基于脯氨酸的神经肽FF受体调节剂的制作方法

相关申请的交叉引用

根据35usc§119的规定，在此要求于2017年2月14日以yananzhang和thuynguyen的名义提交的美国临时专利申请第62/458,731号“proline-basedneuropeptideffreceptormodulators”的权益。

领域

本公开内容涉及神经肽ff(npff)受体特异性的基于脯氨酸的化合物。本公开内容还涉及用于调节神经肽ff受体的功能以提供能够影响受神经肽ff受体影响的状况(condition)或紊乱(disorder)的药物疗法的方法、化合物和组合物。

相关技术的描述

神经肽ff(npff)属于被称为rf酰胺(rfamide)肽的神经肽家族，其成员在它们的c末端都含有arg-phe-nh2(rf-酰胺)基序。神经肽ff是一种内源性肽，其结合并且活化两种g蛋白偶联受体(gpcr)，npff1(gpr147)和npff2(gpr74)。这些受体是视紫红质家族的成员，并且主要与gαi/o蛋白偶联。最初从牛脑分离的npff及其受体已经在各种动物物种的中枢神经系统(cns)中鉴定出。对啮齿动物进行的配体结合研究证实，这两种受体亚型在脑中广泛表达，而仅npff2受体在脊柱中以可检测的水平表达。npff系统已经牵涉在多种生理过程的调节中，诸如胰岛素释放、食物摄入、记忆、血压、电解质平衡和神经再生。npff系统也已经示出在调节阿片类和若干其他类别的药物滥用的影响方面发挥重要作用。

被充分地记载的是，对阿片类受体不具有亲和力的npff是阿片类受体功能的调节剂，并且减弱对阿片类的耐受性和依赖性。若干项研究已经示出，npff对阿片类调节的影响依赖于施用途径。例如，在大鼠中脑室内(intracerebroventricular；i.c.v.)施用npff减轻了吗啡诱导的镇痛和运动(locomotion)，并且在吗啡依赖性大鼠中促成(precipitated)了阿片类戒断综合征，而鞘内(i.t.)施用则产生了阿片类诱导的镇痛并且还延长了吗啡诱导的镇痛(malin等人,peptides,11,277-280(1990)；yang等人,procnatlacadsciusa,82,7757-61,1985；gouarderes等人,eur.j.pharmacol.,237,73-81(1993))。1dme(肽npff类似物)的注射(i.c.v.)抑制了吗啡诱导的镇痛以及通过吗啡的位置条件反射(placeconditioning)的获得(marchand等人,peptides,27,964-72,2006)。npff抗血清的脑室注射(ventricularinjection)在吗啡耐受的大鼠中恢复了对吗啡的镇痛响应，但不影响非阿片耐受的大鼠(lake等人,neurosci.lett.,132(1):29-32,1991)。rf9，一种二肽npff1/2受体拮抗剂，剂量依赖性地阻断了由急性芬太尼施用或慢性吗啡施用产生的长期痛觉过敏(elhabazi等人,br.j.pharmacol.,165,424-435,2012；simonin等人,proc.natl.acad.sci.usa,103,466-471,2006)。该作用表现出主要由npff1受体介导，因为选择性npff1拮抗剂ac-262620也降低了阿片类耐受性(lameh等人,j.phamacol.exp.ther.,334,244-254,2010)。

阿片类仍然是针对许多疼痛状况，特别是针对慢性疼痛最有效的镇痛药；然而，与阿片类使用相关的不良作用，诸如身体依赖性、痛觉过敏和耐受性，妨碍了大量疼痛患者的适当给药和有效疼痛控制。将阿片类与可以增加阿片类的功效和/或减少不良反应的其他药物组合的组合疗法为疼痛管理提供了有前景的可选策略。

鉴于生物活性被认为通过npff进行调节，本领域正在寻找提供npff的功能效果的抑制或活化的化合物和组合物。

概述

本公开内容涉及神经肽ff和基于脯氨酸的神经肽ff受体调节剂的发现。在一个方面中，本公开内容涉及根据式(i)的这样的基于脯氨酸的神经肽ff受体调节剂：

其中r2选自–n-(c2-c8烷基)2和nh-r1，其中r1选自c2-c9烷基、杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；r3选自c3-c9烷基、芳基、杂芳基、杂环、杂芳基烷基、杂环烷基和芳基烷基；r4选自h和c1-c2烷基；并且r5选自c3-c9烷基、杂芳基烷基、杂芳基、杂环烷基、杂环、环烷基烷基和芳基烷基。还提供了根据式ii、式iia、式iii和式iv的基于脯氨酸的神经肽ff受体调节剂。

在另一个方面中，本公开内容涉及药物组合物，所述药物组合物包含由式i、式ii、式iia、式iii或式iv表示的基于脯氨酸的神经肽ff受体调节剂或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

在另外的方面中，本公开内容涉及用于治疗患有或易患其中神经肽ff受体活性的调节具有治疗益处的状况或紊乱的受试者的方法，所述方法包括向患有或易患所述状况或紊乱的所述受试者施用治疗有效量的根据式i、式ii、式iia、式iii或式iv的化合物或其药学上可接受的盐。

根据随后的描述和所附的权利要求，本公开内容的其他方面、特征和实施方案将是更加完全地明显的。

附图简述

图1描绘了本领域中描述的各种npff配体的化学结构。

图2描绘了基于脯氨酸的化合物1的化学结构。

图3是钙动员测定中npffec50的图示，示出了当用npff处理稳定的npff1细胞系和npff2细胞系时获得的数据。

图4示出了在npff1和npff2钙动员测定中化合物16的浓度-响应曲线，其中a图示出了化合物16在npff1钙动员功能性ke测定中的拮抗剂活性：稳定的npff1-rd-hga16细胞中单独的npff(○)和npff+5μm最终16(□)；并且b图示出了化合物16在npff2钙动员功能性ke测定中的拮抗剂活性：稳定的npff2-rd-hga16细胞中单独的npff(○)和npff+10μm最终16(□)。

图5示出了在npff1和npff2camp测定中化合物16和化合物33的浓度-响应曲线，其中a图示出了化合物16和化合物33在npff1camp功能性ke测定中的拮抗剂活性：稳定的npff1-cho细胞中单独的npff(○)、npff+4μm最终16(□)和npff+2μm最终33(◇)；并且b图示出了化合物16和化合物33在npff2camp功能性ke测定中的拮抗剂活性：稳定的npff2-cho细胞中单独的npff(○)、npff+10μm最终16(□)和npff+10μm最终33(◇)。

图6示出了在大鼠的芬太尼诱导的痛觉过敏模型中的测试结果，其中a图示出了芬太尼诱导的机械痛觉过敏的结果，并且其中b图示出了化合物16和化合物33的抗痛觉过敏效果(n＝6只/组)。

详细描述

本公开内容涉及基于脯氨酸的神经肽ff受体调节剂。调节剂表现出针对神经肽ff受体的亲和力和活性。因此，分子可以在由调节神经肽ff受体介导的紊乱、综合征和状况的治疗中是有用的。

研究已经发现，npff促成了尼古丁戒断综合征，这也表明npff参与依赖性和药物成瘾的过程。(malin等人,pharmacol.biochem.behav.,54,581-585,1996)。还已经示出，向侧脑室中慢性施用npff增强了对安非他命的行为致敏。(chen等人,brainres.,816,220-224,1999)。最近，证明了npff受体的刺激减少了安非他命诱导的条件性位置偏好的表达，而npff受体的抑制减少了安非他命戒断焦虑。(kotlinska等人,peptides,33,156-163,2012)。此外，已经表明了npff参与对可卡因兴奋性运动(hyperlocomotion)致敏的表达机制，尽管该作用可能是非特异性的。(kotlinska等人，peptides,29,933-939,2008)。与这些观察一致，似乎有证据表明npff结合位点在腹侧盖区域(vta)是丰富的，而npff样免疫反应性在伏隔核(nac)中被检测到，两个脑区域属于已知参与药物成瘾的中脑边缘多巴胺(da)突出部。(wu等人,peptides,31,1374-1382,2010)。总之，这些发现使得npff系统表现出是用于治疗药物成瘾的可行靶标。

除了npff之外，还已经发现来自rf酰胺家族的若干其他神经肽活化一种或两种npff受体，包括npsf(神经肽sf)、npaf(神经肽af)和npvf(神经肽vf)。已经报道了许多拟肽npff配体，其包含胍官能团(图1)。在这些配体中，已经报道了最后两个氨基酸残基(rf)的酰化对npff活性(bibp3226(bonini等人,j.biol.chem.275(50):39324-39331(2000))，化学结构1，图1)和rf9(simonin等人,pnas103(2):466-471(2006))，化学结构2，图1)至关重要。rf9的修饰导致npff1选择性二肽联苯-rf和拟肽rf313(bihel等人,acschemneurosci.,6(3):438-445(2015)，化学结构3，图1；gealageas,等人,bioorg.med.chem.lett.22,7471-7474(2012)；elhabazi,等人,neuropharmacol.,118,188-198(2017))。发现这些肽或拟肽充当拮抗剂，通过皮下施用或口服施用有效预防大鼠的芬太尼诱导的痛觉过敏。

还已经公开了若干类别的非肽npff配体。喹唑啉并胍、嘧啶胍、噻唑胍和喹啉并胍被报道为npff配体(wo03/026667，化学结构5，图1；美国专利第7,544,691号，化学结构4，图1)。发现一系列n-苄基哌啶作为针对npff1的激动剂/拮抗剂和针对npff2的拮抗剂具有混合的活性(journigan等人,j.med.chem.,57,8903-27,2014，化学结构6，图1)。这些系列具有胍官能团。虽然胍官能团在一些情况下与高血浆蛋白结合和有限的bbb渗透有关，但这些含胍的配体中的一些已经被报道进入cns，尽管程度相对较小。迄今为止，已经报道了仅两个系列的不具有胍官能团的小分子npff配体，但这些配体的体内效果仍有待研究(wo2009/038012，化学结构7，图1；wo2004/080965，化学结构8，图1)。

