ和κ链抗体谱系克隆重组fab并插入噬菌体展示文库中(同上)。将rna转化成cdna并用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物制备fabcdna文库(marks等人,1991,j.mol.biol.222:581-97)。根据andris-widhopf等人(2000,于：phagedisplaylaboratorymanual,barbas等人(编辑),第1版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny第9.1至9.22页中)进行文库构建。将最终fab片段用限制性核酸内切酶消化，并插入噬菌体基因组中，以制备噬菌体展示库。此类文库可使用本领域已知的标准噬菌体展示方法筛选。可以各种形式进行噬菌体展示，对于它们的综述，参见例如johnson和chiswell,currentopinioninstructuralbiology3:5564-571(1993)。
人抗体也可通过体外活化的b细胞来生成。参见美国专利号5,567,610和5,229,275，所述专利以引用的方式整体并入本文。熟练技术人员将认识到，这些技术是示例性的，并且可使用用于制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
在另一个替代方案中，使用标准免疫实验方案，已进行遗传工程化以产生人抗体的转基因动物可用来产生针对基本上任何免疫原性靶标的抗体。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法由green等人etal.,naturegenet.7:13(1994)；lonberg等人,nature368:856(1994)和taylor等人,int.immun.6:579(1994)公开。这种系统的非限制性实例是来自(fremont,ca)的
用含有人igh和igκ基因座的部分的种系构型yac(酵母人工染色体)转化
已知抗体和靶标抗原
如上所述，在优选的实施方案中，adc用于治疗癌症。在某些实施方案中，靶癌症可表达一种或多种靶肿瘤相关抗原(taa)。可用于治疗癌症的具体抗体包括但不限于ll1(抗cd74)、ll2或rfb4(抗cd22)、维妥珠单抗(ha20，抗cd20)、利妥昔单抗(抗cd20)、奥比妥珠单抗(ga101，抗cd20)、兰布罗利珠单抗(抗pd-1受体)、纳武单抗(抗pd-1受体)、伊匹单抗(抗ctla-4)、rs7(抗上皮糖蛋白-1(egp-1，也称为trop-2))、pam4或kc4(两者均为抗粘蛋白)、mn-14(抗癌胚抗原(cea，也称为cd66e或ceacam5)、mn-15或mn-3(抗ceacam6)、mu-9(抗结肠特异性抗原-p)、immu31(抗α-胎蛋白)、r1(抗igf-1r)、a19(抗cd19)、tag-72(例如，cc49)、tn、j591或huj591(抗psma(前列腺特异性膜抗原))、ab-pg1-xg1-026(抗psma二聚体)、d2/b(抗psma)、g250(抗碳酸酐酶ixmab)、l243(抗hla-dr)、阿仑单抗(抗cd52)、贝伐单抗(抗vegf)、西妥昔单抗(抗egfr)、吉妥珠单抗(抗cd33)、替伊莫单抗(抗cd20)、帕尼单抗(抗egfr)、托西莫单抗(抗cd20)、pam4(又名克伐珠单抗，抗粘蛋白)和曲妥珠单抗(抗erbb2)。此类抗体是本领域已知的(例如，美国专利号5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403；7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239；以及美国专利申请公布号20050271671；20060193865；20060210475；20070087001；各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。所用的具体已知的抗体包括hpam4(美国专利号7,282,567)、ha20(美国专利号7,151,164)、ha19(美国专利号7,109,304)、himmu-31(美国专利号7,300,655)、hll1(美国专利号7,312,318)、hll2(美国专利号5.789.554)、hmu-9(美国专利号7,387,772)、hl243(美国专利号7,612,180)、hmn-14(美国专利号6,676,924)、hmn-15(美国专利号8,287,865)、hr1(美国专利号9,441,043)、hrs7(美国专利号7,238,785)、hmn-3(美国专利号7,541,440)、ab-pg1-xg1-026(美国专利申请11/983,372，其保藏为atccpta-4405和pta-4406)以及d2/b(wo2009/130575)，关于附图和实施例部分，每一个列举的专利或申请的文本以引用的方式并入本文。
可被靶向的其他可用肿瘤相关抗原包括碳酸酐酶ix、b7、ccl19、ccl21、csap、her-2/neu、bre3、cd1、cd1a、cd2、cd3、cd4、cd5、cd8、cd11a、cd14、cd15、cd16、cd18、cd19、cd20(例如，c2b8、ha20、1f5mab)、cd21、cd22、cd23、cd25、cd29、cd30、cd32b、cd33、cd37、cd38、cd40、cd40l、cd44、cd45、cd46、cd47、cd52、cd54、cd55、cd59、cd64、cd67、cd70、cd74、cd79a、cd80、cd83、cd95、cd126、cd133、cd138、cd147、cd154、ceacam5、ceacam6、ctla-4、α-胎蛋白(afp)、vegf(例如，
归因于更具治疗耐受性前体恶性细胞群体的癌症干细胞(hill和perris,j.natl.cancerinst.2007；99:1435-40)具有可在某些癌症类型中靶向的抗原，诸如前列腺癌(maitland等人,ernstscheringfound.sympos.proc.2006；5:155-79)、非小细胞肺癌(donnenberg等人,j.controlrelease2007；122(3):385-91)和成胶质细胞瘤(beier等人,cancerres.2007；67(9):4010-5)中的cd133，以及结肠直肠癌(dalerba等人,proc.natl.acad.sci.usa2007；104(24)10158-63)、胰腺癌(li等人,cancerres.2007；67(3):1030-7)和头颈部鳞状细胞癌(prince等人,proc.natl.acad.sci.usa2007；104(3)973-8)中的cd44。乳腺癌治疗的另一个有用靶标是taylor等人(biochem.j.2003；375:51-9)描述的liv-1抗原。
检查点抑制剂抗体已用于癌症治疗。免疫检查点是指在免疫系统中负责维持自身耐受性和调节免疫系统应答的程度，以尽量减少外周组织损伤的抑制途径。然而，肿瘤细胞也可活化免疫系统检查点，以减少针对肿瘤组织的免疫应答的有效性。针对细胞毒性t-淋巴细胞抗原4(ctla4，也称为cd152)、程序性细胞死亡蛋白1(pd1，也称为cd279)和程序性细胞死亡1配体1(pd-l1，也称为cd274)的示例性检查点抑制剂抗体可与一种或多种其他剂组合使用，以增加针对患病细胞、组织或病原体的免疫应答的有效性。示例性抗pd1抗体包括兰布罗利珠单抗(mk-3475，merck)、纳武单抗(bms-936558，bristol-myerssquibb)、amp-224(merck)和匹地利珠单抗(ct-011，curetechltd.)。抗pd1抗体可例如从
巨噬细胞迁移抑制因子(mif)是先天性和适应性免疫和细胞凋亡的重要调控因子。据报道，cd74是mif的内源性受体(leng等人,2003,jexpmed197:1467-76)。拮抗性抗cd74抗体对mif介导的细胞内途径的治疗作用可用于治疗一系列广泛的疾病状态，如膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌(例如，meyer-siegler等人,2004,bmccancer12:34；shachar&haran,2011,leuklymphoma52:1446-54)。米拉珠单抗(hll1)是具有用于治疗mif介导的疾病的治疗用途的示例性抗cd74抗体。
所用的各种其他抗体是本领域已知的(例如，美国专利号5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403；7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,585,491；7,612,180；7,642,239以及美国专利申请公布号20060193865，所述专利各自以引用的方式并入本文)。
所用的抗体可从广泛的已知来源商购获得。例如，许多分泌抗体的杂交瘤系可自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection(atcc,manassas,va))获得。大量针对各种疾病靶标(包括肿瘤相关抗原)的抗体已保藏于atcc和/或已公布可变区序列并且可获得以用于所要求保护的方法和组合物中。参见例如，美国专利号7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572；856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040,6,451,310；6,444,206’6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953；5,525,338。这些仅仅是示例性的，并且许多其他抗体及其杂交瘤是本领域已知的。熟练技术人员将认识到，针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或分泌抗体的杂交瘤可通过在atcc、ncbi和/或uspto数据库中简单搜索针对目标选定疾病相关靶标的抗体来获得。可使用本领域熟知的标准技术扩增、切除克隆的抗体的抗原结合结构域，连接至表达载体中，转染到适应宿主细胞中并用于蛋白质产生。
抗体同种异型
治疗性抗体的免疫原性与输注反应的风险增加和治疗性应答的持续时间减少相关(baert等人,2003,nengljmed348:602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可部分地通过抗体的同种异型来确定(stickler等人,2011,genesandimmunity12:213-21)。抗体同种异型涉及抗体的恒定区序列中特定位置处的氨基酸序列变型。含有重链γ-型恒定区的igg抗体的同种异型被命名为gm同种异型(1976,jimmunol117:1056-59)。
对于常见的igg1人抗体而言，最普遍的同种异型是g1m1(stickler等人,2011,genesandimmunity12:213-21)。然而，g1m3同种异型在白种人(caucasians)中也是常见的(stickler等人，2011)。已经报告了当向非g1m1(ng1m1)接受者(如g1m3患者)施用时，g1m1抗体含有倾向于诱导免疫应答的同种异型序列(stickler等人，2011)。当向g1m1患者施用时，非g1m1同种异型抗体不是作为免疫原性的(stickler等人，2011)。
人g1m1同种异型包含重链igg1的ch3序列中kabat位置356处的氨基酸天冬氨酸和kabat位置358处的氨基酸亮氨酸。ng1m1同种异型包含kabat位置356处的氨基酸谷氨酸和kabat位置358处的氨基酸甲硫氨酸。g1ml和ng1ml同种异型二者包含kabat位置357处的谷氨酸残基，并且所述同种异型有时称为del和eem同种异型。针对示例性抗体利妥昔单抗(seqidno:7)和维妥珠单抗(seqidno:8)，以下示出g1m1和ng1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例。
利妥昔单抗重链可变区序列(seqidno:7)
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkaepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
维妥珠单抗重链可变区(seqidno:8)
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
jefferis和lefranc(2009,mabs1:1-7)综述了为igg同种异型的特征的序列变型和它们对免疫原性的影响。他们报道了与g1m17同种异型中的kabat214处的赖氨酸残基相比，g1m3同种异型的特征在于kabat位置214处的精氨酸残基。ng1m1,2同种异型的特征在于kabat位置356处的谷氨酸、kabat位置358处的甲硫氨酸和kabat位置431处的丙氨酸。g1m1,2同种异型的特征在于kabat位置356处的天冬氨酸、kabat位置358处的亮氨酸和kabat位置431处的甘氨酸。除重链恒定区序列变体之外，jefferis和lefranc(2009)报告了κ轻链恒定区中的同种异型变体，其中km1同种异型的特征在于kabat位置153处的缬氨酸和kabat位置191处的亮氨酸，km1,2同种异型的特征在于kabat位置153处上的丙氨酸和kabat位置191处的亮氨酸，并且km3同种异型的特征在于kabat位置153处的丙氨酸和kabat位置191处的缬氨酸。