小的非肽化合物不经受分解肽降解，并且因此是探索npff受体的生物学作用的更有利的工具。在为了开发新的小分子npff配体的努力中，进行gpcr取向的化合物文库的高通量筛选。在图2中示出的具有脯氨酸支架的化合物1作为对两种npff亚型具有中等活性的有希望的先导化合物而出现，其具有合理的生理化学性质。开发了该支架的合成路线，并且制备了脯氨酸类似物的聚焦文库，以便探索在该支架的三个区域的结构-活性关系(sar)(图2)。

最初的sar研究集中在三个区域，羧酰胺、氨基中心和脯氨酸的4位，并且揭示了在这些位置的取代影响npff拮抗作用和亚型选择性。已经鉴定出许多具有亚微摩尔npff1效力的化合物。例如，具有正戊基氨基官能团的化合物16具有针对npff1的720nm的ke值，和具有相对于npff2的>4倍的偏好性。具有4-硝基苯乙基取代基的化合物33作为针对npff1最有效的类似物(ke＝245nm)而出现并具有相对于npff2的～3倍的偏好性。一般地，这些化合物针对npff1受体更有效，而针对npff2的选择性仅是适中的。次级camp测定的结果进一步证实了这些化合物的npff拮抗活性，并且放射性配体结合测定证明了配体以中等亲和力结合至npff受体。

代表性化合物16和化合物33具有中等溶解度和血脑屏障渗透性，证明脯氨酸支架为潜在的药物样且有效的npff模板。

获得的化合物在钙动员测定中被表征，以评估它们针对两种npff受体的活性。还评估了若干种化合物以确认它们在调节环一磷酸腺苷(camp)的细胞水平中的作用以及它们对两种npff受体的结合亲和力。然后检查了药物样性质，诸如溶解度和血脑屏障渗透性。最后，研究了这些化合物在逆转芬太尼诱导的痛觉过敏中的作用。

传统上，npff活性已经使用诸如放射性标记(放射性配体)结合、gtp-γ-s或camp测定的测定来检查。为了建立允许低成本的高通量筛选的平台，使用同时过表达gα16蛋白和人npff1受体或人npff2受体的中国仓鼠卵巢(cho)细胞开发了钙动员测定。npff1和npff2稳定细胞系通过以下来产生：将表达质粒转染至rd-hga16cho细胞(moleculardevices)，使用抗生素抗性选择阳性克隆，并且按照先前公开的程序测试npff1受体和npff2受体的功能表达(zhang,y.等人,jmedchem,53,7048-60,2010；german,n.等人,jmedchem,57,7758-69,2014；nguyen,t.等人,bioorgmedchem,23,2195-203,2015)。将克隆首先针对10μmnpff来筛选，以鉴定具有功能性npff受体的克隆。用npff浓度-响应曲线进一步评估了8个具有最高的最大npff响应的克隆；具有最强效和有效npff响应的克隆被选择作为工作克隆。

图3示出了当用npff处理稳定的npff1和npff2细胞系时获得的数据。在npff1-rd-hga16细胞中，npff具有～62nm的ec50值，并且信号窗口为15,000个相对荧光单位(rfu)。在npff2-rd-hga16细胞中，npff具有～22nm的ec50值，并且信号窗口为8,200rfu。这些npffec50值与来自其他camp测定和gtp-γ-s测定的结果一致(gouarderes,c.等人,neuropharmacology,52,376-86,2007；lameh,j.等人,jpharmacol.exp.ther.,334,244-54,2010；vyas,n.等人,peptides,27,990-60,2006)。

在亲本rd-hga-16cho细胞中，不存在对npff的响应，证实其通过npff受体的信号传导。npff1稳定细胞系成功地从96孔小型化至384孔(z’因子＝0.75)，用于文库筛选。

将基于npff1flipr(荧光成像板读取器)的钙动员测定用于从内部富含gpcr的文库高通量筛选配体，以及用于表征所获得的合成化合物。筛选的文库是高度多样化的，包括22,000种化合物，并且其含量和性质基于多种因素进行了严格评估，以用于针对gpcr的筛选，所述多种因素包括最大多样性、最佳adme参数、结构新颖性(与在已知的gpcr配体和药物中发现的支架最小重叠)以及具有gpcr配体的原型特性的药效依从性。

文库化合物以10μm最终浓度筛选激动剂活性和拮抗剂活性两者，作为开发的3-加成方案(3-additionprotocol)的一部分，使得能够用单个测定板评估两种活性模式，从而减少了筛选的总时间和成本。用37种选择的拮抗剂(27种具有>65％的抑制，并且10种具有>85％的抑制)运行浓度-响应曲线，产生经证实的这些化合物的活性。

因此，在npff1和npff2钙动员测定中首先表征了所有合成的化合物以确定它们拮抗npff刺激的钙流入的能力。由于npff受体与gαi/o蛋白天然偶联并且抑制腺苷酸环化酶，选择在npff1或npff2钙测定中具有≤1μm的表观解离常数ke值的活性化合物，并且在perkinelmer的lancecamp测定中进一步评估。

在两种功能性测定中，获得了单独的激动剂npff的ec50曲线和连同测试化合物一起的激动剂npff的ec50曲线，并且测量了激动剂曲线的右移。如先前描述的，表观解离常数ke由化合物介导的npff活性的抑制来计算(perrey等人,j.med.chem.,56,6901-16,2013；perrey等人,acschem.neurosci.6,599-614,2015)。如上文指示的，使用钙动员测定测试所有化合物的激动剂活性；没有化合物显示出针对npff1受体或npff2受体的任何显著的激动剂活性(<20％的npffemax(最终10μm))。这些化合物还在放射性配体结合测定中被表征，以测量亲和力并且证实脯氨酸支架是作为npff配体的真实模板。parazapharmainc.(montreal,canada)根据他们的标准方案进行了化合物的动力学溶解度和双向mdck-mdr1渗透性测定。

作为上文描述的研究的结果，发现了根据式i的基于脯氨酸的npff受体调节剂：

其中r2选自–n-(c2-c8烷基)2和nh-r1，其中r1选自c2-c9烷基、杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；r3选自c3-c9烷基、芳基、杂芳基、杂环、杂芳基烷基、杂环烷基和芳基烷基；r4选自h和c1-c2烷基；并且r5选自c3-c9烷基、杂芳基烷基、杂芳基、杂环烷基、杂环、环烷基烷基和芳基烷基；或其药学上可接受的盐、酰胺、酯或前药。

式i表示基于脯氨酸的npff调节剂，其中化合物1的脯氨酸支架的三个区域中的每个可以被优化。

在式i的实施方案中，其中r1选自杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；r3选自杂芳基烷基、杂环烷基和芳基烷基；和/或r5选自杂芳基烷基、杂环烷基、环烷基烷基和芳基烷基，烷基基团是c1、c2或c3。这样的基团的合适的实例在下文的表中示出。

在式i的某些实施方案中，r2是–n-(c5-c6烷基)2。

在式i的某些实施方案中，r2是nh-r1。在式i的另外的实施方案中，当r2是nh-r1时，r1是c3-c6烷基。

在式i的一些其他实施方案中，当r2是nh-r1时，r1是苄基或苯乙基，所述苄基或苯乙基是被取代的或未被取代的。在其中r1是被取代的苯乙基的某些实施方案中，苯乙基被低级烷氧基诸如甲氧基、硝基、低级烷基、卤素或卤化的低级烷基诸如cf3取代。苯乙基基团可以是单取代的或二取代的。

如本文描述的r2的实施方案可以与本文描述的r3、r4和r5的实施方案的任何组合相组合。

在式i的某些实施方案中，r3是具有多种取代基的被取代的苄基或被取代的苯乙基。举例来说，取代基可以是卤素、甲氧基、甲基、氰基、n-ch2以及其他。

在式i的某些实施方案中，r3是苄基或被取代的苄基，并且r4是h。在其中r3是被取代的苄基的这样的实施方案中，苄基被甲氧基单取代或二取代。

在式i的某些其他实施方案中，r3是苄基或被取代的苄基，并且r4是甲基。

在其中r3是被单取代的苄基或被单取代的苯乙基的式i的实施方案中，取代基在4位。

在式i的一些实施方案中，r5是苄基或被取代的苄基。在其中r5是被取代的苄基的这样的实施方案中，取代基可以是卤素或甲氧基。在其中r5是被取代的苄基的另外的实施方案中，苄基是单取代的，并且取代基可以是邻位取代的卤素或甲氧基。

在一个实施方案中，基于脯氨酸的npff受体调节剂可以由式ii表示：

其中r2选自–n-(c2-c8烷基)2和nh-r1，其中r1选自c2-c9烷基、杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；并且x是s、so、so2、o、nh或ch2。由式ii表示的基于脯氨酸的npff调节剂在化合物1的区域1，羧酰胺区域中具有修饰。

在式ii的某些实施方案中，r2是–n-(c5-c6烷基)2。

在式ii的某些实施方案中，x是s或o。

根据式ii的一些实施方案，r2是nh-r1，其中r1选自c2-c9烷基、杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；并且x是s、so、so2、o、nh或ch2。该实施方案由式iia表示：

在式iia的某些实施方案中，r1是c3-c6烷基；并且x是氧。在式iia的其他实施方案中，r1是苄基或苯乙基，所述苄基或苯乙基是被取代的或未被取代的，并且x是氧。在其中r1是被取代的苯乙基的某些实施方案中，苯乙基被低级烷氧基诸如甲氧基、硝基、低级烷基、卤素或卤化的低级烷基诸如cf3取代。

表1列出了对应于式ii的实施方案的如上文讨论确定的sar，其中x是氧。

表1

^a值是一式两份的至少三个独立实验的平均值±sem。

^b值是一式两份的两个独立实验的平均值±sem。

^c拮抗剂和测试化合物的预孵育是45min或1小时。

^d化合物以最终10μm在拮抗剂筛选中无活性(n＝2)。

^e化合物在测定中表现出是细胞毒性的，并且效力未确定。

具有在脯氨酸核心的4位的4-甲氧基苄基基团而不是化合物1中的4-(甲基硫代)苄基基团的类似物被用于羧酰胺区域的sar研究，因为甲氧基部分已知具有更好的代谢稳定性。此外，与4-(甲基硫代)苯甲醛相比，甲氧基类似物的相应的原料更容易获得。

如从表1可以看出，该系列的npff1拮抗剂活性对酰胺官能团的r1取代基的长度敏感。甲基类似物和乙基类似物(10和11)针对两种npff受体以10μm是无活性的。针对npff1受体的拮抗剂活性从正丙基到正戊基(12、13、16)增加，然后在正己基(18)的情况下略微降低，并且在正癸基链(19)的情况下完全消除。在三种丁基异构体(13-15)中，npff1拮抗剂活性按正丁基、仲丁基和叔丁基的顺序略微降低。相比之下，npff2拮抗剂活性以相同的顺序显著增加，这指示直链对于npff1选择性是优选的。在正戊基异构体和异戊基异构体(16和17)的情况下也观察到类似的趋势。在这两种异构体之间，正戊基是更有效和选择性的npff1拮抗剂(npff1ke＝720nm，npff2ke＝3,090nm)。

当环己基(21)被苯基基团(24)替代时，npff1活性略微增加，同时保持优于npff2受体的选择性。缩短(23)或延长(25)苯基环和脯氨酸核心之间的距离导致更弱的效力。化合物24(npff1ke＝850nm)作为有效的选择性npff1拮抗剂而出现。

在苯基环(26-31)的对位的给电子取代基中，4-甲氧基(26，npff1ke＝670nm)是最有效的npff1拮抗剂。3,4-二甲氧基(27)和4-二甲基氨基(28)是略微较小效力的。体积大的基团诸如4-乙酰胺基(29)、4-(甲基氨基)羰基(30)和叔丁基(31)不是良好耐受的，这与先前观察到的在结合袋处存在有限的空间一致。转向吸电子取代基，4-硝基(33，npff1ke＝250nm)在所有脯氨酸类似物中证明了最佳的npff1拮抗剂效力。结果指示，强吸电子基团对于良好的npff1拮抗剂活性是有利的，因为3,4-二氟(34，npff1ke＝610nm)比4-氯(32，npff1ke＝990nm)、4-氟(35，npff1ke＝1,130nm)和4-三氟甲基(36，npff1ke＝1,670nm)更有效。已经被用作4-硝基苯基的电子等排替代物的4-吡啶基(37)，仅显示出中等的npff1活性(ke＝1,820nm)。

最后，与4-硝基类似物相比，两个体积大的吸电子基团乙酰基(38)和4-甲基磺酰基(39)的npff1拮抗剂活性被显著地遏制。这些数据暗示，小的、强吸电子取代基是优选的，而体积大的基团被证明对于npff1拮抗剂活性是有害的。与脂肪族系列类似，这些苯乙基类似物针对npff2受体不是有效的，除了4-甲氧基(26)、二乙基氨基(28)、4-氯(32)、4-硝基(33)和3,4-二氟(34)。

接下来，还研究了二取代的酰胺在该区域的效果。二乙基氨基类似物和二丙基氨基类似物(40，npff1ke＝2,900nm和41，npff1ke＝880nm)针对npff1受体比它们的单取代的酰胺对应物(11，npff1ke>10,000nm和12，npff1ke＝9,080nm)更有效。在苯基环和酰胺之间具有刚性间隔物的化合物42(npff1ke＝1,330nm))针对npff1受体比具有柔性乙烯接头的24(npff1ke＝850nm)的活性较低。

表2.4-(4-甲基硫代)苄基氨基系列的羧酰胺区域的sar。

^a值是一式两份的至少三个独立实验的平均值±sem。

^b值是一式两份的两个独立实验的平均值±sem。

^c拮抗剂和测试化合物的预孵育是1小时。

由于初始化合物1在脯氨酸支架上的4-苄基基团处具有4-甲基硫代，在用脯氨酸支架的4-(4-甲氧基苄基)取代探索羧酰胺区域的各种取代基之后，从表1中选择了若干种更有效的类似物，并且检查了4-甲基硫代取代的效果。如表2所示，重新合成的43(npff1ke＝1,080nm，npff2ke5,600nm)具有针对两种受体的与来自筛选文库的1(npff1ke＝1,620nm，npff2ke＝7,250nm)相当的效力。在羧酰胺处具有烷基基团的两个(甲基硫代)苄基类似物是比它们的甲氧基对应物更有效的npff1拮抗剂(npff1：43ke＝1,080nm相对于11ke>10,000nm；44ke＝360nm相对于16ke＝720nm)。类似地，苯乙基(45)和3,4-二氟苯乙基(48)类似物证明在硫醚系列中比它们的甲氧基对应物略微较好的npff1活性(45ke＝530nm相对于24ke＝850nm；48ke＝470nm相对于34ke＝610nm)。在另一方面中，4-甲氧基(46)和4-硝基(47)类似物比它们的甲氧基等效物是略微较小效力的(46ke＝870nm相对于26ke＝670nm，47ke＝370nm相对于33ke＝250nm)。针对npff2受体，除了46和47，与4-(4-甲氧基苄基)氨基类似物相比，该系列表现出是更具活性的，并且因此对npff1受体的选择性较小。

总的来说，这些结果突出了取代基尺寸和对亲脂性的偏好以及该结合袋处的一些柔性的重要性。最有效的npff1配体是4-硝基(33)，其中npff1ke＝250nm。还鉴定了若干种具有针对npff1的中等活性、不具有npff2活性/具有弱npff2活性的配体。贯穿这些研究的过程，我们测试的大多数化合物在曲线移动测定中显示出竞争性拮抗作用；然而，一些化合物(23、32、33、41、42、46)通过曲线向右移动并且还抑制最大npff信号来示出不可逾越的拮抗作用的证据。虽然变构调节剂通常产生这样的响应，但该类型的拮抗作用也可以在具有慢解离速率的竞争性正构拮抗剂的情况下观察到。这样的拮抗剂先前已经使用过，并且示出通过用较长的拮抗剂-受体孵育期进行曲线移动测定，系统达到平衡，并且因此化合物产生典型的竞争性拮抗剂概况。实际上，当将较长时间的孵育应用于npff测定时，化合物显示出典型的竞争性拮抗剂活性概况。

在另一个实施方案中，npff调节剂可以由式iii表示：

其中r3选自c3-c9烷基、芳基、杂芳基、杂环、杂芳基烷基、杂环烷基和芳基烷基；并且r4选自h和c1-c2烷基。

在式iii的某些实施方案中，r3是具有多种取代基的被取代的苄基或被取代的苯乙基。举例来说，取代基可以是卤素、甲氧基、甲基、氰基、n-ch2以及其他。

在式iii的某些实施方案中，r3是苄基或被取代的苄基、苯乙基或被取代的苯乙基，并且r4是h。在其中r3是被取代的苄基的一些实施方案中，苄基被甲氧基取代。

在式iii的某些其他实施方案中，r3是苄基或被取代的苄基，并且r4是甲基。

在式iii的其他实施方案中，r3是c3-c6烷基。

表3列出了在区域2被取代的化合物1的类似物的如上文讨论确定的sar，包括对应于式iii的实施方案。

表3

^a值是一式两份进行的至少三个独立实验的平均值±sem。

^b拮抗剂和测试化合物的预孵育是1小时。

为了探索区域2的sar，选择4-硝基苯乙基氨基作为r1处的最佳取代基，并且在脯氨酸支架的4位的胺中心处引入各种取代基(表3)。观察到如上文讨论的脂肪族系列中取代基尺寸的类似趋势(52-55)。随着侧链长度从正丙基到正己基增加，针对两种受体的npff1活性变得更有效。随着侧链达到5个至6个碳，活性似乎达到平台期。苯甲基(56)和苯乙基(58)针对两种受体具有类似的活性。产生叔胺类似物(57)的氨基基团的n-甲基化略微遏制了针对两种npff亚型的活性。该趋势被认为意味着该结合袋也具有类似于区域1的有限的空间。

还探测了不同位置的取代基对苄基环的影响(33、59-64)。将4-ome转换至3位或在苯基上的3位处添加另一个ome降低了对两种受体亚型的活性。电子效应似乎不是环取代的决定因素。用另一个给电子基团4-oh替代4-ome导致活性丧失。吸电子的三氟甲基基团不具有活性，而另外两个卤素类似物具有针对npff1的良好活性。值得注意的是，化合物64对npff1受体具有超过10倍的选择性。

在另一个实施方案中，npff调节剂可以由式iv表示：

其中r5选自c3-c9烷基、杂芳基烷基、杂芳基、杂环烷基、杂环、环烷基烷基和芳基烷基；并且x是s、so、so2、o、nh或ch2。

在式iv的某些实施方案中，r5选自c3-c9烷基、杂芳基烷基、杂环烷基、环烷基烷基和芳基烷基，并且x是o。

在式iv的某些实施方案中，r5选自c3-c9烷基、杂芳基烷基、杂环烷基、环烷基烷基和芳基烷基，并且x是s。

在式iv的某些实施方案中，r5选自c3-c9烷基、杂芳基烷基、杂环烷基、环烷基烷基和芳基烷基，并且x是nh。

在式i的一些实施方案中，r5是苄基或被取代的苄基，并且x是o。在其中r5是被取代的苄基的这样的实施方案中，取代基可以是卤素或甲氧基。在其中r5是被取代的苄基的另外的实施方案中，苄基是单取代的，并且取代基可以是在2位或3位处的卤素或甲氧基。