关于治疗性抗体，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别是对治疗各种各样的血液恶性肿瘤和/或自身免疫疾病有用的、针对cd20的人源化和嵌合igg1抗体。表1比较了利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种异型序列。如在表1中所示，利妥昔单抗(g1m17,1)是del同种异型igg1，在利妥昔单抗中的赖氨酸相对维妥珠单抗中的精氨酸在kabat位置214(重链ch1)处具有额外序列变化。已经报告了在受试者中维妥珠单抗比利妥昔单抗的免疫原性小(参见例如，morchhauser等人,2009,jclinoncol27:3346-53；goldenberg等人,2009,blood113:1062-70；robak&robak,2011,biodrugs25:13-25)，所述作用已经被归因于人源化抗体与嵌合抗体之间的差异。然而，eem与del同种异型之间的同种异型的差异可能也解释了维妥珠单抗的较低免疫原性。
表1利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种异型
为了减小治疗性抗体在ng1m1基因型个体中的免疫原性，希望选择的抗体同种异型对应于g1m3同种异型，其特征在于kabat214处的精氨酸；和ng1m1,2无效同种异型，其特征在于kabat位置356处的谷氨酸、kabat位置358处的甲硫氨酸以及kabat位置431处的丙氨酸。出人意料地，发现在长时间段内重复皮下施用g1m3抗体不会产生显著免疫应答。在替代实施方案中，与g1m3同种异型有共同之处的人igg4重链具有kabat214处的精氨酸、kabat356处的谷氨酸、kabat359处的甲硫氨酸和kabat431处的丙氨酸。由于免疫原性似乎至少部分与这些位置处的残基相关，人igg4重链恒定区序列用于治疗抗体也是优选的实施方案。g1m3igg1抗体与igg4抗体的组合也可用于治疗剂施用。
纳米抗体
纳米抗体是大小为约12-15kda(长度为约110个氨基酸)的单结构域抗体。纳米抗体可选择性地结合至靶标抗原，如完整大小的抗体，并且具有类似的抗原亲和力。然而，由于其大小较小，因此能够更好地穿透实体肿瘤。较小的大小也有助于稳定纳米抗体，其比完整大小的抗体更耐ph和极端温度(vanderlinden等人,1999,biochimbiophysact1431:37-46)。单结构域抗体最初根据如下发现开发：骆驼科(骆驼、羊驼、美洲驼)具有无轻链的完全功能抗体(例如，hamsen等人,2007,applmicrobiolbiotechnol77:13-22)。重链抗体由单个可变结构域(vhh)和两个恒定结构域(ch2和ch3)组成。像抗体那样，纳米抗体可开发和用作多价和/或双特异性构建体。纳米抗体的人源化形式正在商业开发中，其靶向许多靶抗原，如il-6r、vwf、tnf、rsv、rankl、il-17a&f和ige(例如，
纳米抗体的血浆半衰期小于完全大小的抗体，主要通过肾脏途径消除。因为它们缺乏fc区，所以不表现出补体依赖性细胞毒性。
纳米抗体可通过以下步骤制备：用靶抗原免疫骆驼、美洲驼、羊驼或鲨鱼，然后分离mrna，克隆至文库并筛选抗原结合。纳米抗体序列可通过标准技术人源化(例如，jones等人,1986,nature321:522；riechmann等人,1988,nature332:323；verhoeyen等人,1988,science239:1534；carter等人,1992,proc.nat'lacad.sci.usa89:4285,sandhu,1992,crit.rev.biotech.12:437；singer等人,1993,j.immun.150:2844)。由于骆驼科与人fr序列之间的高同源性，人源化相对直接。
在各种实施方案中，主题adc可包括用于将缀合的药物靶向递送至靶标癌细胞的纳米抗体。所用的纳米抗体公开于例如美国专利号7,807,162；7,939,277；8,188,223；8,217,140；8,372,398；8,557,965；8,623,361和8,629,244，所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。
抗体片段
抗体片段是抗体的抗原结合部分，诸如f(ab’)2、fab’、f(ab)2、fab、fv、sfv、scfv等。识别特定表位的抗体片段可通过已知技术制备。f(ab’)2片段，例如可通过胃蛋白酶消化抗体分子来制备。这些和其他方法例如由goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647以及其中包含的参考文献描述。还可参见nisonoff等人,archbiochem.biophys.89:230(1960)；porter,biochem.j.73:119(1959)；edelman等人,于methodsinenzymology第1卷，第422页(academicpress1967)和coligan，第2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页中。或者，可构建fab’表达文库(huse等人,1989,science,246:1274-1281)，以使快速和简易鉴定具有所需特异性的单克隆fab’片段。
单链fv分子(scfv)包括vl结构域和vh结构域。vl和vh结构域缔合形成靶标结合位点。这两个结构域还通过肽接头(l)共价连接。如果vl结构域是scfv分子的n-末端部分，则scfv分子表示为vl-l-vh，或如果vh结构域是scfv分子的n-末端部分，则表示为vh-l-vl。用于制备scfv分子和设计合适的肽接头的方法描述于美国专利号4,704,692、美国专利号4,946,778、r.raag和m.whitlow,"singlechainfvs."faseb第9卷:73-80(1995)以及r.e.bird和b.w.walker,singlechainantibodyvariableregions,tibtech,第9卷:132-137(1991)。
其他抗体片段，例如单结构域抗体片段，是本领域已知的并且可用于受权利要求书保护的构建体。单结构域抗体(vhh)可例如通过标准免疫技术从骆驼、羊驼或美洲驼获得。(参见例如，muyldermans等人,tibs26:230-235,2001；yau等人,jimmunolmethods281:161-75,2003；maass等人,jimmunolmethods324:13-25,2007)。vhh可具有强大的抗原结合能力，并且可与传统vh-vl对无法触及的新表位相互作用(muyldermans等人，2001)。羊驼血清igg含有约50％的骆驼科仅重链igg抗体(hcab)(maass等人，2007)。可使用已知的抗原诸如tnf-α免疫羊驼，并且可分离结合至以及中和靶抗原的vhh(maass等人，2007)。已鉴定扩增几乎所有编码羊驼vhh的序列的pcr引物，并且可用于构建羊驼vhh噬菌体展示文库，所述文库可用于通过本领域熟知的标准生物淘选技术进行抗体片段分离(maass等人，2007)。
抗体片段也可通过全长抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或另一种宿主中表达编码该片段的dna来制备。抗体片段可通过常规方法使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体来获得。例如，抗体片段可通过使用胃蛋白酶来酶切抗体来制备，从而得到大约100kd以f(ab’)2表示的片段。此片段可使用硫醇还原剂和任选地由二硫键联的裂解产生的巯基基团的封端基团进一步裂解，以产生大约50kdfab’单价片段。或者，使用木瓜蛋白酶进行酶促裂解直接产生两个单价fab片段和一个fc片段。
还可使用裂解抗体的其他方法，如分离重链以形成单价轻链-重链片段、进一步裂解片段，或其他酶促、化学或遗传技术，只要所述片段结合至由完整抗体识别的抗原即可。
双特异性和多特异性抗体
双特异性抗体可用于许多生物医学应用中。例如，具有用于肿瘤细胞表面抗原和用于t细胞表面受体的结合位点的双特异性抗体可指导通过t细胞的特异性肿瘤细胞的溶解。识别神经胶质瘤和t细胞上的cd3表位的双特异性抗体已经成功用于治疗人患者的脑肿瘤(nitta,等人lancet.1990；355:368-371)。优选的双特异性抗体是抗cd3x抗trop-2抗体。在替代实施方案中，抗cd3抗体或其片段可附接至针对b细胞相关抗原的抗体或片段，如抗cd3x抗cd19、抗cd3x抗cd20、抗cd3x抗cd22、抗cd3x抗hla-dr或抗cd3x抗cd74。在某些实施方案中，本文公开的用于治疗剂递送的技术和组合物可与作为靶向部分的双特异性或多特异性抗体一起使用。
用于产生双特异性或多特异性抗体的许多方法是已知的，如例如美国专利号7,405,320所公开，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。双特异性抗体可通过四源杂交瘤方法产生，所述方法包括使各自产生识别不同抗原位点的单克隆抗体的两种不同杂交瘤的融合(milstein和cuello,nature,1983；305:537-540)。
用于产生双特异性抗体的另一种方法使用异双官能交联剂来化学系栓两种不同的单克隆抗体(staerz,等人nature,1985；314:628-631；perez,等人nature,1985；316:354-356)。双特异性抗体也可通过将两种亲本单克隆抗体中的每种还原成相应半分子，然后将其混合并使其再氧化以获得杂合体结构(staerz和bevan.procnatlacadsciusa.1986；83:1453-1457)。另一替代方案涉及使用适当接头使两种或三种单独纯化的fab'片段化学交联。(参见例如，欧洲专利申请0453082)。
其他方法包括通过经由逆转录病毒来源的穿梭载体将独特的选择性标记基因转移至相应的亲本杂交瘤中，随后将它们融合(demonte,等人procnatlacadsciusa.1990,87:2941-2945)；或使用含有不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系来提高产生杂合体杂交瘤的效率。
可将同源vh和vl结构域与具有适当组成和长度(通常由多于12个氨基酸残基组成)的肽接头接合以形成具有结合活性的单链fv(scfv)。制造scfv的方法公开于美国专利号4,946,778和美国专利号5,132,405中，所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。肽接头长度减小至小于12个氨基酸残基防止了相同链上vh和vl结构域的配对，并且迫使vh和vl结构域与其他链上的互补结构域的配对，从而形成功能多聚体。与3与12个氨基酸残基之间的接头接合的vh和vl结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双抗体)。使用0与2个氨基酸残基之间的接头，有助于形成三聚体(称为三抗体)和四聚体(称为四抗体)，但除接头长度之外，寡聚化的准确模式似乎取决于v结构域(vh-接头-vl或vl-接头-vh)的组成以及取向。
用于产生多特异性或双特异性抗体的这些技术就低收率、纯化的必要性、低稳定性或技术的劳动密集性而言表现出许多困难。最近，已经利用称为“对接锁定(dockandlock)”(dnl)的技术来产生几乎任何所需抗体、抗体片段和其他效应分子的组合(参见例如，美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143；7,666,400；7,858,070；7,871,622；7,906,121；7,906,118；8,163,291；7,901,680；7,981,398；8,003,111以及8,034,352，所述专利各自的实施例部分以引用的方式并入本文。所述技术利用称为锚定结构域(ad)和二聚化与对接结构域(ddd)的互补蛋白质结合结构域，其彼此结合并且允许组装范围为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体的复杂分子。这些以高产率形成稳定复合物而不需要广泛纯化。dnl技术允许组装单特异性、双特异性或多特异性抗体。本领域已知的用于制备双特异性或多特异性抗体的任何技术可用于实施本发明要求保护的方法。
缀合方案
在某些实施方案中，细胞毒性药物或其他治疗剂或诊断剂可共价附接至抗体或抗体片段以形成免疫缀合物。在一些实施方案中，药物或其他剂可经由载体部分附接至抗体或其片段。载体部分可例如附接至还原的sh基团和/或碳水化合物侧链。载体部分可经由二硫键形成附接至还原抗体组分的铰链区。或者，此类剂可使用异双官能交联剂，如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸n-琥珀酰基酯(spdp)附接。yu等人,int.j.cancer56:244(1994)。这种缀合的一般技术是本领域熟知的。参见例如，wong,chemistryofproteinconjugationandcross-linking(crcpress1991)；upeslacis等人,“modificationofantibodiesbychemicalmethods,”于monoclonalantibodies:principlesandapplications,birch等人(编辑),第187-230页(wiley-liss,inc.1995)中；price,“productionandcharacterizationofsyntheticpeptide-derivedantibodies,”于monoclonalantibodies:production,engineeringandclinicalapplication,ritter等人(编辑),第60-84页(cambridgeuniversitypress1995)中。或者，载体部分可经由抗体的fc区中的碳水化合物部分缀合。
用于经由抗体碳水化合物部分将官能团缀合至抗体的方法是本领域的技术人员熟知的。参见例如，shih等人,int.j.cancer41:832(1988)；shih等人,int.j.cancer46:1101(1990)；以及shih等人,美国专利号5,057,313，其实施例部分以引用的方式并入本文。一般方法涉及使具有氧化的碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能团的载体聚合物反应。这种反应产生初始席夫碱(亚胺)键联，所述键联可通过还原成仲胺来稳定，以形成最终缀合物。
如果adc的抗体组分是抗体片段，则可能不存在fc区。然而，有可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见例如，leung等人,j.immunol.154:5919(1995)；美国专利号5,443,953和6,254,868，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。使用工程化的碳水化合物部分来附接治疗剂或诊断剂。
用于将载体部分附接至靶向分子的替代方法涉及使用点击化学反应。点击化学方法最初构想为通过将小亚基以模组方式连接在一起来快速生成复合物的方法。(参见例如，kolb等人,2004,angewcheminted40:3004-31；evans,2007,austjchem60:384-95。)各种形式的点击化学反应是本领域已知的，如胡伊斯根(huisgen)1,3-偶极环加成铜催化反应(tornoe等人,2002,jorganicchem67:3057-64)，其通常称为“点击反应”。其他替代方案包括环加成反应，诸如diels-alder、亲核取代反应(特别是小张力环如环氧基和氮丙啶化合物)、脲化合物的羰基化学形成以及涉及碳-碳双键的反应，诸如硫醇-炔反应中的炔烃。
叠氮化物炔烃胡伊斯根环加成反应使用铜催化剂在存在还原剂的情况下催化末端炔烃基附接至第一分子的反应。在存在包含叠氮化物部分的第二分子的情况下，叠氮化物与活化的炔烃反应以形成1,4-二取代的1,2,3-三唑。铜催化反应在室温下进行，并且具有足够的特异性，以使得反应产物的纯化通常不是必须的。(rostovstev等人,2002,angewcheminted41:2596；tornoe等人,2002,jorgchem67:3057。)叠氮化物和炔烃官能团对水介质中的生物分子为基本上惰性的，从而使反应在复合物溶液中进行。所形成的三唑在化学上是稳定的，未经受酶裂解，从而使得点击化学产物在生物系统中是高度稳定的。虽然铜催化剂对活细胞是有毒的，但基于铜的点击化学反应可在体外用于免疫缀合物形成。
已提出用于生物分子的共价修饰的无铜点击反应。(参见例如，agard等人,2004,jamchemsoc126:15046-47。)无铜反应使用环张力代替铜催化剂来促进[3+2]叠氮化物-炔烃环加成反应(同上)。例如，环辛炔是包含内部炔烃键的8碳环结构。闭环结构诱导了乙炔的显著键角变形，乙炔与叠氮化物基团反应形成三唑具有高度反应性。因此，环辛炔衍生物可用于无铜点击反应(同上)。
ning等人(2010,angewcheminted49:3065-68)报告了另一种类型的无铜点击反应，涉及张力促进的炔烃-硝酮环加成反应。为解决初始环辛炔反应的缓慢速率，将吸电子基团邻近附接至三键(同上)。此类取代环辛炔的实例包括二氟化环辛炔、4-二苯并环辛炔醇和氮杂环辛炔(同上)。替代无铜反应涉及张力促进的炔烃-硝酮环加成反应，得到n-烷基化异噁唑啉(同上)。据报告，所述反应具有特别快的反应动力学，并且用于肽和蛋白质的位点特异性修饰的一锅三步骤方案(同上)。硝酮通过适当的醛与n-甲基羟胺的缩合反应制备，并且环加成反应在乙腈和水的混合物中进行(同上)。这些和其他已知的点击化学反应可用于在体外将载体部分附接至抗体。
agard等人(2004,jamchemsoc126:15046-47)显示，在存在全乙酰化n-叠氮基乙酰基甘露糖胺的情况下在cho细胞中表达重组糖蛋白的结果是将n-叠氮基乙酰基唾液酸生物掺入糖蛋白的碳水化合物。叠氮基衍生化的糖蛋白与生物素化环辛炔特异性反应以形成生物素化糖蛋白，而无叠氮基部分的对照糖蛋白仍然未标记(同上)。laughlin等人(2008,science320:664-667)使用类似的技术来代谢标记与全乙酰化n-叠氮基乙酰半乳糖胺一起孵育的斑马鱼胚胎中的细胞表面聚糖。叠氮基衍生化的聚糖与二氟化环辛炔(difo)试剂反应以使聚糖在体内可视化。
diels-alder反应也用于分子的体内标记。rossin等人(2010,angewcheminted49:3375-78)报道了携带反式环辛烯(tco)反应性部分和111in标记的四嗪dota衍生物的肿瘤定位的抗tag72(cc49)抗体之间的体内收率为52％。将tco标记的cc49抗体施用至携带结肠癌异种移植物的小鼠，在1天后注射111in标记的四嗪探针(同上)。放射性标记的探针与肿瘤定位的抗体的反应的结果是在肿瘤中产生显著的放射性定位，如在注射放射性标记探针三小时后活小鼠的spect成像所示，肿瘤与肌肉的比率为13:1(同上)。结果确认了tco和四嗪标记分子的体内化学反应。
点击化学反应的修饰适用于体外或体内。反应性靶向分子可通过化学缀合或通过生物掺入形成。靶向分子，诸如抗体或抗体片段，可使用叠氮基部分、取代环辛炔或炔烃基或硝酮部分活化。在靶向分子包含叠氮基或硝酮基的情况下，对应的可靶向构建体将包含取代环辛炔或炔烃基，反之亦然。此类活化分子可通过活细胞中的代谢掺入制备，如上文所讨论。
或者，此类部分化学缀合至生物分子的方法是本领域熟知的，并且可利用任何此类已知的方法。免疫缀合物形成的一般方法公开于例如美国专利号4,699,784、4,824,659、5,525,338、5,677,427、5,697,902、5,716,595、6,071,490、6,187,284、6,306,393、6,548,275、6,653,104、6,962,702、7,033,572、7,147,856和7,259,240，其各自的实施例部分以引用的方式并入本文。
其他治疗剂
多种治疗性试剂可与主题adc同时或依序施用。或者，此类剂可与本发明的抗体缀合，例如，药物、毒素、寡核苷酸、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、放射性核素、血管生成抑制剂等。在此列举的治疗剂是对于如上所述的adc单独施用也是有用的那些剂。治疗剂包括例如化学治疗药物，如长春花生物碱、蒽环类药物如阿霉素、吉西他滨、表鬼臼毒素、紫杉烷、抗代谢物、烷基化剂、抗生素、sn-38、cox-2抑制剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂和促凋亡剂，特别是阿霉素、甲氨蝶呤、紫杉酚、cpt-11、喜树碱、蛋白酶体抑制剂、mtor抑制剂、hdac抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和其他药物。用于同时或依序施用或用于制备adc的其他有用的抗癌细胞毒性药物包括氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、cox-2抑制剂、抗代谢物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、mtor抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、hdac抑制剂、喜树碱、激素等。合适的细胞毒性剂描述于remington'spharmaceuticalsciences,第19版(mackpublishingco.1995)和goodmanandgilman’sthepharmacologicalbasisoftherapeutics,第7版(macmillanpublishingco.1985)以及这些出版物的修订版所述。其他合适的细胞毒性剂诸如实验药物是本领域的技术人员已知的。在一个优选的实施方案中，喜树碱和相关化合物的缀合物诸如sn-38可缀合至hrs7或其他抗trop-2抗体。
毒素可以是动物、植物或微生物来源的。所用的毒素包括蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(rna酶)、dna酶i、葡萄球菌肠毒素a、美洲商陆抗病毒蛋白、豹蛙抗瘤酶(onconase)、白树毒素(gelonin)、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。参见例如，pastan等人,cell47:641(1986),goldenberg,ca--acancerjournalforclinicians44:43(1994)；sharkey和goldenberg,ca--acancerjournalforclinicians56:226(2006)。适合使用的另外毒素是本领域的技术人员已知的，并且如美国专利号6,077,499所公开，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、淋巴因子、单核因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(csf)、干扰素(ifn)、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)、促黄体激素(lh)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、促乳素、胎盘催乳素、ob蛋白、转化生长因子(tgf)、tgf-α、tgf-β、胰岛素样生长因子(ilgf)、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(tnf)、tnf-α、tnf-β、苗勒管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、白介素(il)、粒细胞-集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(gm-csf)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、s1因子、il-1、il-1cc、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-21和il-25、lif、kit配体、flt-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮他丁、淋巴毒素等等。
特别有用的治疗性放射性核素包括但不限于111in、177lu、212bi、213bi、211at、62cu、64cu、67cu、90y、125i、131i、32p、33p、47sc、111ag、67ga、142pr、153sm、161tb、166dy、166ho、186re、188re、189re、212pb、223ra、225ac、59fe、75se、77as、89sr、99mo、105rh、109pd、143pr、149pm、169er、194ir、198au、199au以及211pb。治疗性放射性核素优选地具有在20至6,000kev范围内、优选地在60至200kev的范围内(对于俄歇发射体)、在100-2,500kev的范围内(对于β发射体)和在4,000-6,000kev的范围内(对于α发射体)的衰变能。可用的β粒子发射核素的最大衰变能为优选地20-5,000kev、更优选地100-4,000kev以及最优选地500-2,500kev。另外优选的是基本上随俄歇发射粒子而衰变的放射性核素。例如，co-58、ga-67、br-80m、tc-99m、rh-103m、pt-109、in-111、sb-119、i-125、ho-161、os-189m和ir-192。可用的β粒子发射核素的衰变能为优选地1,000kev、更优选地100kev以及最优选地70kev。另外优选的是基本上随α粒子的产生而衰变的放射性核素。此类放射性核素包括但不限于：dy-152、at-211、bi-212、ra-223、rn-219、po-215、bi-211、ac-225、fr-221、at-217、bi-213、fm-255和th-227。可用的α粒子发射放射性核素的衰变能优选地是2,000-10,000kev、更优选地3,000-8,000kev并且最优选地4,000-7,000kev。
例如，可使用二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)或更优选地使用dota将发射高能β粒子的90y偶联至抗体、抗体片段或融合蛋白。将90y缀合至抗体或可靶向构建体的方法是本领域已知的，并且可使用任何此类已知的方法。(参见例如，美国专利号7,259,249，所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文。还可参见lindén等人,clincancerres.11:5215-22,2005；sharkey等人,jnuclmed.46:620-33,2005；sharkey等人,jnuclmed.44:2000-18,2003。)
另外可能的治疗性放射性同位素包括11c、13n、15o、75br、198au、224ac、126i、133i、77br、113min、95ru、97ru、103ru、105ru、107hg、203hg、121mte、122mte、125mte、165tm、167tm、168tm、197pt、109pd、105rh、142pr、143pr、161tb、166ho、199au、57co、58co、51cr、59fe、75se、201tl、225ac、76br、169yb等。