表4列出了在化合物1的区域3被取代的化合物1的类似物的如上文讨论确定的sar，包括对应于式iv的实施方案。

表4

^a值是一式两份的至少三个独立实验的平均值±sem。

在合成中，硝基基团在用于去除脯氨酸氮和4位的氨基基团的保护基团的条件下容易被还原。为了简化在区域3制备一系列类似物的合成努力，探索了在区域1具有苯乙基基团的类似物，而不是4-硝基苯乙基，并且在区域2中使用4-甲氧基苄基基团。

如表4所示，r5可以是无环取代基(即正己基，74)、环状烷基取代基(即环己基甲基，75)或苄基取代基(24、76-88)。取代基的位置在活性中具有强的影响。在被取代的苄基类似物中，在2位和3位的取代优于4位。在三种氯取代的异构体中，在3位的取代是最有效的类似物(77，ke＝580nm)，具有相比于npff2受体中等的亚型选择性(>10倍)。在另一方面中，甲氧基(79)基团和甲基(82)基团似乎优选2位。类似地，其他取代基诸如4-羟基(84)基团、4-二甲基氨基(85)基团和4-氰基(86)基团减弱了npff活性。体积大的取代基诸如2-萘基甲基(87)或3,4-亚甲基二氧基苄基(88)也不是有利的。

在放射性配体结合测定和camp测定中进一步表征了若干种化合物(表5)。通常，将从所有三种测定中获得的数据彼此充分比较。在钙动员测定中是有效的拮抗剂的化合物在测量天然g蛋白偶联的次级camp测定中也是有效的拮抗剂。此外，结合测定示出，所有化合物都与npff受体结合，并且npff1功能性测定中的有效化合物(例如，化合物33和化合物34)具有有效的结合亲和力。

表5.代表性化合物的camp测定、放射性配体结合测定和钙动员测定的结果。

^a值是一式两份的至少两个独立实验的平均值±sem。

^b值是一式两份的至少三个独立实验的平均值±sem。

^c拮抗剂和受体的预孵育是1小时。

^d未确定

cns药物的主要挑战之一是它们穿越血脑屏障(bbb)并且到达cns的能力。对于大多数药物，血脑屏障渗透性受两个因素的影响：被动地渗透通过bbb的能力和避免通过转运蛋白诸如p-糖蛋白被外排。因此，评估了代表性化合物33，其在使用mdck-mdr1细胞的双向转运测定中具有良好的拮抗剂活性，所述mdck-mdr1细胞用人mdr1cdna稳定转染，使得它们比野生型表达更高水平的p-糖蛋白(pgp)。化合物33以2.7×10^-6cm/s的速率从顶端(a)至基底侧(basolateral)(b)穿过细胞屏障，并且以3.6×10^-6cm/s的速率以反向方向b至a穿过细胞屏障，证明了中等的bbb渗透性(在3×10^-6cm/s-6×10^-6cm/s的范围内)。³³外排比率(pb→a/pa→b)是1.3，指示化合物不是pgp底物。(di等人,indrug-likeproperties:concepts,structuredesignandmethodsfromadmetotoxicityoptimization,academicpress,第141-159页(2016))。此外，化合物还具有45.9±7.7μm(平均值±％cv)的溶解度，该溶解度落入具有中等至良好溶解度的化合物的10μg/ml-60μg/ml的范围内，根据di等人，indrug-likeproperties:concepts,structuredesignandmethodsfromadmetotoxicityoptimization,academicpress,第56-85页(2016)。

示出的活性指示基于脯氨酸的神经肽ff受体调节剂作为npff拮抗剂是有用的。

术语在它们被接受的含义内使用。以下定义意图进行说明，但不限制所定义的术语。

如本文使用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”、和“所述/该(the)”包括复数指示物。

如本文使用的，碳数范围的鉴定，例如，在c1-c12烷基中，意图包括这样的范围内的组分碳数部分中的每个，使得涵盖该陈述范围内的每个中间碳数和任何其他陈述的碳数值或中间碳数值，还应理解，在本发明的范围内，在指定的碳数范围内的碳数的子范围可以独立地被包括在较小的碳数范围内，并且具体地排除一个或更多个碳数的碳数范围被包括在本发明中，并且排除指定范围的碳数极限中的任一个或两个的子范围也被包括在本公开内容中。

因此，举例来说，c3-c9烷基意图包括丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基和壬基，包括这样的类型的直链以及支链基团，诸如异丙基和叔丁基。因此，应理解，对如广泛适用于取代基部分的碳数范围，例如c1-c12或c1-c6的鉴定，使得在本公开内容的具体实施方案中，碳数范围能够被进一步限制，作为具有在取代基部分的更宽的规定内的碳数范围的部分的子组。举例来说，在本公开内容的特定实施方案中，碳数范围，例如c1-c12烷基，可以被更限制性地指定为涵盖子范围，诸如c1-c4烷基、c2-c8烷基、c2-c4烷基、c3-c5烷基，或者在宽碳数范围内的任何其他子范围。因此，例如，范围c1-c6将包括诸如c1-c3、c1-c4、c2-c6、c4-c6等的在较宽范围内的子范围并且可以由诸如c1-c3、c1-c4、c2-c6、c4-c6等的在较宽范围内的子范围的规定进一步限制。

术语“低级烷基”包括c1烷基、c2烷基或c3烷基中的任一种。

当术语“烷基”与第二基团结合使用作为后缀时，如在“芳基烷基”、“氨基烷基”、“环烷基烷基”或“杂环烷基”中，则第二基团经由烷基基团被连接至分子的剩余部分。举例来说，当使用“芳基烷基”、“氨基烷基”、“环烷基烷基”或“杂环烷基”等时，烷基基团可以是c1烷基、c2烷基、c3烷基或c4烷基中的任一种。

“环烷基”指的是任选地被取代的非芳香族环状烃环。除非另外指示，否则环烷基包括三个至八个碳原子。示例性的“环烷基”基团包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。环烷基基团可以是被取代的或未被取代的，例如被卤素或c1-c3烷基取代。

“杂环”指的是含有一个或更多个杂原子(例如，o、n、s)作为环结构的一部分并且在环中具有两个至七个碳原子的饱和的环状基团。在实施方案中，杂环可以与芳基基团诸如苯基稠合。杂环可以是被取代的或未被取代的，例如，被卤素、氨基、氰基、硝基、羰基、酰氨基、乙酰基、羧甲基、c1-c3烷基或c1-c3烷氧基取代。

“杂芳基”指的是含有一个或更多个杂原子(例如，o、n、s)作为环结构的一部分并且在环中具有两个至七个碳原子的不饱和的芳香族环状基团。杂芳基基团可以包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基(pyrrolyl)、吡咯并(pyrrolo)、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基以及类似基团。杂芳基基团可以是被取代的或未被取代的，例如，被卤素、氨基、氰基、硝基、羰基、酰氨基、乙酰基、羧甲基、c1-c3烷基或c1-c3烷氧基取代。

此外，术语“杂芳基”用于包括含有一个或更多个杂原子的稠合的双环环体系。这样的杂芳基基团的实例包括苯并二氧杂环戊烯、苯并异噁唑基、苯并呋喃基。

如本文使用的“芳基”包括衍生自苯或苯衍生物的烃，所述烃是从6个至10个碳原子的不饱和的芳香族碳环基团。芳基可以具有单个环或多个环。实例包括苯基、苄基或萘基。芳基基团可以是被取代的或未被取代的，例如，被卤素、氨基、氰基、硝基、羰基、酰氨基、乙酰基、羧甲基、c1-c3烷基或c1-c3烷氧基取代。

“芳基烷基”包括例如苄基和苯乙基。

“烷基环烷基”包括例如甲基环己基基团。

本公开内容的化合物可以参考本文阐述的各种说明和其示例，在具体的实施方案中通过条件或限制，排除具体的取代基、基团、部分或结构来进一步指定。因此，本公开内容预期限制性地定义的组合物，例如其中r是c1-c12烷基的组合物，条件是当r¹是指定的分子组分，并且i是指定的碳数时，r≠ci烷基。取代基可以以任何方式选择并且彼此组合，得到根据式i、式ii、式iia、式iii或式iv的化合物。

本文公开的化合物中的某些可以作为包括光学异构体的立体异构体存在。本公开内容的范围包括呈这样的立体异构体的外消旋混合物以及呈可以根据本领域普通技术人员熟知的方法分离的单独对映异构体的所有立体异构体。当存在手性中心时，除非另外指示，否则结构的立体化学包括r构型和s构型两者。

如本文中关于各种所描述的特征、方面和实施方案不同地阐述的本公开内容可以在特定实施方式中被构造为包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：这样的特征、方面和实施方案中的一些或全部，以及被聚集的其要素和组分以构成本公开内容的各种另外的实施方式。本公开内容预期在本公开内容的范围内的各种置换(permutation)和组合中的这样的特征、方面和实施方案。因此，本公开内容可以被指定为包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：这些具体的特征、方面和实施方案的任何这样的组合和置换，或其选择的一个或更多个。

术语“有效量”意指将引起例如由研究者或临床医生正在寻找的组织、系统、动物或人类的生物学或医学响应的药物或药物剂的量。术语“治疗有效量”意指与未接受这样的量的相应受试者相比，导致疾病、紊乱或副作用的改善的治疗、愈合、预防或改善，或者疾病或紊乱的进展速率的降低的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。

举例来说，npff受体调节剂在疼痛管理以减少阿片类耐受性和痛觉过敏、成瘾紊乱、抗炎、进食、血压、胰岛素释放、退热、降低焦虑、减轻边缘系癫痫发作活动、减轻阿片类诱导的体温过低和心血管调节中可以是有用的。