在另一个实施方案中，放射致敏剂可与裸的或缀合抗体或抗体片段组合使用。例如，放射致敏剂可与放射性标记的抗体或抗体片段组合使用。与单独使用放射性标记的抗体或抗体片段治疗相比，加入放射致敏剂可产生增强功效。放射致敏剂如d.m.goldenberg(编),cancertherapywithradiolabeledantibodies,crcpress(1995)所述。与这种技术一起使用的目标其他典型放射致敏剂包括吉西他滨、5-氟尿苷和顺铂，并且与各种癌症治疗中的外部照射组合使用。
制剂和施用
adc的合适施用途径包括但不限于口服、肠胃外、皮下、直肠、经粘膜、肠内施用、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、玻璃体内、腔内、腹膜内或肿瘤内注射。优选的施用途径是肠胃外，更优选地是皮下。或者，可以局部而非全身方式施用化合物，例如经由将化合物直接注射到实体瘤或血液肿瘤中。
adc可根据已知方法进行配制以制备药学上有用的组合物，由此将所述adc与药学上合适的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上合适的赋形剂的一个实例。其他合适的赋形剂是本领域熟知的。参见例如，ansel等人,pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,第5版(lea&febiger1990)；和gennaro(编辑),remington’spharmaceuticalsciences,第18版(mackpublishingcompany1990)以及它们的修订版。
在一个优选的实施方案中，在good氏生物缓冲液(ph6-7)中，使用选自由以下组成的组的缓冲液配制adc：n-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(aces)、n-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ada)、n,n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(hepes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(mopso)以及哌嗪-n,n’-双(2-乙磺酸)[pipes]。更优选的缓冲液是mes或mops，优选地在20至100mm的浓度范围内，更优选地约25mm。最优选的是25mmmes,ph6.5。制剂还可包含25mm海藻糖和0.01％v/v聚山梨醇酯80作为赋形剂，由于添加的赋形剂而使最终缓冲液浓度变为22.25mm。优选的储存方法是以缀合物的冻干制剂储存在-20℃至2℃的温度范围内，最优选地储存在2℃至8℃的温度范围下。
主题adc可被配制用于经由例如推注、缓慢输注或连续输注进行静脉内施用。所述adc可在少于约4小时的时间内，并且更优选地在少于约3小时的时间内输注。例如，前25-50mg可在30分钟，优选地甚至15分钟内输注，并且其余的部分在接下来的2-3小时内输注。
或者，adc可被配制用于通过浓缩以用于低体积注射而进行皮下施用(参见，例如，美国专利号8,658,773、9,180,205和9,468,689；其各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。低体积施用可以是1、2或3ml或其任何部分。
用于注射的制剂可以单位剂型提供，例如在安瓿瓶或多剂量容器中，并添加防腐剂。组合物可采取诸如悬浮液、溶液或于油性或水性媒介物中的乳液的形式，并且可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是在使用前与合适的媒介物(例如不含热原的无菌水)一起复原的粉末形式。
另外的制药方法可用于控制治疗缀合物的作用持续时间。可通过使用聚合物来复合或吸附adc来制备控释制剂。例如，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)的基质以及硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物的基质。sherwood等人,bio/technology10:1446(1992)。从这种基质释放adc的速率取决于adc的分子量、基质内的adc的量以及分散颗粒的大小。saltzman等人,biophys.j.55:163(1989)；sherwood等人,同上。其他固体剂型在ansel等人,pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,第5版(lea&febiger1990),和gennaro(编辑),remington’spharmaceuticalsciences,第18版(mackpublishingcompany1990)以及它们的修订版中描述。
一般而言，用于人的施用的adc的剂量将根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学病状和先前病史的因素而变化。如上所述，通过静脉内或其他肠胃外施用递送的抗体-sn-38缀合物的剂量可从3至18、更优选4至16、更优选6至12、更优选8至10mg/kg变化。可根据需要重复剂量，例如，每周一次持续2-10周、每周一次持续8周或每周一次持续4周。还可根据维持治疗的需要以更低的频率给与，诸如每隔一周一次持续若干个月或每月一次或每季度一次持续许多个月。所述剂量优选地多次、每周一次或两次施用。可使用4周、更优选地8周、更优选地16周或更长的最小剂量时间表，其中剂量频率取决于大部分与血液毒性有关的毒性副作用以及由此的恢复。施用时间表可包括按选自由以下组成的组的周期每周一次或两次施用：(i)每周；(ii)每隔一周；(iii)治疗一周，随后停药两周、三周或四周；(iv)治疗两周，随后停药一周、两周、三周或四周；(v)治疗三周，然后停药一周、两周、三周、四周或五周；(vi)治疗四周，随后停药一周、两周、三周、四周或五周；(vii)治疗五周，随后停药一周、两周、三周、四周或五周；以及(viii)每月。所述周期可重复2、4、6、8、10或12次或更多次。
或者，可每2周或3周一次剂量施用adc，总共重复至少3次剂量。或者，每周两次，持续4-6周。剂量可每隔一周一次或甚至更低的频率施用，使患者可从任何药物相关毒性恢复。或者，可减少剂量时程，即每2周或每3周持续2-3个月。给药时程可任选地以其他时间间隔重复，并且剂量可在对剂量和时程进行适当调整下通过各种胃肠外途径给与。
对于皮下施用，诸如沙西妥珠单抗戈维替康(immu-132)、immu-130或immu-140的adc的剂量可能受限于在没有沉淀或聚集的情况下浓缩adc的能力，以及可皮下给与的施用体积(优选1、2或3ml或更少)。因此，对于皮下施用，adc可以2至4mg/kg给与，每天给予持续1周或每周3次持续2周、或每周两次持续2周，然后停药。可在诱导后每两到三周或每月静脉内或皮下施用维持剂量的adc。或者，可在以8-10mg/kg静脉内施用的二至四个周期发生诱导(每个周期，在两个21天周期的第1天和第8天施用adc，其间一周停药期)，然后作为每周一次或多次活性给药或作为维持疗法皮下施用。可基于中期肿瘤扫描和/或通过分析trop-2阳性循环肿瘤细胞来调整剂量。
本文所述和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或癌变前疾患，并且用于预防进展为赘生性或恶性状态，包括但不限于上述那些病症。此类用途表明了已知或怀疑先前进展为赘瘤或癌症的疾患，特别是在已发生包括增生、化生或最特别地发育异常的非赘生性细胞生长的情况下(关于此类异常生长疾患的综述，参见robbins和angell,basicpathology,第2版,w.b.saundersco.,philadelphia,第68-79页(1976))。
发育异常通常是癌症的预兆，并且主要可见于上皮中。其是非赘生性细胞生长的最无序形式，涉及个别细胞一致性和细胞结构取向的丧失。在存在慢性刺激或炎症的情况下，发育异常特征性地发生。在优选的实施方案中，本发明的方法用于抑制癌症，特别是上文列出的那些癌症的生长、进展和/或转移。
药盒
各种实施方案可涉及药盒，所述药盒含有适用于治疗患者的癌组织的组分。示例性药盒可含有至少一种如本文所述的adc。如果含有用于施用的组分的组合物未配制成经由消化道递送，如通过口服递送，那么可包括能够通过一些其他途径递送药盒部件的装置。用于诸如胃肠外递送的应用的一种类型的装置是注射器，其用于将组合物注射至受试者体内。还可使用吸入装置。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以含有抗体的无菌液体制剂或冻干制品的预填充注射器或自动注射笔形式提供(例如，kivitz等人,clin.ther.2006,28:1619-29)。
药盒部件可包装在一起或分成两个或更多个容器。在一些实施方案中，所述容器可以是含有适用于复原的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。药盒也可含有一种或多种适用于其他试剂的复原和/或稀释的缓冲液。可使用的其他容器包括但不限于小袋、托盘、盒、管等。药盒部件可包装并且无菌保持在容器内。可包括的另一个部件是试剂盒的使用说明。
实施例
以下实施例是本发明的实施方案的展示，并且不限制权利要求的范围。
实施例1.用immu-132(沙西妥珠单抗戈维替康)(一种抗trop-2-sn-38抗体药物缀合物(adc))靶向治疗胃肠(gi)癌
trop-2是在许多上皮癌中非常普遍的肿瘤相关糖蛋。其升高的表达一直与更具侵袭性的疾病和不良预后有关。结合至trop-2的细胞外结构域的人源化mab与sn-38(immu-132；平均药物:mab比率＝7.6)(cpt-11的活性成分)缀合。在人肿瘤异种移植物中的有效活性之后，在患有各种实体瘤(包括胃肠癌)的患者(pt)中开始i/ii期试验。
方法：患有转移性癌症的患者在用标准疗法治疗失败后招募，以在3周周期的第1天和第8天给与的8.0mg/kg的剂量开始。mtd被确定为12mg/kg；选择8和10mg/kg的剂量水平用于ii期测试。
结果：六十名患有晚期胃肠癌的患者被招募在i/ii期试验中。在29例crc患者中(9例以10mg/kg治疗，20例以8mg/kg治疗)，1例具有pr(部分应答)并且14例具有sd(稳定疾病)作为recist的最佳应答，其中进展时间(ttp)对于pr(-65％)为50+周，并且对于sd患者(5例持续)中值为21+周。十三例crc患者具有kras突变，7例显示sd，中值ttp为19.1+周(范围，12.0-34.0；3例持续)。在所治疗的15例胰腺癌患者中(5例以8mg/kg，7例以10mg/kg，并且3例以12mg/kg)，7例具有sd作为最佳应答，中值ttp为15.0周。在11例食道癌患者中(9例以8mg/kg开始，1例一10mg/kg，并且1例以18mg/kg)，8例进行了ct评估，显示1例pr，ttp为30+周；并且4例具有17.4+、21.9、26.3和29.9周的sd。在5例胃癌患者中(2例以8mg/kg，并且3例以10mg/kg)，仅3例进行了ct评估，都具有sd(1例靶病灶减少19％且持续ttp为29+周)。
嗜中性粒细胞减少症是主要的剂量限制性毒性，伴有疲劳、腹泻、恶心和呕吐等作为其他通常报告的毒性。然而，在完整试验中来自75例患者的毒性概况分别显示仅17.3％和2.7％的3级和4级嗜中性粒细胞减少症，以及仅6.7％的3级腹泻。
结论：immu-132在患有各种复发性转移性胃肠癌的患者中显示高治疗指数。它具有与内化的癌症选择性mab缀合的中等毒性药物，其可在21天周期内每周一次x2在数月内重复给与。
实施例2.抗ceacam5-sn-38抗体药物缀合物(immu-130)在转移性结肠直肠癌(mcrc)中的活性
immu-130是ceacam5靶向adc、拉贝珠单抗-sn-38，其中药物是拓扑异构酶i抑制剂cpt-11的活性形式，并且以7-8摩尔/摩尔igg替代。这种剂正处于患有复发性mcrc的患者的i/ii期临床试验中。
方法：实验在4周或更大的携带皮下ls174t人结肠癌异种移植物(约0.2cm3大小)或通过静脉内注射gw-39人结肠癌细胞产生肺转移后2周的雌性无胸腺裸鼠中进行。包括未处理的对照，包括非靶向adc。使用单一12.5mg/kg剂量的adc或未缀合的拉贝珠单抗(各自掺有111in标记的底物)在皮下模型中检查生物分布。在新西兰白兔中进行耐受性研究。
结果：在转移模型(n＝8)中，21天周期治疗的2个周期的分次给药、固定总剂量为50mg/kgadc显示每周两次×2周和每周一次×2周时间表与未处理的小鼠相比，使中值存活期加倍，并且优于两周一次时间表(p0.0474；对数秩)。在转移模型(n＝10)中，预先给药多达两倍剂量的拉贝珠单抗作为adc剂量，不影响中值存活期(p>0.15)。皮下模型中的治疗实验表明，immu-130中的接头(在约20小时内释放50％的药物)优于具有超稳定接头的缀合物(n＝5)，所述adc优于5fu/甲酰四氢叶酸化学疗法的mtd(n＝10；p0.0001)，并且所述adc可与贝伐单抗组合以获得改善的功效(n＝8-10；p0.031)。观察到特异性adc对比非特异性adc的显著更好的功效。小鼠的药代动力学表明mab对比adc的约25％更长的半衰期，但对肿瘤摄取的影响最小。兔中的耐受性研究表明，noael是作为两个剂量给与的40-60mg/kg的人类等效剂量。
结论：临床前数据表明这种adc的优异治疗窗口，其似乎转化为迄今为止的临床经验。还指示了组合疗法的潜力。
实施例3.抗trop-2-sn-38抗体-药物缀合物的产生和使用
如美国专利号7,238,785中所描述产生人源化rs7(hrs7)抗trop-2抗体，所述专利的附图和实施例部分以引用的方式并入本文。根据美国专利7,999,083(其实施例10和12以引用的方式并入本文)产生附接至cl2a接头的sn-38并与hrs7(抗trop-2)、hpam4(抗muc5ac)、ha20(抗cd20)或hmn-14(抗ceacam5)抗体缀合。缀合方案使得每个抗体分子附接约6个sn-38分子的比例。
将携带皮下人胰腺或结肠肿瘤异种移植物的免疫受损的无胸腺裸鼠(雌性)用特异性cl2a-sn-38缀合物或对照缀合物进行处理或不进行处理。观察特异性缀合物的治疗功效。图1示出capan1胰腺肿瘤模型，其中hrs7(抗trop-2)、hpam4(抗muc-5ac)和hmn-14(抗ceacam5)抗体的特异性cl2a-sn-38缀合物显示出比对照ha20-cl2a-sn-38缀合物(抗cd20)和未处理的对照更好的功效。类似地，在人胰腺癌的bxpc3模型中，特异性hrs7-cl2a-sn-38显示出比对照处理更好的治疗功效(图2)。
实施例4.抗trop-2-sn-38adc针对各种上皮癌的体内功效
摘要
此研究的目的是评价sn-38-抗trop-2(hrs7)adc针对几种人实体瘤类型的功效，并且评估其在小鼠和猴中的耐受性，后者与人相似，具有hrs7的组织交叉反应性。将两种sn-38衍生物cl2-sn-38和cl2a-sn-38与抗trop-2-人源化抗体hrs7缀合。将所述adc在体外针对稳定性、结合和细胞毒性进行了表征。在表达trop-2抗原的五种不同的人实体瘤-异种移植物模型中测试功效。在小鼠和食蟹猴中评估毒性。
两种sn-38衍生物的hrs7缀合物在药物替代(约6)、细胞结合(kd约1.2nmol/l)、细胞毒性(ic50约2.2nmol/l)、体外血清稳定性(t/1/2约20个小时)方面是等效的。将细胞暴露于adc展示出导致parp裂解的信号传导途径，但注意到在p53和p21上调中对比游离sn-38的差异。当与非靶向对照adc相比时，hrs7-sn-38在无毒剂量下在携带calu(p≤0.05)、capan-1(p0.018)、bxpc-3(p0.005)和colo205肿瘤(p0.033)的小鼠中产生显著抗肿瘤作用。小鼠耐受2×12mg/kg的剂量(sn-38当量)，仅具有alt和ast肝酶水平的短暂升高。输注2×0.96mg/kg的食蟹猴仅表现出血细胞计数的瞬时下降，但重要的是，所述值不会低于正常范围。
总之，抗trop-2hrs7-cl2a-sn-38adc针对一系列人实体瘤类型提供了显著且特异性的抗肿瘤作用。它在临床相关剂量下，在猴中良好耐受，其中组织trop-2表达与人相似。
引言
对实体瘤患者的成功伊立替康治疗受到限制，这在很大程度上是由于cpt-11前药转化为活性sn-38代谢物的转化率低。其他人已经检查了非靶向形式的sn-38，作为绕过这种转化需求并将sn-38被动地递送至肿瘤的手段。将sn-38与人源化抗trop-2抗体hrs7共价缀合。这种抗体-药物缀合物在一系列皮下人癌症异种移植物模型(包括非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌和鳞状细胞肺癌)中具有特异性抗肿瘤作用，全部在无毒剂量下(例如，≤3.2mg/kg累积sn-38当量剂量)。trop-2在许多上皮癌中广泛表达，但也在一些正常组织中表达，并且因此在食蟹猴中进行剂量递增研究以评估这种缀合物的临床安全性。猴耐受24mgsn-38当量/kg，只有轻微的、可逆的毒性。鉴于其肿瘤靶向和安全性概况，hrs7-sn-38在对伊立替康有反应的实体瘤的管理方面提供显著改善。
材料和方法
细胞系、抗体和化学治疗剂-本研究中使用的所有人癌细胞系均购自美国典型培养物保藏中心。这些包括calu-3(非小细胞肺癌)、sk-mes-1(鳞状细胞肺癌)、colo205(结肠腺癌)、capan-1和bxpc-3(胰腺癌)和pc-3(前列腺腺癌)。在immunomedics,inc.制备人源化rs7igg和对照人源化抗cd20(ha20igg，维妥珠单抗)和抗cd22(hll2igg，依帕珠单抗)抗体。伊立替康(20mg/ml)从hospira,inc.获得。
sn-38adc和体外方面-先前已经描述了cl2-sn-38的合成(moon等人,2008,jmedchem51:6916-26)。如所述(moon等人,2008,jmedchem51:6916-26；govindan等人,2009,clinchemres15:6052-61)进行其与hrs7igg的缀合和血清稳定性。如前述实施例中所述进行cl2a-sn-38(m.w.1480)及其hrs7缀合物的制备，以及稳定性、结合和细胞毒性研究。
体内治疗研究-对于所有动物研究，sn-38adc和伊立替康的剂量以sn-38当量显示。基于6的平均sn-38/igg替代比，至20-g小鼠的500μgadc的剂量(25mg/kg)含有0.4mg/kg的sn-38。伊立替康剂量同样显示为sn-38当量(即，40mg伊立替康/kg相当于24mg/kg的sn-38)。
4至8周龄的ncr雌性无胸腺裸鼠(nu/nu)和10周龄的雄性swiss-webster小鼠购自taconicfarms。由snblusa,ltd在食蟹猴(食蟹猕猴(macacafascicularis)；2.5–4kg雄性和雌性)中进行耐受性研究。
用不同的人癌细胞系皮下植入动物。肿瘤体积(tv)通过使用卡尺在二维空间测量来确定，并且体积定义为：l×w2/2，其中l是肿瘤的最长尺寸并且w是最短的。当治疗开始时，肿瘤的大小范围在0.10与0.47cm3之间。每个实验中的处理方案、剂量和动物数目描述于结果中。将冻干的hrs7-cl2a-sn-38和对照adc重构并根据需要在无菌盐水中稀释。除伊立替康(其静脉内施用)外，所有试剂均腹膜内施用(0.1ml)。给药方案受到之前调查的影响，其中adc每4天或每周两次给与持续不同时间长度(moon等人,2008,jmedchem51:6916-26；govindan等人,2009,clinchemres15:6052-61)。这种给药频率反映了缀合物的体外血清半衰期的考虑，以允许更连续地暴露于adc。
统计数据-生长曲线显示为初始tv随时间推移的变化百分比。肿瘤生长的统计分析是基于曲线下面积(auc)。通过线性曲线建模获得个体肿瘤生长的概况。f检验用于在生长曲线的统计分析之前确定组之间的方差齐性。双尾t检验用于评估各种处理组与对照之间的统计显著性，除了盐水对照，其中使用单尾t检验(显著性在p≤0.05)。auc的统计学比较仅进行直至组内第一只动物由于进展而被安乐死的时间。
药代动力学和生物分布-将111in放射性标记的hrs7-cl2a-sn-38和hrs7igg注射到携带皮下sk-mes-1肿瘤(约0.3cm3)的裸鼠中。将一组静脉内注射20μci(250-μg蛋白质)的111in-hrs7-cl2a-sn-38，而另一组接受20μci(250-μg蛋白质)的111in-hrs7igg。在不同的时间点，将小鼠(每个时间点5只)麻醉，经由心脏内穿刺术放血，且然后实施安乐死。取出肿瘤和各种组织，称重并通过γ闪烁计数以确定每克组织的注射剂量百分比(％id/g)。第三组在施用111in-hrs7-cl2a-sn-38之前3天注射250μg未标记的hrs7-cl2a-sn-38且同样进行了尸检。双尾t检验用于在使用f检验确定方差齐性之后比较hrs7-cl2a-sn-38和hrs7igg摄取。使用winnonlin软件(parsightcorp.)进行关于血液清除的药代动力学分析。
在swiss-webster小鼠和食蟹猴中的耐受性-简言之，将小鼠分成4组，每组在第0天和第3天接受2-ml腹膜内注射乙酸钠缓冲液对照或3种不同剂量的hrs7-cl2a-sn-38(4、8或12mg/kgsn-38)，然后进行血液和血清收集，如结果中所述。向食蟹猴(3只雄性和3只雌性；2.5-4.0kg)施用2种不同剂量的hrs7-cl2a-sn-38。结果中描述了被取血以用于评价可能的血液学毒性和血清化学的猴的剂量、时间和数量。
结果
hrs7-cl2a-sn-38的稳定性和效力-使用两种不同的键联来将sn-38缀合至hrs7igg(图3a)。第一种称为cl2-sn-38，并且先前已有描述(moon等人,2008,jmedchem51:6916-26；govindan等人,2009,clinchemres15:6052-61)。使用cl2合成的变化来除去接头内的苯丙氨酸部分来产生cl2a接头。这种变化简化了合成，但不影响缀合结果(例如，cl2-sn-38和cl2a-sn-38两者均每个igg分子并入约6个sn-38)。并排比较发现血清稳定性、抗原结合或体外细胞毒性无显著差异。这一结果是令人惊讶的，因为cl2中的苯丙氨酸残基是组织蛋白酶b(一种溶酶体蛋白酶)的设计的裂解位点的一部分。
为了确认sn-38接头从cl2至cl2a的变化不会影响体内效力，在携带colo205(图3b)或capan-1肿瘤(图3c)的小鼠中分别使用每周两次×4周的0.4mg或0.2mg/kgsn-38对hrs7-cl2a和hrs7-cl2-sn-38进行了比较，并且在两项研究中起始肿瘤大小均为0.25cm3。与未处理(在colo205模型中对比盐水auc14天p0.002；在capan-1模型中对比盐水auc21天p0.001)和非靶向抗cd20对照adc，ha20-cl2a-sn-38(在colo-205模型中auc14天p0.003；在capan-1模型中auc35天：p0.002)的相比，hrs7-cl2a和cl2-sn-38缀合物两者均显著抑制肿瘤生长。在capan-1模型中研究结束时(第140天)，50％的用hrs7-cl2a-sn-38处理的小鼠和40％的hrs7-cl2-sn-38小鼠无肿瘤，而只有20％的ha20-adc处理的动物没有明显疾病迹象。如图3所示，与cl2相比，cl2a接头产生稍微更高的功效。
作用机制-体外细胞毒性研究证明hrs7-cl2a-sn-38针对几种不同的实体瘤系具有在nmol/l范围内的ic50值(表2)。游离sn-38情况下的ic50在所有细胞系中低于缀合物。尽管trop-2表达与对hrs7-cl2a-sn-38的敏感性之间没有明显相关性，但adc对比游离sn-38的ic50比率在较高trop-2表达细胞中较低，最可能反映出当存在更多抗原时内化药物的能力增强。
已知sn-38活化细胞中的若干信号传导途径，从而导致细胞凋亡(cusack等人,2001,cancerres61:3535-40；liu等人2009,cancerlett274:47-53；lagadec等人,2008,brjcancer98:335-44)。初始研究在体外检查了参与早期信号传导事件和1个晚期凋亡事件[聚-adp-核糖聚合酶(parp)的裂解)]的2种蛋白质(p21waf1/cip1和p53)的表达(未示出)。在bxpc-3中，sn-38导致p21waf1/cip1表达增加20倍(未示出)，而hrs7-cl2a-sn-38仅产生10倍增加(未示出)，这一发现与此细胞系中游离sn-38情况下的较高活性一致(表2)。然而，hrs7-cl2a-sn-38使calu-3中的p21waf1/cip1表达相对于游离sn-38增加超过2倍(未示出)。
在p53表达中观察到hrs7-cl2a-sn-38-与游离sn-38介导的信号传导事件之间的更大差异(未示出)。在bxpc-3和calu-3中，在游离sn-38情况下p53的上调直到48小时才明显，而hrs7-cl2a-sn-38在24小时内上调p53(未示出)。另外，与sn-38相比，暴露于adc的细胞中的p53表达在两种细胞系中均更高(未示出)。令人感兴趣的是，尽管hrs7igg对p21waf1/cip1表达没有明显影响，但它确实诱导bxpc-3和calu-3两者中p53的上调，但仅在暴露48小时后(未示出)。就后来的细胞凋亡事件而言，当与sn-38或缀合物一起孵育时，parp的裂解在两种细胞系中都是明显的(未示出)。裂解的parp的存在在bxpc-3中24小时较高(未示出)，这与p21的高表达及其较低的ic50相关。与adc相比，游离sn-38情况下的更高裂解程度与细胞毒性结果一致。
hrs7-sn-38的功效-由于trop-2在若干人癌症中广泛表达，因此在若干不同的人癌症模型中进行了研究，所述模型使用hrs7-cl2-sn-38键联开始，但稍后使用了具有cl2a键联的缀合物。与施用等量非靶向hll2-cl2-sn-38的动物相比，每4天×4给与0.04mgsn-38/kghrs7-cl2-sn-38的携带calu-3的裸鼠具有显著改善的反应(相应地tv＝0.14±0.22cm3对比0.80±0.91cm3；auc42天p0.026；图4a)。当剂量增加至0.4mg/kgsn-38时，观察到剂量反应(图4a)。在这种较高剂量水平下，给与特异性hrs7缀合物的所有小鼠在28天内“治愈”，并且在第147天保持无肿瘤直至研究结束，而肿瘤在用不相关的adc处理的动物中重新生长(特异性对比不相关的auc98天：p＝0.05)。在接受hrs7igg和sn-38的混合物的小鼠中，到第56天肿瘤进展>4.5倍(tv＝1.10±0.88cm3；对比hrs7-cl2-sn-38auc56天p0.006)(图4a)。
还在人结肠(colo205)和胰腺(capan-1)肿瘤异种移植物中检查了功效。在携带colo205肿瘤的动物中(图4b)，与对照抗cd20adc(ha20-cl2-sn-38)或hrs7igg相比，hrs7-cl2-sn-38(0.4mg/kg，q4dx8)在28天处理期内阻止肿瘤生长，肿瘤显著更小(tv分别＝0.16±0.09cm3、1.19±0.59cm3和1.77±0.93cm3；auc28天p0.016)。