在一个方面中，npff受体调节剂可以与其他药物或剂组合使用，或与多种心理疗法结合使用，所述心理疗法可用于治疗由npff受体调节的状况和紊乱类型。可以与npff受体调节剂和含有npff受体调节剂的组合物一起使用的药物或剂可以包括典型的和/或非典型的抗精神病药物，诸如氟哌啶醇(haloperidol)和阿立哌唑(aripiperazole)或单胺再摄取抑制剂诸如氟西汀和舍曲林。

鉴于npff系统的阿片类调节性质，本公开内容的npff受体调节剂和组合物的其他组合疗法应用包括它们与阿片类的同时施用，所述阿片类例如芬太尼、吗啡、羟考酮、氢可酮、丁丙诺啡等，以对抗阿片类的痛觉过敏和耐受性效应。

在本公开内容的另一个方面中，提供了用于治疗患有或易患其中神经肽ff受体活性的调节具有治疗益处的状况或紊乱的受试者的方法，所述方法包括向患有或易患所述状况或紊乱的所述受试者施用有效量的根据式i的神经肽ff调节剂。

其中r2选自–n-(c2-c5烷基)2和nh-r1，其中r1选自c2-c9烷基、杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；r3选自c3-c9烷基、芳基、杂芳基、杂环、杂芳基烷基、杂环烷基和芳基烷基；r4选自h和c1-c2烷基；并且r5选自c3-c9烷基、杂芳基烷基、杂芳基、杂环烷基、杂环、环烷基烷基和芳基烷基；或其药用盐、酰胺、酯或前药。

在式i的实施方案中，其中r1选自杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；r3选自杂芳基烷基、杂环烷基和芳基烷基；和/或r5选自杂芳基烷基、杂环烷基、环烷基烷基和芳基烷基，烷基基团是c1、c2或c3。这样的基团的合适的实例在上文的表中示出。

在式i的某些实施方案中，r2是nh-r1。在式i的另外的实施方案中，当r2是nh-r1时，r1是c3-c6烷基。

在式i的一些其他实施方案中，当r2是nh-r1时，r1是苄基或苯乙基，所述苄基或苯乙基是被取代的或未被取代的。在其中r1是被取代的苯乙基的某些实施方案中，苯乙基被低级烷氧基诸如甲氧基、硝基、低级烷基、卤素或卤化的低级烷基诸如cf3取代。在某些实施方案中，苯乙基基团是单取代的或二取代的。

如本文描述的r2的实施方案可以与本文描述的r3、r4和r5的实施方案的任何组合相组合。

在式i的某些实施方案中，r3是具有多种取代基的被取代的苄基或被取代的苯乙基。举例来说，取代基可以是卤素、甲氧基、甲基、氰基、n-ch2以及其他。

在式i的某些实施方案中，r3是苄基或被取代的苄基，并且r4是h。在其中r3是被取代的苄基的这样的实施方案中，苄基被甲氧基单取代或二取代。

在式i的某些其他实施方案中，r3是苄基或被取代的苄基，并且r4是甲基。

在其中r3是被单取代的苄基或被单取代的苯乙基的式i的实施方案中，取代基在4位。

在式i的一些实施方案中，r5是苄基或被取代的苄基。在其中r5是被取代的苄基的这样的实施方案中，取代基可以是卤素或甲氧基。在其中r5是被取代的苄基的另外的实施方案中，苄基是单取代的，并且取代基可以是邻位取代的卤素或甲氧基。

在一个实施方案中，基于脯氨酸的npff调节剂可以由式ii表示：

其中r2选自–n-(c2-c5烷基)2和nh-r1，其中r1选自c2-c9烷基、杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；并且x是s、so、so2、o、nh或ch2。

根据式ii的一些实施方案，r2是nh-r1，其中r1选自c2-c9烷基、杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；并且x是s、so、so2、o、nh或ch2。该实施方案由式iia表示：

在式iia的某些实施方案中，r1是c3-c6烷基；并且x是氧。在式iia的其他实施方案中，r1是苄基或苯乙基，所述苄基或苯乙基是被取代的或未被取代的，并且x是氧。在其中r1是被取代的苯乙基的某些实施方案中，苯乙基被低级烷氧基诸如甲氧基、硝基、低级烷基、卤素或卤化的低级烷基诸如cf3取代。

在用于治疗受试者的方法的其他实施方案中，npff受体调节剂可以根据本文针对式i、式ii或式iia公开的任何实施方案。

在用于治疗受试者的方法的某些实施方案中，npff受体调节剂可以根据如本文描述的任何式iii或式iv。

在用于治疗受试者的方法的某些实施方案中，神经肽ff受体活性的调节是拮抗活性。

在某些实施方案中，提供了用于治疗患有其中神经肽ff受体活性的调节具有治疗益处的状况和紊乱的受试者的方法，所述方法包括向患有或易患所述状况或紊乱的所述受试者施用有效量的根据式i、式ii、式iia、式iii或式iv中的一种的化合物，所述化合物表现出对于神经肽ff受体的选择性结合和对于神经肽ff受体的功能性拮抗剂活性。

待治疗的状况或紊乱可以涉及疼痛管理、成瘾紊乱、抗炎、进食、血压、胰岛素释放、退热、降低焦虑、减轻边缘系癫痫发作活动、减轻阿片类诱导的体温过低、心血管调节、减轻痛觉过敏和/或阿片类耐受性或由npff受体调节的其他状况或紊乱。

在实施方案中，施用的npff受体调节剂或拮抗剂是前述式i、式ii、式iia、式iii或式iv的任何调节剂的药学上可接受的盐、酰胺、酯或前药。在这方面，式i、式ii、式iia、式iii或式iv的任何化合物可以与药学上可接受的载体组合。

本公开内容的化合物的盐可以通过本领域技术人员已知的方法来制备。酸可以是无机酸或有机酸。合适的酸包括例如盐酸、氢碘酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、乙酸和甲酸。

可以使用多种施用技术，其中包括口服、透皮或肠胃外技术，诸如皮下、静脉内、腹膜内、脑内和脑室内注射、导管插入以及类似技术。这样的施用方法是本领域技术人员熟知的。关于药物递送系统和施用模式的一般性讨论，参见kirk-othmerencyclopediaofchemicaltechnology，第四版，第8卷，第445-475页。

化合物的平均量可以根据化合物的结合性质(即，结合的亲和力、开始和持续时间)而变化，并且特别地应该基于有资质的医师的建议和处方。

在实践本公开内容的治疗方法中有用的治疗组合物可以包含以混合形式的药学上可接受的赋形剂(载体)和作为活性成分的如本文描述的npff受体调节剂中的一种或更多种。

npff受体配体可以通过多种方法施用。因此，通过口服途径有活性的那些本发明的产品可以以溶液、悬浮液、乳剂、片剂(包括舌下片剂和口内片剂)、软明胶胶囊(包括在软明胶胶囊中使用的溶液)、水悬浮液或油悬浮液、乳剂、丸剂、锭剂(lozenge)、锭剂(troche)、片剂、糖浆或酏剂以及类似形式施用。在肠胃外施用时有活性的npff受体调节剂可以通过贮库注射、包括silastic^tm和可生物降解植入物的植入物、皮肤贴剂、皮肤霜剂或肌肉内注射和静脉内注射施用。

包含npff受体调节剂的组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且这样的组合物可以含有选自由甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂组成的组的一种或更多种剂。包含与适合于制造片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂掺合的活性成分的片剂是可接受的。这些赋形剂可以为，例如，惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，诸如，玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，诸如，硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸附，并且从而提供在较长时间段内的持续作用。例如，可以使用延时材料诸如单独的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯或与蜡一起使用。

用于口服使用的制剂也可以作为硬明胶胶囊或作为软明胶胶囊来呈现，在硬明胶胶囊中活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，在软明胶胶囊中活性成分与水或油介质，诸如花生油(peanutoil)、液体石蜡或橄榄油混合。

本公开内容的水性悬浮液包含与适合于制造水性悬浮液的赋形剂掺合的活性材料。这样的赋形剂包括悬浮剂，诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基乙基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；以及分散剂或润湿剂诸如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物(例如，十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇)、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以包含一种或更多种防腐剂，诸如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或更多种着色剂，一种或更多种调味剂以及一种或更多种甜味剂诸如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。如本领域已知的，眼用制剂将关于渗透压来调节。

油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油，诸如，花生油(arachisoil)、橄榄油、芝麻油或椰子油中或者悬浮在矿物油诸如液体石蜡中来配制。油性悬浮液可以包含增稠剂，诸如，蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂诸如抗坏血酸来保存。

本公开内容的适合于通过添加水来制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒可以由与分散剂、悬浮剂和/或润湿剂以及一种或更多种防腐剂掺合的活性成分来配制。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂由上文公开的那些例示。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。

药物组合物还可以呈水包油乳剂的形式。油性相可以为植物油，诸如橄榄油或花生油、矿物油，诸如液体石蜡，或这些的混合物。合适的乳化剂包括天然存在的胶诸如阿拉伯树胶和黄蓍胶、天然存在的磷脂诸如大豆卵磷酯、衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯诸如脱水山梨糖醇单油酸酯、以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。

糖浆和酏剂可以用甜味剂诸如甘油、山梨糖醇或蔗糖来配制。这样的制剂还可以包含缓和剂(demulcent)、防腐剂、调味剂或着色剂。

药物组合物可以呈无菌可注射制剂的形式，诸如无菌可注射水性或油性悬浮液。该悬浮液可以使用上文已经提及的那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂根据已知的技术来配制。无菌可注射制剂也可以是在非毒性的、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，诸如1,3-丁二醇的溶液。可以被采用的可接受的媒介物(vehicle)和溶剂是水和ringer’s溶液、等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常可以被用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。此外，脂肪酸诸如油酸可以类似地用于制备可注射剂。灭菌可以通过本领域普通技术人员已知的常规方法来进行，诸如例如通过无菌过滤或辐照。

水性制剂(即，水包油乳剂、糖浆、酏剂和可注射制剂)可以被配制成达到最佳稳定性的ph。最佳ph的确定可以通过本领域普通技术人员已知的常规方法来进行。合适的缓冲液也可以用于保持制剂的ph。

npff受体调节剂还可以以用于直肠施用药物的栓剂的形式施用。这些组合物可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述非刺激性赋形剂在普通温度为固体但在直肠温度为液体，并且因此将在直肠中融化以释放药物。这样的材料的非限制性实例是可可脂和聚乙二醇。

它们也可以通过鼻内、眼内、阴道内和直肠内途径施用，包括栓剂、吹入剂、粉末和气雾剂制剂。

优选地通过局部途径施用的本文公开的产品可以作为涂抹棒、溶液、悬浮液、乳剂、凝胶、霜剂、软膏剂、糊剂、胶冻、涂料、粉末和气雾剂施用。

如果需要，组合物可以呈现于包装或分配器装置中，该包装或分配器装置可以包括含有活性成分的一个或多个单位剂型。还可以制备包含如本文描述的npff调节剂并且在相容的药物载体中配制的药物组合物，将该药物组合物置于合适的容器中，并且标记用于治疗指示的状况。

参考以下实施例进一步说明了本公开内容的优点和特征，所述实施例不应被解释为以任何方式限制本公开内容的范围，而被解释为本公开内容的实施方案的说明。

实施例：

化学过程。化合物10-48按照方案1中描绘的程序来合成。反式-4-羟基-l-脯氨酸甲酯(2)通过在1,2-二氯乙烷中的三乙酰氧基硼氢化钠经历还原胺化，以给出中间体3，然后该中间体3在二氯甲烷中的吡啶的存在下转化为甲苯磺酰化衍生物4。用叠氮化钠的sn2取代提供了叠氮化物5，该叠氮化物5随后与三苯基膦经历staudinger还原以给出胺6。第二次还原胺化分别产生了7a和7b。从甲苯磺酸酯4到胺7a-7b的这三步转化比用4-甲氧基苄胺或4-(甲基硫代)苄胺的直接置换给出了更高的收率。然后用boc基团保护游离氨基基团，并且产生的中间体8a-8b随后在碱性条件下被水解以给出酸9a-9b。hbtu辅助的在9a-9b和相应的胺之间的酰胺偶联、随后boc保护基团的裂解提供了最终产物(10-48)。所有目标化合物通过¹h和¹³cnmr、ms和hplc来表征。

方案1.化合物10–48的合成。

方案1的试剂和条件如下：(a)2-氯苯甲醛、na(oac)3bh、1,2-dce(1,2-二氯乙烷)、室温(rt)、24h(b)tscl、吡啶、dcm(二氯甲烷)、室温、24h(c)nan3、dmf、70℃、16h(d)pph3、thf、h2o、回流、16h(e)4-meophcho或4-mesphcho、na(oac)3bh、1,2-dce、室温、24h(f)boc2o、na2co3水溶液、1,4-二噁烷、室温、16h(g)lioh水溶液、meoh、室温、16h(h)相应的胺、hbtu、diea、dmf、室温、24h(i)tfa、dcm、室温、1h。

化合物52-64经由略微不同的途径(方案2)获得。将酯3水解以给出酸49。hbtu辅助的49与4-硝基苯乙胺的酰胺偶联产生了中间体50。将50转化为甲苯磺酰化衍生物51，然后经历用相应的胺的sn2置换，以给出最终产物52-64。在添加更多胺当量后，该sn2取代的低收率得到改善。然而，过量的未反应的胺使最终产物的纯化变得复杂。

方案2.化合物52-64的合成。

方案2的试剂和条件如下：(a)lioh水溶液、meoh、室温、16h(b)4-no2ch2ch2phnh2、hbtu、diea、dmf、室温、24h(c)tscl、吡啶、dcm、室温、24h(d)相应的胺、et3n、thf、回流、24h。

方案3图示出了化合物74-88的合成。反式-4-羟基-l-脯氨酸甲酯(5)被n-boc保护作为中间体65，并且转化为4-甲苯磺酰基衍生物66，该4-甲苯磺酰基衍生物66经历用叠氮化钠的sn2置换(67)和staudinger还原以提供中间体68。通过三乙酰氧基硼氢化钠用4-甲氧基苯甲醛的还原胺化给出了仲胺69，仲胺69随后用n-troc保护基团保护作为中间体70。水解甲酯(71)，随后为hbtu辅助的与苯乙胺的酰胺偶联产生中间体72。通过tfa去除n-boc基团产生了中间体73，该中间体73用于制备区域3的一系列类似物。这些类似物(74–88)通过73与相应的醛的还原胺化和在回流下在甲醇中的乙酸的存在下通过zn去除n-troc基团来获得。

方案3.化合物74–88的合成

方案3的试剂和条件如下：(a)boc2o、naoh水溶液、1,4-二噁烷、0℃至室温、16h(b)tscl、吡啶、dcm、0℃至回流、16h(c)nan3、dmf、70℃、16h(d)pph3、thf、h2o、回流、16h(e)4-omephcho、na(oac)3bh、1,2-dce、室温、24h(f)troccl、et3n、dcm、室温、16h(g)lioh水溶液、meoh、室温、3h(h)phch2ch2nh2、hbtu、diea、dcm、室温、24h(i)tfa、dcm、室温、2h(j)相应的醛、na(oac)3bh、acoh、1,2-dce、室温、48h(k)zn、acoh、meoh、回流、1h。

实验部分

化学过程。所有溶剂和化学品是试剂级的。除非另外提及，否则所有试剂和溶剂都购自商业供应商并且按原样使用(usedasreceived)。使用预填充的柱在teledyneiscocombiflashrf系统上进行快速柱色谱法。所使用的溶剂包括己烷、乙酸乙酯(etoac)、二氯甲烷、甲醇以及氯仿/甲醇/氢氧化铵(80:18:2)(cma-80)。化合物的纯度和表征通过hplc、tlc、质谱法和nmr分析的组合来建立。¹h和¹³cnmr谱在brukeravancedpx-300(300mhz)光谱仪上记录，并且在cdcl3、dmso-d6或cd3od中确定，用四甲基硅烷(tms)(0.00ppm)或溶剂峰作为内部参考。化学位移相对于参考信号以ppm计被报告，并且耦合常数(j)值以赫兹(hz)计被报告。在emd预涂覆的硅胶60f254板上进行薄层色谱法(tlc)，并且用uv光或碘染色使斑点可视化。低分辨率质谱使用watersallianceht/micromasszq系统(esi)获得。如在agilent1100系统上，使用agilentzorbaxsb-phenyl，2.1mm×150mm，5μm柱，使用流动相(a)含有0.1％cf3cooh的h2o和(b)mecn以1.0ml/min的流速的梯度洗脱，通过hplc确定的，所有测试化合物的纯度大于95％。

(2s,4r)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-羟基吡咯烷-2-羧酸甲酯(3)。向在1,2-二氯乙烷(55ml)中的甲基反式-4-羟基-l-脯氨酸(16.5mmol，3.00g)和2-氯苯甲醛(21.5mmol，2.1ml)的溶液中添加乙酸(0.9ml)和三乙酰氧基硼氢化钠(24.8mmol，5.26g)。将反应物在室温搅拌持续24h。用饱和碳酸氢钠溶液猝灭之后，将反应混合物用二氯甲烷提取三次。将合并的有机层顺序地用水和盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化以给出作为黄色液体的期望的产物(4.00g，90％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.44(dd,j＝1.98,7.44hz,1h),7.34(m,1h),7.20(m,2h),4.43(m,1h),3.92(m,2h),3.63-3.74(m,4h),3.35(dd,j＝5.56,10.08hz,1h),2.52(dd,j＝3.58,10.17hz,1h),2.24(m,1h),2.12(m,1h)。ms(esi)[m]⁺270.2。

(2s,4r)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-[(4-甲基苯磺酰基)氧基]吡咯烷-2-羧酸甲酯(4)。在0℃，向在吡啶(11.4ml)和无水二氯甲烷(11.4ml)中的13821-125(14.8mmol，4.00g)的溶液中逐滴添加甲苯磺酰氯(17.8mmol，3.39g)。将反应物回流持续24h。在真空中去除溶剂之后，将残余物溶解在二氯甲烷中，并且用饱和硫酸铜、水和盐水洗涤。合并的有机层经无水硫酸镁干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(硅胶，乙酸乙酯/己烷)，以提供作为无色液体的期望的产物(3.77g，60％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.74-7.79(m,2h),7.37-7.46(m,1h),7.28-7.35(m,3h),7.17-7.23(m,2h),5.01(d,j＝5.46hz,1h),3.74-4.04(m,2h),3.69(s,1h),3.66(s,3h),3.29(dd,j＝6.03,11.11hz,1h),2.67-2.73(m,1h),2.44(s,3h),2.28(dd,j＝5.46,7.54hz,2h)。ms(esi)[m]⁺424.2。