表2.在各种实体瘤系中sn-38和hrs7-sn-38的trop-2表达和体外细胞毒性
伊立替康(24mgsn-38/kg，q2dx5)的mtd在colo205细胞中与hrs7-cl2-sn-38一样有效，因为小鼠血清可比人血清更有效地将伊立替康转化为sn-38(morton等人,2000,cancerres60:4206-10)，但伊立替康中的sn-38剂量(2,400μg累积)比在缀合物(总计64μg)情况下高37.5倍。
当以等效于hrs7-cl2-sn-38缀合物的sn-38剂量给与时，携带capan-1的动物(图4c)对单独伊立替康未显示显著反应(例如，在第35天，在给与0.4mgsn-38/kghrs7-sn-38的动物中平均肿瘤大小是0.04±0.05cm3，对比在给与0.4mg/kgsn-38的伊立替康处理的动物中1.78±0.62cm3；auc第35天p0.001；图4c)。当伊立替康剂量增加10倍至4mg/kgsn-38时，反应得到改善，但仍不如0.4mg/kgsn-38剂量水平的缀合物显著(tv＝0.17±0.18cm3对比1.69±0.47cm3，auc第49天p0.001)(图4c)。与伊立替康处理的动物相比，相等剂量的非靶向ha20-cl2-sn-38也具有显著抗肿瘤作用，但特异性hrs7缀合物显著优于不相关的adc(tv＝0.17±0.18cm3对比0.80±0.68cm3，auc第49天p0.018)(图4c)。
然后将使用hrs7-cl2a-sn-38adc的研究扩展至2种其他人上皮癌模型。在携带bxpc-3人胰腺肿瘤的小鼠中图4d)，与用盐水或等量非靶向ha20-cl2a-sn-38处理的对照小鼠(相应地tv＝0.24±0.11cm3对比1.17±0.45cm3和1.05±0.73cm3；auc第21天p0.001)或以高10倍的sn-38等效剂量给与的伊立替康(相应地tv＝0.27±0.18cm3对比0.90±0.62cm3；auc第25天p0.004)(图4d)相比，hrs7-cl2a-sn-38再次显著抑制肿瘤生长。令人感兴趣的是，在用0.4mg/kg的adc处理的携带sk-mes-1人鳞状细胞肺肿瘤的小鼠中(图4e)，肿瘤生长抑制优于盐水或未缀合的hrs7igg(相应地tv＝0.36±0.25cm3对比1.02±0.70cm3和1.30±1.08cm3；auc28天，p0.043)，但非靶向ha20-cl2a-sn-38或伊立替康的mtd提供与特异性hrs7-sn-38缀合物相同的抗肿瘤作用(图4e)。
在所有鼠类研究中，hrs7-sn-38adc在体重减轻方面良好地耐受(未示出)。
hrs7-cl2a-sn-38的生物分布-使用相应的111in标记的底物，在携带sk-mes-1人鳞状细胞肺癌异种移植物的小鼠中比较hrs7-cl2a-sn-38或未缀合的hrs7igg的生物分布(未示出)。进行药代动力学分析以确定hrs7-cl2a-sn-38相对于未缀合的hrs7的清除率(未示出)。adc比等量的未缀合的hrs7更快地清除，其中adc表现出短约40％的半衰期和平均停留时间。尽管如此，这对肿瘤摄取具有最小影响(未示出)。虽然在24小时和48小时时间点存在显著差异，但到72小时(峰值摄取)，肿瘤中两种剂的量相似。在正常组织中，肝和脾差异最显著(未示出)。在注射后24小时，在肝脏中hrs7-cl2a-sn-38比hrs7igg多>2倍(未示出)。相反，在脾脏中，在峰值摄取(48小时时间点)处存在比hrs7-cl2a-sn-38多3倍的亲本hrs7igg(未示出)。剩余组织中的摄取和清除通常反映血液浓度的差异(未示出)。
因为给与治疗的每周两次剂量，所以检查了在注射111in标记的抗体之前3天首先接受0.2mg/kg(250μg蛋白质)预剂量的hrs7adc的一组动物中的肿瘤摄取。与未接受预剂量的动物相比，预先给药的小鼠中的111in-hrs7-cl2a-sn-38在每个时间点显著降低(例如，在72小时，预先给药的肿瘤摄取是12.5％±3.8％id/g，对比在未给与预剂量的动物中25.4％±8.1％id/g；p＝0.0123；未示出)。预给药对血液清除或组织摄取没有明显影响(未示出)。这些研究表明，在一些肿瘤模型中，特异性抗体的肿瘤增积可通过一个或多个前面的剂量减少，这可能解释了治疗反应的特异性可随着adc剂量增加而减少的原因以及未指示进一步剂量递增的原因。
hrs7-cl2a-sn-38在swiss-webster小鼠和食蟹猴中的耐受性swiss-webster小鼠在3天内耐受2个剂量，4、8和12mgsn-38/kg的hrs7-cl2a-sn-38中的每一个，具有最小的瞬时体重减轻(未示出)。未发生造血毒性，并且血清化学仅揭示升高的天冬氨酸转氨酶(ast，图5a)和丙氨酸转氨酶(alt，图5b)。在处理后七天，所有3个处理组中的ast均升至正常水平(>298u/l)(图5a)，最大比例的小鼠处于2×8mg/kg组中。然而，到处理后15天，大多数动物都在正常范围内。在处理的7天内alt水平也高于正常范围(>77u/l)(图5b)并且到第15天具有正常化的证据。来自所有这些小鼠的肝脏未显示组织损伤的组织学证据(未示出)。就肾功能而言，仅葡萄糖和氯化物水平在处理组中略微升高。在2×8mg/kg下，7只小鼠中的5只具有略微升高的葡萄糖水平(273–320mg/dl的范围，正常上限263mg/dl)，其到注射后15天恢复正常。类似地，氯化物水平略有升高，在2个最高剂量组中在116至127mmol/l的范围内(正常范围上限115mmol/l)(在2×8mg/kg组中57％，并且在2×12mg/kg组中100％)，并在注射后保持升高至15天。这也可指示胃肠毒性，因为大多数氯化物是通过肠道吸收获得的；然而，在终止时，在所检查的任何器官系统中不存在组织损伤的组织学证据(未示出)。
因为小鼠不表达由hrs7鉴定的trop-2，所以需要更合适的模型来确定hrs7缀合物用于临床用途的潜力。免疫组织学研究揭示人和食蟹猴中的多种组织中的结合(乳腺、眼、胃肠道、肾、肺、卵巢、输卵管、胰腺、甲状旁腺、前列腺、唾液腺、皮肤、胸腺、甲状腺、扁桃体、输尿管、膀胱和子宫；未示出)。基于这种交叉反应性，在猴中进行耐受性研究。
接受2×0.96mgsn-38/kg的hrs7-cl2a-sn-38的组在输注后和直到研究结束没有显著临床事件。体重减轻不超过7.3％，并且到第15天恢复至适应重量。在大多数血细胞计数数据中注意到短暂下降(嗜中性粒细胞和血小板数据显示在图5c和图5d中)，但值未下降到正常范围以下。在血清化学中未发现异常值。在第11天(最后一次注射后8天)尸检的动物的组织病理学显示造血器官(胸腺、下颌和肠系膜淋巴结、脾和骨髓)、胃肠器官(胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠)、女性生殖器官(卵巢、子宫和阴道)中以及注射部位处的微观变化。这些变化在从最小至中等的范围内，并且在所有组织中在恢复期(第32天)结束时完全逆转，除了在胸腺和胃肠道中之外，其在此后的时间点趋向于完全恢复(未示出)。
在缀合物的2×1.92mgsn-38/kg剂量水平下，存在1例因胃肠道并发症和骨髓抑制引起的死亡，并且此组中的其他动物显示出与2×0.96mg/kg组相似但更严重的不良事件(未示出)。这些数据表明剂量限制毒性与伊立替康相同；即肠道和血液学。因此，hrs7-cl2a-sn-38的mtd介于2×0.96与1.92mgsn-38/kg之间，其代表2×0.3至0.6mg/kgsn-38的人等效剂量。
论述
trop-2是在许多上皮肿瘤(包括肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌和卵巢癌)上表达的蛋白质，从而使其成为递送细胞毒性剂的潜在重要靶标(ohmachi等人,2006,clincancerres12:3057-63；fong等人,2008,brjcancer99:1290-95；cubas等人,2009,biochimbiophysacta1796:309-14)。当与trop-2结合时，rs7抗体内化(shih等人,1995,cancerres55:5857s-63s)，其能够直接细胞内递送细胞毒素。
sn-38是有效的拓扑异构酶-i抑制剂，在几种细胞系中具有在纳摩尔范围内的ic50值。它是用于治疗结肠直肠癌并且还在肺癌、乳腺癌和脑癌中具有活性的前药伊立替康的活性形式。推断呈adc的形式的直接靶向的sn-38将通过克服后者的低和患者可变的生物转化为活性sn-38而相对于cpt-11显著改善治疗(mathijssen等人,2001,clincancerres7:2182-94)。
插入原始cl2衍生物中的phe-lys肽允许经由组织蛋白酶b裂解。为了简化合成过程，在cl2a中消除了苯丙氨酸，且因此除去了组织蛋白酶b裂解位点。令人感兴趣的是，与用cl2获得的宽概况相比，这种产物具有更好定义的色谱概况(未示出)，但更重要的是，这种改变对并排测试中缀合物的结合、稳定性或效力没有影响。这些数据表明cl2中的sn-38主要通过在ph敏感的碳酸苄酯键处裂解成sn-38的内酯环而不是组织蛋白酶b裂解位点而从缀合物释放。
hrs7adc针对一系列实体瘤细胞系的体外细胞毒性始终具有在nmol/l范围内的ic50值。然而，暴露于游离sn-38的细胞表现出与adc相比较低的ic50值。还报告了enz-2208(sapra等人,2008,clincancerres14:1888-96；zhao等人,2008,bioconjugchem19:849-59)和nk012(koizumi等人,2006,cancerres66:10048-56)的游离与缀合的sn-38之间的这种差异。enz-2208利用支化peg连接每个peg约3.5至4个sn-38分子，而nk012是含有20重量％sn-38的胶束纳米颗粒。使用我们的adc，随着trop-2表达水平在肿瘤细胞中增加，这种差异(即，游离对比缀合的sn-38的效力比)降低，从而表明靶向递送药物的优点。就体外血清稳定性而言，hrs7-sn-38的cl2和cl2a-sn-38形式产生约20个小时的t/1/2，这与对于enz-2208报告的12.3分钟的短t/1/2形成对比(zhao等人,2008,bioconjugchem19:849-59)，但是与24小时后在生理条件下从nk01257％释放sn-38相似(koizumi等人,2006,cancerres66:10048-56)。
用hrs7-sn-38(cl2-sn-38或cl2a-sn-38)处理携带肿瘤的小鼠显著抑制5种不同肿瘤模型中的肿瘤生长。在其中4个中，观察到肿瘤消退，并且在calu-3的情况下，所有接受最高剂量的hrs7-sn-38的小鼠在研究结束时是无肿瘤的。与人不同，伊立替康通过小鼠中的血浆酯酶非常有效地转化为sn-38，具有大于50％转化率，并且在小鼠中比在人中产生更高的效力(morton等人,2000,cancerres60:4206-10；furman等人,1999,jclinoncol17:1815-24)。当伊立替康以高10倍或等效sn-38水平施用时，hrs7-sn-38在控制肿瘤生长方面显著更好。只有当伊立替康以24mg/kgq2dx5(多37.5倍的sn-38)的其mtd施用时，它才与hrs7-sn-38的有效性相当。在患者中，我们期望这种优势更有利于hrs7-cl2a-sn-38，因为伊立替康的生物转化将大大降低。
还在一些抗原表达细胞系(如sk-mes-1)中显示，使用抗原结合adc不能保证比非结合的不相关的缀合物更好的治疗反应。这不是不寻常或出人意料的发现。实际上，当与伊立替康相比时，前面提到的非结合sn-38缀合物增强治疗活性，并且因此预期不相关的igg-sn-38缀合物具有一些活性。这与肿瘤具有不成熟的渗漏血管的事实有关，所述血管允许大分子比正常组织更好地通过(jain,1994,sciam271:58-61)。使用我们的缀合物，50％的sn-38将在约13小时内释放，此时ph降低至模拟溶酶体水平的水平(例如，在37℃下ph5.3；数据未示出)，而在血清的中性ph下，释放速率降低近2倍。如果不相关的缀合物进入酸性肿瘤微环境，则预期局部释放一些sn-38。其他因素，如肿瘤生理学和对药物的先天敏感性，也将在定义这种“基线”活性中发挥作用。然而，只要存在足够的抗原来捕获特异性抗体，具有较长停留时间的特异性缀合物应该具有相对于这种基线反应增强的效力。sk-mes-1模型中的生物分布研究还表明，如果肿瘤抗原由于连续给药而变得饱和，则特异性缀合物的肿瘤摄取减少，这产生类似于用不相关的缀合物发现的治疗结果。
尽管我们的adc与其他sn-38递送剂的已公开报告之间进行直接比较具有挑战性，但可进行一些一般性观察。在我们的治疗研究中，最高个体剂量是0.4mg/kg的sn-38。在calu-3模型中，在20g小鼠中仅给予4次注射，总累积剂量为1.6mg/kgsn-38或32μgsn-38。使用其10mg/kg×5的mtd进行enz-2208的多项研究(sapra等人,2008,clincancerres14:1888-96；pastorini等人,2010,clincancerres16:4809-21)，并且用nk012进行的临床前研究涉及其30mg/kg×3的mtd(koizumi等人,2006,cancerres66:10048-56)。因此，使用hrs7-sn-38以分别比enz-2208和nk012中报告的剂量少30倍和55倍的sn-38当量获得显著抗肿瘤作用。即使hrs7adc(0.04mg/kg)少10倍，也观察到显著抗肿瘤作用，而较低剂量的enz-2208未呈现，并且当nk012剂量降低4倍至7.5mg/kg时，效力丧失(koizumi等人,2006,cancerres66:10048-56)。正常小鼠未显示急性毒性，累积剂量超过1周24mg/kgsn-38(1,500mg/kg缀合物)，从而表明mtd更高。因此，用7.5至15倍低量的sn-38当量有效地处理携带肿瘤的动物。