(2s,4s)-4-叠氮基-1-[(2-氯苯基)甲基]吡咯烷-2-羧酸甲酯(5)。向在dmf(40ml)中的4(6.87mmol，2.91g)的溶液中添加叠氮化钠(13.74mmol，0.89g)。在65℃搅拌持续16h之后，将反应混合物用水稀释，并且用乙酸乙酯提取三次。合并的有机层经无水硫酸镁干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(sio2，己烷/乙酸乙酯)，以给出作为黄色液体的期望的产物(1.47g，73％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.54(dd,j＝1.70,7.54hz,1h),7.34(dd,j＝1.51,7.72hz,1h),7.16-7.29(m,2h),4.02-4.09(m,1h),3.90-3.98(m,1h),3.81-3.87(m,1h),3.72(s,3h),3.45(dd,j＝6.03,9.23hz,1h),3.13(dd,j＝1.51,10.36hz,1h),2.71(dd,j＝5.75,10.27hz,1h),2.54(ddd,j＝7.72,9.23,14.13hz,1h),2.12-2.21(m,j＝0.90,3.20,6.10,14.10hz,1h)ms(esi)[m]⁺295.1。

(2s,4s)-4-氨基-1-[(2-氯苯基)甲基]吡咯烷-2-羧酸甲酯(6)。在氮气下向在thf(19ml)中的叠氮化物5(4.3mmol，1.27g)的溶液中添加pph3(8.6mmol，2.26g)和水(0.2ml)。将反应混合物在搅拌下回流持续6h。在去除溶剂之后，将残余物溶解在乙醚中，用0.1nhcl处理持续5min，并且然后用乙醚提取两次。然后将水层用1nnaoh处理直至ph10，并且然后用二氯甲烷提取。合并的二氯甲烷级分经无水mgso4干燥，在真空中浓缩，以提供作为黄色液体的期望的产物(1g，86％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.50(dd,j＝1.9,7.54hz,1h),7.33(m,1h),7.16-7.20(m,2h),3.95(d,j＝14.7hz,1h),3.81(d,j＝13.9hz,1h),3.66(s,3h),3.45(m,1h),3.39(dd,j＝5.5,9.6hz,1h),2.85(m,1h),2.68(dd,j＝5.5,9.4hz,1h),2.48(m,1h),1.79(m,1h),1.74(br,2h)。ms(esi)[m+h]⁺:269.3。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酸甲酯(7a)。向在1,2-二氯乙烷(12.4ml)中的胺6(3.72mmol，1g)的溶液中添加4-甲氧基苯甲醛(3.72mmol，0.45ml)、三乙酰氧基硼氢化钠(5.58mmol，1.18g)和冰乙酸(3.72mmol，0.21ml)。在室温搅拌持续16h之后，将反应用饱和碳酸氢钠猝灭，用二氯甲烷提取三次。合并的有机层经无水硫酸镁干燥，过滤，并且在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法纯化(sio2，二氯甲烷/甲醇)，以给出作为无色液体的期望的产物(0.68g，47％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.49(dd,j＝1.79,7.44hz,1h),7.33(m,1h),7.16-7.25(m,4h),6.84(m,2h),3.95(d,j＝14.30hz,1h),3.78-3.84(m,4h),3.67(d,j＝3.20hz,5h),3.39(dd,j＝6.03,9.04hz,1h),3.28(m,1h),3.03(dd,j＝2.54,9.51hz,1h),2.61(dd,j＝6.12,9.51hz,1h),2.40(m,1h),1.93(m,1h)。ms(esi)[m+h]⁺389.4。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-(甲基氢硫基)苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酸甲酯(7b)根据用于合成7a的程序，由6和4-(甲基硫代)苯甲醛合成，作为黄色液体(45％收率)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.42(br.s.,0h),7.32(d,j＝6.78hz,0h),7.13-7.24(m,6h),3.90(d,j＝7.91hz,1h),3.66(s,3h),3.64(br.s.,1h),3.22-3.30(m,1h),2.87-2.97(m,1h),2.47-2.50(m,2h),2.46(s,3h),2.02-2.12(m,1h)。ms(esi)[m+h]⁺405.3。

(2s,4s)-4-{[(叔丁氧基)羰基][(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-1-[(2-氯苯基)甲基]吡咯烷-2-羧酸甲酯(8a)。向在1,4-二噁烷(10ml)中胺7(1.75mmol，0.68g)的溶液中添加10％w/vna2co3溶液(2ml)和boc2o(1.92mmol，0.42g)。在室温搅拌持续16h之后，在减压下去除1,4-二噁烷。将剩余的水溶液用二氯甲烷提取三次。合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤，并且在真空中浓缩，并且粗制品在不经进一步纯化的情况下用于下一步骤。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.30-7.38(m,2h),7.16-7.22(m,2h),7.06(d,j＝8.67hz,2h),6.80(d,j＝8.67hz,2h),4.47-4.63(m,1h),4.26-4.44(m,2h),3.83(d,j＝6.97hz,2h),3.78(s,3h),3.65(s,3h),3.61(d,j＝6.97hz,1h),3.06(t,j＝8.29hz,1h),2.67(dd,j＝7.44,8.95hz,1h),2.13-2.25(m,2h),1.53(s,9h)。ms(esi)[m]⁺489.6。

(2s,4s)-4-{[(叔丁氧基)羰基][(4-(甲基氢硫基)苯基)甲基]氨基}-1-[(2-氯苯基)甲基]吡咯烷-2-羧酸甲酯(8b)根据用于合成8a的程序，由7b合成，作为黄色液体(定量收率)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)d7.34(d,j＝6.22hz,1h),7.26-7.32(m,1h),7.08-7.19(m,4h),7.01-7.06(m,2h),4.79-5.03(m,1h),4.58(s,2h),3.91(d,j＝13.75hz,1h),3.64(s,3h),3.58(d,j＝13.94hz,1h),3.27(t,j＝8.29hz,1h),2.87-2.96(m,1h),2.49-2.60(m,2h),2.45(s,3h),1.87-1.99(m,1h),1.34(s,9h)。ms(esi)[m]⁺505.6。

(2s,4s)-4-{[(叔丁氧基)羰基][(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-1-[(2-氯苯基)甲基]吡咯烷-2-羧酸(9a)。向在甲醇(16ml)和水(16ml)中的酯8(1.75mmol，0.86g)的溶液中添加lioh(8.75mmol，0.21g)。在室温搅拌持续3h之后，在减压下去除甲醇。将剩余的溶液在水中稀释，并且用1nhcl酸化至ph5。然后将混合物用乙酸乙酯提取。合并的有机层用水和盐水洗涤，经无水mgso4干燥，过滤，并且在真空中浓缩，以提供作为白色固体的期望的产物(0.83g，定量收率)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.35(d,j＝8.10hz,2h),7.17-7.24(m,2h),7.02(d,j＝8.48hz,2h),6.77(d,j＝8.48hz,2h),4.26-4.55(m,3h),4.06-4.17(m,1h),3.71-3.82(m,4h),3.40-3.52(m,1h),3.08(d,j＝6.40hz,1h),2.70-2.82(m,1h),2.44-2.58(m,1h),2.07-2.17(m,1h),1.40(s,9h)。ms(esi)[m]⁺475.7,[m-h]^-473.8。

(2s,4s)-4-{[(叔丁氧基)羰基][(4-(甲基氢硫基)苯基)甲基]氨基}-1-[(2-氯苯基)甲基]吡咯烷-2-羧酸(9b)根据用于合成9a的程序，由8b合成，作为白色固体(定量收率)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)d7.42(br.s.,1h),7.34(d,j＝7.72hz,1h),7.16-7.26(m,2h),7.13(d,j＝8.10hz,2h),7.02(d,j＝8.10hz,2h),4.47-4.61(m,1h),4.31-4.46(m,2h),4.23(d,j＝10.93hz,1h),3.77-3.88(m,1h),3.58(d,j＝10.74hz,1h),3.02-3.13(m,1h),2.81(d,j＝10.36hz,1h),2.52-2.66(m,1h),2.44(s,3h),2.06-2.17(m,1h),1.38(s,8h)。ms(esi)[m-h]^-489.5。

一般程序a：向在dmf(0.6ml，0.3m)中的酸9(0.2mmol，1当量)的溶液中添加hbtu(0.22mmol，1.1当量)、相应的胺(0.22mmol，1.1当量)、diea(0.66mmol，3当量)。在室温搅拌持续16h之后，将反应混合物用水稀释，用乙酸乙酯提取三次。合并的有机级分经无水硫酸镁干燥，并且在真空中浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷中的20％v/v三氟乙酸(1ml)中，并且在室温搅拌持续16h。将反应混合物在减压下浓缩，并且将残余物通过柱色谱法纯化(sio2，甲醇/二氯甲烷)，以提供期望的产物。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-甲基吡咯烷-2-羧酰胺(10)根据一般程序a被制备为黄色油状物(9％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.43(dd,j＝1.79,7.44hz,1h),7.28-7.34(m,2h),7.12-7.25(m,3h),6.87(s,2h),3.90-3.96(m,2h),3.75(s,3h),3.58-3.69(m,2h),3.28(s,2h),3.09(dd,j＝4.14,7.54hz,1h),2.68(d,j＝4.90hz,3h),2.43-2.59(m,1h),2.03-2.14(m,2h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)

173.3,160.5,134.4,133.9,131.4,131.0,129.6,129.0,127.1,114.6,66.2,55.6,55.2,54.9,54.8,53.6,42.0,33.5,11.8。ms(esi)[m]⁺388.3。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-乙基-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(11)根据一般程序a被制备为黄色油状物(32％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.41(br.s.,1h),7.30-7.38(m,2h),7.14-7.25(m,4h),6.84(d,j＝8.67hz,1h),3.83-3.91(m,1h),3.79(s,3h),3.58-3.73(m,3h),3.33(td,j＝2.80,5.89hz,1h),3.19-3.28(m,1h),3.10-3.19(m,2h),3.00(d,j＝9.98hz,1h),2.62(dd,j＝5.56,10.08hz,1h),2.49(ddd,j＝6.40,9.84,13.70hz,1h),1.87-1.97(m,1h),1.02(t,j＝14.70hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.9,158.9,135.7,134.3,131.1,129.7,129.5,128.9,126.9,113.9,67.1,59.5,57.4,56.2,55.3,51.1,37.0,33.7,14.6。ms(esi)[m]⁺402.2。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-丙基吡咯烷-2-羧酰胺(12)根据一般程序a被制备为黄色油状物(48％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.82(t,j＝5.27hz,1h),7.29-7.50(m,4h),7.24(d,j＝8.67hz,2h),6.85(d,j＝8.67hz,2h),4.26-4.46(m,3h),4.14(d,j＝13.00hz,2h),3.94-4.03(m,1h),3.78(s,3h),3.46(d,j＝5.09hz,2h),3.07-3.22(m,2h),2.88-3.02(m,1h),2.27-2.40(m,1h),1.42-1.54(m,2h),0.87(t,j＝7.44hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.0,158.9,135.7,134.1,131.0,129.7,129.6,128.8,126.9,113.9,67.1,59.2,57.2,56.1,55.3,51.0,40.7,36.8,22.7,11.4。ms(esi)[m]⁺416.5。