生物分布研究揭示hrs7-cl2a-sn-38具有与亲本hrs7igg相似的肿瘤摄取，但是在肝脏摄取高2倍的情况下清除显著更快，这可能是由于sn-38的疏水性。随着adc通过肝脏清除，预期肝脏和胃肠道毒性将是剂量限制性的。尽管小鼠具有肝转氨酶升高的证据，但胃肠道毒性最好是轻微的，只有短暂的体重减轻，并且在组织病理学检查时未注意到异常。令人感兴趣的是，未注意到血液学毒性。然而，猴显示出与针对伊立替康所预期相同的毒性概况，其中胃肠道和血液学毒性是剂量限制性的。
因为由hrs7识别的trop-2不在小鼠中表达，所以在具有与人类相似的trop-2组织表达的猴中进行毒性研究是重要的。耐受0.96mg/kg/剂量(约12mg/m2)的猴具有轻微和可逆的毒性，其外推为约0.3mg/kg/剂量(约11mg/m2)的人剂量。在nk012的i期临床试验中，实体瘤患者耐受每3周一次28mg/m2的sn-38，具有4级嗜中性粒细胞减少症作为剂量限制性毒性(dlt；hamaguchi等人,2010,clincancerres16:5058-66)。类似地，使用enz-2208的i期临床试验揭示剂量限制性发热性嗜中性粒细胞减少症，建议施用10mg/m2每3周或16mg/m2(如果向患者施用g-csf)(kurzrock等人,aacr-nci-eortcinternationalconferenceonmoleculartargetsandcancertherapeutics；2009年11月15–19日；boston,ma；posternoc216；patnaik等人,aacr-nci-eortcinternationalconferenceonmoleculartargetsandcancertherapeutics；2009年11月15–19日；boston,ma；posternoc221)。因为猴耐受22mg/m2的累积人等效剂量，所以似乎即使hrs7与许多正常组织结合，但单次hrs7adc处理的mtd可能与其他非靶向sn-38剂相似。实际上，抗trop-2抗体的特异性似乎在定义dlt中不起作用，因为毒性概况与伊立替康相似。更重要的是，如果可如在用刚好0.03mgsn-38当量/kg/剂量的人等效剂量响应的小鼠中那样在人中实现抗肿瘤活性，那么可在临床上实现显著抗肿瘤反应。
总之，猴中的毒理学研究与小鼠中的体内人癌症异种移植物模型组合已经表明，这种靶向trop-2的adc在若干不同上皮起源的肿瘤中是有效的治疗剂。
实施例5.包含hrs7和紫杉醇的抗trop-2adc
通过将紫杉醇
hrs7-紫杉醇adc在mda-mb-468乳腺细胞系中表现出细胞毒活性(图6)，其中ic50值比hrs7-sn-38高大约4.5倍。游离紫杉醇比游离sn-38更有效(图6)。而游离sn-38的ic50为1.54x10-9m，游离紫杉醇的ic50小于6.1x10-11m。对于bxpc-3胰腺细胞系获得类似的结果(图7)，其中hrs7-紫杉醇adc具有比hrs7-sn-38adc高大约2.8倍的ic50值。这些结果表明抗trop-2缀合的紫杉醇的体外功效，ic50值在纳摩尔范围内，类似于hrs7-sn-38adc。
实施例6.抗trop-2抗体的细胞结合测定
获得针对人trop-2的两种不同鼠单克隆抗体用于adc缀合。从滚瓶中生长的杂交瘤(atcc,hb-187)纯化第一抗体162-46.2。第二抗体mab650购自r&dsystems(minneapolis,mn)。对于结合的比较，trop-2阳性人胃癌nci-n87用作靶标。在结合测定前一天，将细胞(1.5×105/孔)接种到96孔板中。第二天早上，使用162-46.2、mab650和鼠rs7(0.03至66nm)生成剂量/反应曲线。将这些第一抗体在4℃下与细胞一起孵育1.5小时。冲洗孔，并且在4℃下将抗小鼠hrp第二抗体添加至所有孔持续1小时。再次洗涤孔，然后添加发光底物。使用envision板阅读器读取板，并且值被报告为相对发光单位。
全部三种抗体具有类似的kd值，对于rs7为0.57nm，对于162-46.2为0.52nm并且对于mab650为0.49nm。然而，当比较162-46.2和mab650与rs7的最大结合(bmax)时，它们分别减少25％和50％(bmax对于rs7为11,250，对于162-46.2为8,471并且对于mab650为6,018)，从而表明与rs7相比具有不同的结合性质。
实施例7.抗trop-2adc(mab650-sn-38)的细胞毒性
用sn-38和mab650制备新颖的抗trop-2adc，从而产生6.89的平均药物与抗体替代比。使用两种不同的人胰腺癌细胞系(bxpc-3和capan-1)和人三阴性乳腺癌细胞系(mda-mb-468)作为靶标进行细胞毒性测定以比较mab650-sn-38和hrs7-sn-38adc。
在添加adc之前一天，从组织培养物收获细胞并接种到96孔板中。在第二天将细胞以3.84x10-12至2.5x10-7m的药物范围暴露于hrs7-sn-38、mab650-sn-38和游离sn-38。未缀合的mab650用作与mab650-sn-38蛋白质等效剂量下的对照。将板在37℃下孵育96小时。在此孵育期后，将mts底物添加至所有板，并以半小时间隔读取显色直至对于未处理的细胞达到大约1.0的od492nm。使用microsoftexcel和prism软件作为相对于未处理细胞的生长百分比测量生长抑制(非线性回归以产生s形剂量反应曲线，其产生ic50值。
如图8所示，hrs7-sn-38和mab650-sn-38具有相似的生长抑制作用，其中ic50值在低nm范围内，这对于这些细胞系中的sn-38-adc是典型的。在人capan-1胰腺癌细胞系中(图8a)，与mab650-sn-38adc的4.1nm和游离sn-38的1.0nm相比，hrs7-sn-38adc显示3.5nm的ic50。在人bxpc-3胰腺癌细胞系中(图8b)，与mab650-sn-38adc的3.0nm和游离sn-38的1.0nm相比，hrs7-sn-38adc显示2.6nm的ic50。在人nci-n87胃腺癌细胞系中(图8c)，与mab650-sn-38adc的4.1nm和游离sn-38的4.3nm相比，hrs7-sn-38adc显示3.6nm的ic50。
总之，在这些体外测定中，两种抗trop-2抗体hrs7和mab650的sn-38缀合物显示出针对几种肿瘤细胞系的相同功效，这与游离sn-38的功效相似。因为抗trop-2抗体的靶向功能在体内将是比在体外更重要的因素，所以数据支持抗trop-2-sn-38adc作为将在体内非常有效的一类，如上述实施例中针对hrs7-sn-38所证明的。
实施例8.抗trop-2adc(162-46.2-sn-38)的细胞毒性
用sn-38和162-46.2制备新颖的抗trop-2adc，从而产生6.14的药物与抗体替代比。使用两种不同的trop-2阳性细胞系(bxpc-3人胰腺癌和mda-mb-468人三阴性乳腺癌)作为靶标进行细胞毒性测定以比较162-46.2-sn-38和hrs7-sn-38adc。
在添加adc之前一天，从组织培养物收获细胞，并以每孔2000个细胞接种到96孔板中。在第二天将细胞以3.84x10-12至2.5x10-7m的药物范围暴露于hrs7-sn-38、162-46.2-sn-38或游离sn-38。未缀合的162-46.2和hrs7分别用作与162-46.2-sn-38和hrs7-sn-38相同的蛋白质等效剂量下的对照。将板在37℃下孵育96小时。在此孵育期后，将mts底物添加至所有板，并以半小时间隔读取显色，直至未处理的对照孔具有大约1.0的od492nm读数。使用microsoftexcel和prism软件作为相对于未处理细胞的生长百分比测量生长抑制(非线性回归以产生s形剂量反应曲线，其产生ic50值)。
如图9a和图9b所示，当与hrs7-sn-38相比时，162-46.2-sn-38adc具有相似的ic50值。当针对bxpc-3人胰腺癌细胞系进行测试时(图9a)，与162-46.2-sn-38的10.6nm和游离sn-38的1.6nm相比，hrs7-sn-38具有5.8nm的ic50。当针对mda-mb-468人乳腺癌细胞系进行测试时(图9b)，与162-46.2-sn-38的6.1nm和游离sn-38的0.8nm相比，hrs7-sn-38具有3.9nm的ic50。单独游离抗体对任一trop-2阳性癌细胞系显示很小的细胞毒性。
总之，比较与相同的细胞毒性药物缀合的三种不同抗trop-2抗体的体外功效，所有三种adc针对多种trop-2阳性癌细胞系都表现出等效的细胞毒性作用。这些数据支持并入药物缀合的adc中的一类抗trop-2抗体是表达trop-2的实体瘤的有效抗癌治疗剂。
实施例9.使用包含缀合至sn-38的hrs7抗体的immu-132抗trop-2adc进行临床试验
概述
本实施例报告来自i期临床试验和正在进行的immu-132的ii期扩展的结果，immu-132是通过ph敏感接头缀合至sn-38的内化人源化hrs7抗trop-2抗体的adc(平均药物-抗体比率＝7.6)。trop-2是由许多人癌症以高密度(约1×105)、频率和特异性表达的i型跨膜钙转导蛋白，而正常组织表达有限。携带capan-1人胰腺肿瘤异种移植物的裸小鼠的临床前研究揭示，immu-132能够将比来源于最大耐受的伊立替康疗法多120倍的sn-38递送至肿瘤。
本实施例报告了多次先前疗法治疗失败的25名患者的初始i期试验(一些包括拓扑异构酶-i/ii抑制性药物)过程期间获得，并且正在进行的ii期扩展现在报告69名患者，包括结肠直肠癌(crc)、小细胞和非小细胞肺癌(分别为sclc、nsclc)、三阴性乳腺癌(tnbc)、胰腺癌(pdc)、食道癌和其他癌症。
如下文所详细讨论，血清中未检测到trop-2，但在大部分存档的肿瘤中强烈表达(≥2+)。在3+3试验设计中，在重复21天周期的第1天和第8天给与immu-132，以8mg/kg/剂量开始，然后12和18mg/kg，直到剂量限制性嗜中性粒细胞减少症。为优化最小延迟的累积处理，ii期集中于8和10mg/kg(n分别＝30和14)。此时在49名报告相关ae的患者中，28％中出现嗜中性粒细胞减少症≥g3(4％g4)。最初在这些患者中的最常见的非血液毒性是疲劳(55％；≥g3＝9％)、恶心(53％；≥g3＝0％)、痢疾(47％；≥g3＝9％)、脱发(40％)和呕吐(32％；≥g3＝2％)。在6名患者中发现纯合ugt1a1*28/*28，其中2名具有较严重的血液和胃肠毒性。在i期和扩展期中，目前有48名患者(不包括pdc)可根据recist/ct评估为最佳反应。七名(15％)患者具有部分应答(pr)，包括crc患者(n＝1)、tnbc患者(n＝2)、sclc患者(n＝2)、nsclc患者(n＝1)和食道癌患者(n＝1)，并且另外27名患者(56％)患有稳定的疾病(sd)，总共38名患者(79％)具有疾病应答；13名ct可评估的pdc患者中的8名(62％)患有sd，在他们最后一次先前治疗中，与8.0周相比，中值进展时间(ttp)为12.7周。剩余48名患者的ttp为12.6+周(6.0至51.4周的范围)。血浆cea和ca19-9与反应相关。尽管给药达数月，但未检测到抗hrs7或抗sn-38抗体。在3天内从血清清除缀合物，符合其中每天释放50％的sn-38的体内动物研究，血清中>95％的sn-38结合至非葡萄糖醛酸形式的igg，并且浓度比给与伊立替康的患者中报告的sn-38高100倍。这些结果显示，含有hrs7-sn-38的adc在转移性实体癌中具有治疗活性，具有可控制的痢疾和嗜中性粒细胞减少。
药代动力学
将两种elisa方法用于测量igg(使用抗hrs7个体基因型抗体捕获)和完整的缀合物(使用抗sn-38igg/具有抗hrs7个体基因型抗体的探针捕获)的清除。通过hplc测量sn-38。总immu-132级分(完整的缀合物)的清除比igg(未示出)更快，从而反映sn-38从缀合物的已知逐渐释放。sn-38(未结合和总体)的hplc测定显示出血清中>95％的sn-38结合至igg。低浓度的sn-38g暗示，结合至igg的sn-38受到保护，免于葡萄糖醛酸化。缀合物的elisa和sn-38hplc的比较揭示二者重叠，从而暗示elisa是用于监测sn-38清除的替代。
给药方案和患者池的总结提供于表3中。
表3.临床试验参数
临床试验状态
报告了总共69名各种转移性癌症患者(包括25名i期患者)，它们具有3次先前疗法的中值。八名患者在ct评估之前具有临床进展和撤除。十三名ct可评估的胰腺癌患者单独报告。pdc患者中的中值ttp(进展时间)是11.9周(2至21.4周的范围)，相比之下之前最后治疗的中值ttp为8周。
总共48名患有各种癌症的患者具有至少1次ct评估，由此确定最佳应答(图10)和进展时间(ttp；图11)。为了总结最佳应答数据，在8名可评估tnbc(三阴性乳腺癌)患者中，有2例pr(部分应答)、4例sd(稳定疾病)和2例pd(进行性疾病)，总计应答[pr+sd]为6/8(75％)。对于sclc(小细胞肺癌)，在4名可评估患者中，有2例pr、0例sd和2例pd，总计应答为2/4(50％)。对于crc(结肠直肠癌)，在18名可评估患者中，有1例pr、11例sd和6例pd，总计应答为12/18(67％)。对于食道癌，在4名可评估患者中，有1例pr、2例sd和1例pd，总计应答为3/4(75％)。对于nsclc(非小细胞肺癌)，在5名可评估患者中，有1例pr、3例sd和1例pd，总计应答为4/5(80％)。在所有治疗的患者内，在48名可评估患者中，有7例pr、27例sd和14例pd，总计应答为34/48(71％)。这些结果证明，抗trop-2adc(hrs7-sn-38)显示出针对一系列广泛的人患者实体瘤的显著临床功效。
所报告的治疗副作用(不良事件)总结于表4中。如从表4的数据显而易见，hrs7-sn-38的治疗功效以adc的剂量实现，显示可接受的低水平的不利副作用。
表4.
对抗trop-2adc的示例性部分应答通过ct数据(未示出)确认。作为crc的示例性pr，初诊为crc的62岁妇女经历初次半结肠切除。四个月后，由于肝脏转移她经历了肝脏切除，并接受7个月的folfox治疗和1个月的5fu。她出现多个病灶，主要位于肝脏中(通过免疫组织分析3+trop-2)在初始诊断后，以8mg/kg的起始剂量进入hrs7-sn-38试验约1年。在她首次ct评估时，实现pr，靶病灶减少37％(未示出)。患者继续治疗，在10个月治疗后实现最大减少65％(未示出)，cea从781ng/ml减少至26.5ng/ml，之后稍后进展3个月。
作为nsclc的示例性pr，65岁男性被诊断为iiib级nsclc(鳞状细胞癌)。碳铂/依托泊苷(3mo)以及7000cgyxrt的初始治疗使得应答持续10mo。然后除经历腰椎板切除术之外，他从tarceva维持治疗开始，继续直到他被考虑进入immu-132试验。他在5个月的tarceva之后接受第一剂量的immu-132，此时右肺出现5.6cm病灶以及大量胸膜腔积液。他在两个月后完成第6剂，此时首次ct显示主要目标病灶减小至3.2cm(未示出)。
作为sclc的示例性pr，65岁妇女被诊断为低分化sclc。在2个月之后终止的接受卡铂/依托泊苷(topo-ii抑制剂)后，无应答，然后是2个月之后终止的托泊替康(topo-i抑制剂)，也无应答，她接受1个月后终止的局部xrt(3000cgy)。然而，在接下来一个月内进展继续。患者下个月从immu-132开始(12mg/kg；减少至6.8mg/kg；trop-2表达3+)，并且在两个月的immu-132之后，靶病灶减少38％，包括主要肺病灶中出现大量减少(未示出)。在接受12个剂量之后，患者进展3个月。
这些结果的意义在于，它们显示抗trop-2adc是有效的，即使在多次先前治疗之后失效或进展的患者中也是如此。
总之，在所用的剂量下，主要毒性是可控制的嗜中性粒细胞减少症，3级毒性很少。immu-132显示了三阴性乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌和食道癌的复发/难治患者中活性(pr和持久性sd)的证据，包括具有拓扑异构酶-i抑制剂治疗的复发既往史的患者。这些结果示出抗trop-2adc在一系列广泛的耐受现有疗法的癌症中的功效。
实施例10.三阴性乳腺癌(tnbc)中immu-132的皮下施用
沙西妥珠单抗戈维替康(immu-132)adc如上文实施例中所述制备。用至少两种标准疗法治疗失败的患有三阴性乳腺癌的患者接受2至4mg/kg的沙西妥珠单抗戈维替康，每日给与持续1周、或每周3次持续2周、或每周两次持续2周，且然后停药。在诱导后每两到三周或每月静脉内或皮下施用维持剂量的adc。或者，可在以8-10mg/kg静脉内施用的二至四个周期发生诱导(每个周期，在两个21天周期的第1天和第8天施用adc，其间一周停药期)，然后作为每周一次或多次活性给药或作为维持疗法皮下施用。可基于中期肿瘤扫描和/或通过分析trop-2阳性循环肿瘤细胞来调整剂量。
在两个治疗周期后，在所有剂量水平和immu-132的施用方案中观察到目标应答，肿瘤体积平均减少35％。针对人抗hrs7抗体(haha)评价的所有血清样品均为阴性，并且在施用部位未观察到不利的局部反应。
实施例11.在转移性结肠癌中immu-130的皮下施用
患有左和右肝叶的转移性结肠癌(直径3-5cm)以及右肺的5cm转移以及130ng/ml的升高的血液cea值的52岁男性用以4mg/kg的剂量皮下施用的抗ceacam-5adcimmu-130(hmn-14-cl2a-sn-38)进行治疗，每周给与3次持续2周，然后停药，进行3个周期的药物施用。在治疗开始8周的ct评估后，测量到3个靶病灶的总平均直径减少25％，从而根据recist1.1标准构成良好的稳定疾病应答。随着他的嗜中性粒细胞减少症正常化，重复疗程继续。
实施例12.双功能sn-38产物与轻度还原的抗体的缀合
使用cl2a接头将抗ceacam5人源化mab，hmn-14(也称为拉贝珠单抗)；抗cd22人源化mab，hll2(也称为依帕珠单抗)；抗cd20人源化mab，ha20(也称为维妥珠单抗)；抗egp-1人源化mab，hrs7和抗粘蛋白人源化mab，hpam4(也称为克伐珠单抗)缀合至sn-38。用含有5.4mmedta的40mmpbs(ph7.4)中的以50-70倍摩尔过量使用的二硫苏糖醇(dtt)还原每种抗体，在37℃(浴)下45分钟。通过尺寸排阻色谱法和/或渗滤法纯化还原的产物，并缓冲液交换至ph6.5的合适缓冲液中。通过ellman测定确定硫醇含量，并且在6.5至8.5sh/igg范围内。或者，用在5-7范围内的ph的磷酸盐缓冲液中的三(2-羧乙基)膦(tcep)还原抗体，随后原位缀合。使用7％-15％v/v的dmso作为共溶剂使还原的mab与约10至15倍摩尔过量的cl2a-sn-38反应，并在环境温度下孵育20分钟。通过离心sec纯化缀合物，通过疏水性柱，且最后通过超滤-渗滤。通过366nm处的吸光度测定产物的sn-38并与标准值相关联，而蛋白质浓度由280nm处的吸光度推断，校正在此波长下sn-38吸光度的溢出。以这种方式，确定了sn-38/mab替代比。将纯化的缀合物作为冻干制剂储存在玻璃小瓶中，在真空下加盖并储存在-20℃的冰箱中。对于这些缀合物获得的sn-38摩尔替代比(msr)通常在5-7的范围内。
实施例13.仅使用immu-130(拉贝珠单抗-sn-38)治疗先前化学-免疫疗法难治的晚期结肠癌患者
患者是50岁男性，具有iv期转移性结肠癌病史，于2008年首次诊断且分别给与针对原发性和转移性结肠癌的结肠切除术和部分肝切除术。然后他接受了化学疗法，其包括伊立替康、奥沙利铂、folfirinox(5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利铂)和贝伐单抗，以及贝伐单抗与5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸组合，持续近2年。此后，他在下一年或或更长时间期间接受了单独或与folfiri(甲酰四氢叶酸、5-氟尿嘧啶、伊立替康)化学疗法组合的西妥昔单抗疗程。在2009年，他在化学-免疫治疗同时接受了肝转移的射频消融治疗，并于2010年底进行了他的肺转移的楔形切除术，并在几个月后在2011年初重复进行。尽管2011年进行了化学-免疫治疗，但2011年底出现了新的肺转移，并且在2012年，肺转移和肝转移均可见。在进行使用immu-130的抗体-药物治疗之前，他的基线血浆癌胚抗原(cea)滴度为12.5ng/ml。放射科医师通过计算机断层摄影术测量肿瘤大小变化所选择的指数病变是右肺中叶和肝转移，两者总计91mm作为immu-130(抗ceacam5-sn-38)疗法之前基线的最长直径的总和。
此患者每隔一周通过缓慢静脉内输注接受10mg/kgimmu-130的剂量，总计17个治疗剂量。患者对治疗耐受良好，在第一次治疗后仅具有1级恶心、腹泻和疲劳，这在治疗4和5之后发生，但之后没有，因为他接受这些副作用的药物治疗。在治疗3之后，他确实显示出在随后的治疗期间存在的脱发(2级)。恶心、腹泻和偶尔呕吐仅持续2-3天，并且在第一次输注后的疲劳持续2周。否则，患者良好地耐受治疗。由于接受与sn-38缀合的这种人源化(cdr-移植的)抗体的持续时间长，因此测量了他的血液中的抗拉贝珠单抗抗体，并且即使在16个剂量后也未检测到。
在4次治疗后进行第一次计算机断层摄影术(ct)测量，并且在这种治疗之前，在指数病灶中，显示从基线处进行的测量的总和的28.6％变化。在8次治疗后，这种减少变为40.6％，因此根据recist标准构成部分缓解。这种反应维持了另外2个月，当时他的ct测量值表明指数病灶比基线测量值低31.9％，但略高于之前测量的40.6％的下降。因此，基于对肺和肝脏中指数病灶的仔细ct测量，在包括(sn-38的母体分子)的之前用化学疗法和免疫疗法治疗失败的此患者显示出当经由抗ceacam5人源化抗体拉贝珠单抗(hmn-14)靶向时，对伊立替康(或喜树碱)的活性代谢物sn-38的目标应答。令人惊讶的是，虽然伊立替康(cpt-11)通过在体内释放sn-38起作用，但sn-38缀合的抗ceacam5抗体在结肠直肠癌患者中通过在患者早期未能对其最后一次含伊立替康的疗法作出反应后诱导部分应答而被证实有效。患者的血浆cea滴度降低也证实了ct结果：在第三次治疗剂量后它从12.6ng/ml的基线水平下降至2.1ng/ml，并且在剂量8与12之间介于1.7与3.6ng/ml之间。cea的正常血浆滴度通常被认为介于2.5与5.0ng/ml之间，因此这种疗法实现了他的血液中的cea滴度的正常化。鉴于这种应答，患者接受immu-130的sc制剂的维持治疗，每三周每周两次以2.5mg/kg的剂量施用，持续9个月的时间。在此期间，重复扫描和血液cea滴度保持稳定，并且患者仅具有2级嗜中性粒细胞减少症，其在每个疗程后10天内消退。
实施例14.用皮下immu-140治疗患有晚期结肠癌的患者
此患者是最初被诊断患有转移性结肠癌的75岁女性(iv期)。她具有右部分半结肠切除术和她的小肠切除，且然后接受folfox、folfox+贝伐单抗、folfiri+雷莫芦单抗以及folfiri+西妥昔单抗治疗持续一年半，此时她显示疾病进展，疾病传播至后穹窿、网膜，在她的骨盆中具有腹水以及她的胸腔右侧的胸膜积液。
每周两次皮下施用3mg/kgimmu-140(抗hla-dr-sn-38)连续2周，且然后停药一周(3周周期)持续超过20个剂量，其被非常良好地耐受，没有任何重大的血液学或非血液学毒性。在8周的评价中，她显示指数肿瘤病灶缩小21％，其在13周时增加至27％收缩。令人惊讶的是，此时患者的腹水和胸膜积液均减少(后者消失)，从而显著改善患者的整体状况。患者继续她的研究治疗。
实施例15.用immu-130的静脉内和皮下疗法治疗的患有iv期转移性疾病的胃癌患者
患者是52岁男性，由于胃部不适和与进食有关的疼痛持续约6年而寻求医疗看护，并且在过去12个月内体重减轻。胃区的触诊显示出坚硬的肿块，然后进行胃镜检查，在胃的下部显示溃疡性肿块。将其进行活组织检查并诊断为胃腺癌。实验室测试显示无特异性异常变化，除了肝功能测试ldh和cea升高，后者为10.2ng/ml。然后患者进行全身pet扫描，除了胃肿瘤外，其还公开了左腋窝和肝右叶中的转移性疾病(2个小转移灶)。患者切除胃肿瘤，且然后对他的转移性肿瘤进行基线ct测量。在手术后4周，他接受3个疗程的由顺铂和5-氟尿嘧啶(cf)的方案组成的组合化学疗法，但不能很好地耐受，因此转用多西他赛治疗。基于ct扫描，所述疾病似乎稳定了约4个月，但随后患者对进一步体重减轻、腹痛、食欲不振和极度疲劳的抱怨引起反复ct研究，其显示在原始胃切除部位转移灶的大小增加总和为20％和可疑病灶。
然后以8mg/kg静脉内的每周时间表给与患者immu-130(抗ceacam5-sn-38)的实验性治疗。他对此耐受良好，但3周后显示2级嗜中性粒细胞减少症和1级腹泻。他的第四次输注被推迟一周，且然后每周输注重新开始，在接下来的4次注射没有腹泻或嗜中性粒细胞减少症的迹象。然后患者进行ct研究以测量他的转移性肿瘤大小并观察胃切除的原始区域。根据recist标准，放射科医师测量转移病灶的总和与immu-130治疗前的基线相比减少23％。在原始胃切除术区域似乎没有任何明显的病灶。此时患者的cea滴度为7.2ng/ml，从immu-130前的基线值14.5ng/ml远远降低。患者以8.0mg/kg静脉内的相同剂量继续每周immu-130治疗，并且在总计13次输注后，他的ct研究显示，一个肝转移消失，并且所有转移病灶的总和减少41％，从而根据recist构成部分应答。患者的一般状况有所改善，并且他恢复常规活动，同时继续接受每6周每周两次皮下施用immu-130的3mg/kg的维持治疗持续另外4个疗程。在血液cea的最后一次测量中，值为4.8ng/ml，这在吸烟者的正常范围内，这是此患者的情况。
实施例16.用皮下抗ceacam5免疫缀合物治疗晚期转移性结肠癌
患者是用针对转移性结肠癌的先前疗法治疗失败的50岁男性。一线治疗是在第一个周期中以irox(伊立替康+奥沙利铂)开始的
在施用hmn-14-sn-38adc时，患者患有晚期转移性结肠癌，具有肺和肝的转移，其对伊立替康(喜树碱)无反应。hmn-14-sn-38adc以2mg/kg皮下的剂量施用，每周两次，其每隔一周重复持续4个月。在3个月的ct评估中，患者根据recist标准显示出转移性肿瘤减少的部分应答。
值得注意的是，这2mg/kg皮下(每周两次给与)组中仅一名患者显示2级血液学(嗜中性粒细胞减少症)，并且大多数患者具有1级或2级恶心、呕吐或秃头症-这些都是抗体-药物缀合物的活性的迹，但耐受良好。抗体部分在改善喜树碱靶向中的作用解释了sn-38部分在先前已经对未缀合的伊立替康具有耐药性的癌症中的功效。未注意到注射部位不耐受，只有在一周或更长时间内消退的一些局部红斑。
实施例17.多次皮下注射immu-132的耐受性
方法
在4周的时间内，用immu-132重复皮下注射天然雌性裸鼠。一组两只小鼠接受2mg注射(hed＝8mg/kg)，而第二组两只动物接受500μg(hed＝2mg/kg)。为了比较，一只小鼠仅接受盐水注射。每次注射(100μl)在相同位置(即右后侧腹)施用，每周两次持续四周。在注射当天对小鼠称重，并检查注射部位是否有任何毒性迹象(即皮疹、溃疡等)。如果发生任何情况，则将通过对所述区域拍照来记录。最后一次注射后一天，将小鼠麻醉并对注射部位拍照(图12)。在最后一次注射后一周重复这一过程(图13)。
结果
在最后一次注射后一天，对小鼠进行拍照以记录注射部位(图12)。同样，在最后一次注射后一周，对他们再次拍照以记录注射部位的状况(图13)。这些照片表明，在多次注射部位没有皮肤刺激的迹象。即使在4周内注射2mgimmu-132(总共16mg)的小鼠看起来与仅注射盐水的小鼠也没有什么不同。这些数据表明在这些小鼠中多次皮下注射immu-132的部位没有脱靶毒性。
实施例18.皮下immu-132的体内功效
实验设计
在实验性人膀胱癌中评价作为静脉内注射(i.v.)对比皮下注射(s.c.)施用的immu-132(沙西妥珠单抗戈维替康)的治疗功效(5637)。
将5637细胞在组织培养中扩增并用胰蛋白酶/edta收获。将雌性无胸腺裸鼠皮下注射200μl的与基质胶1:1混合的5637细胞悬浮液，以使得1x107个细胞被施用于每只小鼠。一旦肿瘤达到大约0.25cm3的大小(15天后)，就将动物分成三个不同的处理组，每组4-5只小鼠。对于静脉内注射(n＝5)，小鼠接受静脉内500μg每周两次，持续四周。同样地，向接受皮下注射(n＝5)的小鼠施用500μgimmu-132每周两次，持续四周。最后一组小鼠仅接受盐水(n＝4)并用作未处理的对照。测量肿瘤并且小鼠每周称重两次。如果其肿瘤体积超过1.0cm3大小，就将小鼠安乐死以获得疾病进展。
结果.
处理的小鼠的平均肿瘤体积在图14中示出。盐水对照组中的肿瘤在治疗开始后47.5天的中值存活时间(mst)进展。通过任一注射途径用immu-132处理的小鼠显示显著肿瘤消退，两组的mst>67天(对比盐水对照p＝0.0221，对数秩检验)。当实验在第82天(治疗开始后67天)结束时，两个immu-132处理组中的所有5只小鼠仍然存活(图14)。这些结果表明，皮下施用adc与静脉内施用一样有效。
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本领域的技术人员将显而易见的是，可对本发明的产物、组合物、方法和工序进行各种修改和变型。因此，本发明旨在涵盖此类修改和变型，前提条件是它们在所附权利要求书的范围及其等同形式内。
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