(2s,4s)-n-丁基-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(13)根据一般程序a被制备为黄色油状物(12％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.74(br.s.,1h),7.47(d,j＝7.72hz,1h),7.39-7.45(m,2h),7.34(dd,j＝2.07,7.16hz,1h),7.24(d,j＝8.67hz,2h),6.87(d,j＝8.29hz,2h),4.34-4.56(m,3h),4.19(d,j＝13.37hz,2h),3.99-4.07(m,1h),3.78(s,3h),3.56(d,j＝3.20hz,2h),3.13-3.27(m,2h),2.94-3.08(m,1h),2.33-2.46(m,1h),1.38-1.50(m,2h),1.29(dd,j＝6.97,14.88hz,2h),0.90(t,j＝7.25hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.2,159.8,135.1,133.9,130.8,130.6,129.6,128.8,127.0,114.3,66.7,57.2,55.8,55.5,55.2,49.6,39.0,34.8,31.4,20.0,13.6。ms(esi)[m]⁺430.1。

(2s,4s)-n-(丁-2-基)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(14)根据一般程序a被制备为无色油状物(74％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.29-7.39(m,3h),7.16-7.25(m,4h),6.83(d,j＝8.67hz,1h),3.87-3.94(m,1h),3.74-3.84(m,5h),3.61-3.72(m,3h),3.20-3.33(m,2h),2.97(td,j＝1.62,10.13hz,1h),2.60(ddd,j＝3.01,5.60,10.03hz,1h),2.45-2.54(m,1h),1.87-1.96(m,1h),1.76(br.s.,1h),1.29-1.39(m,2h),1.02(d,j＝6.59hz,2h),0.94(d,j＝6.59hz,2h),0.74-0.85(m,5h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.4,173.4,158.7,158.7,135.9,134.3,134.2,131.9,131.2,130.9,129.8,129.8,129.4,128.9,128.8,126.9,126.9,113.8,113.8,67.3,67.2,59.7,59.6,57.7,57.5,56.2,56.1,55.3,51.3,46.0,45.8,37.4,37.2,29.6,20.1,10.5,10.4。ms(esi)[m]⁺430.4。

(2s,4s)-n-叔丁基-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(15)根据一般程序a被制备为无色油状物(88％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.30-7.39(m,2h),7.15-7.25(m,5h),6.82-6.87(m,2h),3.76-3.82(m,5h),3.60-3.75(m,2h),3.28-3.36(m,1h),3.14(dd,j＝5.27,9.80hz,1h),3.06(d,j＝10.17hz,1h),2.64(dd,j＝5.65,9.98hz,1h),2.47(ddd,j＝6.40,9.80,13.56hz,1h),1.89(td,j＝3.67,13.56hz,1h),1.18(s,9h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.5,158.8,136.0,134.4,131.0,129.7,129.4,128.9,127.0,113.9,67.8,59.9,57.6,56.2,55.3,51.2,50.2,37.2,28.5。ms(esi)[m]⁺430.0。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-戊基吡咯烷-2-羧酰胺(16)根据一般程序a被制备为黄色油状物(25％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.32-7.43(m,3h),7.17-7.24(m,4h),6.81-6.86(m,2h),3.84-3.91(m,1h),3.78(s,3h),3.64-3.74(m,3h),3.31-3.38(m,1h),3.25(dd,j＝5.65,9.80hz,1h),2.99-3.16(m,3h),2.61(dd,j＝5.56,10.27hz,1h),2.48(dd,j＝2.83,6.78hz,1h),1.92(d,j＝18.08hz,1h),1.31-1.43(m,2h),1.16-1.30(m,4h),0.84(t,j＝6.97hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.9,158.9,135.7,134.1,130.9,129.7,129.6,128.8,126.9,113.9,67.1,59.2,57.2,56.1,55.3,51.0,38.9,36.8,29.1,29.1,22.3,13.9。ms(esi)[m]⁺444.4。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(3-甲基丁基)吡咯烷-2-羧酰胺(17)根据一般程序a被制备为无色油状物(71％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.23-7.34(m,3h),7.10-7.18(m,4h),6.76(d,j＝8.67hz,2h),3.77-3.83(m,1h),3.71(s,3h),3.57-3.67(m,3h),3.27(td,j＝2.87,5.93hz,1h),3.17(dd,j＝5.46,9.80hz,1h),3.05(dt,j＝7.72,12.90hz,2h),2.92-2.98(m,1h),2.54(dd,j＝5.65,10.17hz,1h),2.42(ddd,j＝6.59,9.80,13.75hz,1h),1.80-1.89(m,1h),1.44(td,j＝6.69,13.37hz,1h),1.16-1.23(m,2h),0.77(dd,j＝3.39,6.59hz,6h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ172.9,157.9,134.7,133.1,130.0,128.7,128.6,127.8,125.9,112.9,66.1,58.2,56.2,55.1,54.2,49.9,37.3,36.2,35.8,24.8,21.4。ms(esi)[m]⁺444.7。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-己基吡咯烷-2-羧酰胺(18)根据一般程序a被制备为无色油状物(49％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.45(t,j＝5.65hz,1h),7.31-7.38(m,2h),7.16-7.24(m,4h),6.81-6.85(m,2h),3.84-3.91(m,1h),3.79(s,3h),3.58-3.72(m,3h),3.31(td,j＝2.76,5.98hz,1h),3.25(dd,j＝5.56,9.89hz,1h),3.11(dt,j＝7.06,12.86hz,2h),3.00(d,j＝10.17hz,1h),2.60(dd,j＝5.56,10.08hz,1h),2.49(ddd,j＝6.50,9.84,13.61hz,1h),1.90(td,j＝3.84,13.61hz,2h),1.31-1.41(m,2h),1.17-1.29(m,6h),0.85(t,j＝13.40hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.0,158.8,135.8,134.2,131.8,131.0,129.7,129.4,128.8,126.9,113.9,67.2,59.6,57.4,56.2,55.2,51.2,38.9,37.2,31.5,29.4,26.6,22.5,14.0。ms(esi)[m]⁺458.0。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-癸基-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(19)根据一般程序a被制备为无色油状物(58％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.42(t,j＝5.75hz,1h),7.33-7.37(m,2h),7.16-7.25(m,5h),6.83(d,j＝8.67hz,1h),3.84-3.91(m,1h),3.78(s,3h),3.62-3.75(m,4h),3.33-3.40(m,1h),3.25(dd,j＝5.65,9.61hz,1h),2.90-3.16(m,6h),2.61(dd,j＝5.65,10.17hz,1h),2.49(ddd,j＝6.59,9.61,13.75hz,1h),1.89-1.97(m,1h),1.16-1.42(m,18h),0.85-0.90(m,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.9,159.0,135.7,134.1,130.9,129.7,129.7,128.8,127.0,114.0,67.1,59.1,57.1,56.1,55.3,50.9,39.0,36.7,31.9,29.6,29.5,29.5,29.3,27.0,22.7,14.1。ms(esi)[m]⁺514.8。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-[2-(吗啉-4-基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(20)根据一般程序a被制备为无色油状物(18％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.52(t,j＝5.27hz,1h),7.34-7.38(m,2h),7.18-7.25(m,4h),6.84(d,j＝8.67hz,2h),3.84-3.91(m,1h),3.74-3.78(m,4h),3.68-3.73(m,2h),3.59-3.65(m,4h),3.42(t,j＝7.72hz,1h),3.22-3.37(m,4h),2.35-2.45(m,7h),2.13-2.21(m,j＝1.00,1.00hz,2h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.5,159.2,135.6,134.2,130.9,129.8,129.7,128.9,126.9,114.0,66.8,66.4,57.4,57.3,55.4,55.2,53.4,51.4,36.7,35.3,30.9。ms(esi)[m]⁺487.6。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-(2-环己基乙基)-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(21)根据一般程序a被制备为无色油状物(53％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.32-7.41(m,3h),7.15-7.25(m,4h),6.84(d,j＝8.67hz,2h),3.83-3.90(m,1h),3.79(s,3h),3.59-3.73(m,3h),3.32(td,j＝2.80,5.89hz,1h),3.25(dd,j＝5.56,9.70hz,1h),3.08-3.19(m,2h),3.02(d,j＝10.17hz,1h),2.60(dd,j＝5.65,9.98hz,1h),2.49(ddd,j＝6.50,9.80,13.66hz,1h),1.86-1.95(m,1h),1.56-1.70(m,5h),1.08-1.30(m,6h),0.76-0.93(m,2h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.9,158.8,135.8,134.1,130.9,129.7,129.5,128.8,126.9,113.9,67.2,59.4,57.3,56.2,55.2,51.1,37.0,36.8,36.7,35.3,33.1,33.1,30.9,26.5,26.2。ms(esi)[m]⁺484.4。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n,n-二乙基-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(22)根据一般程序a被制备为无色油状物(11％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.78(br.s.,1h),7.46(dd,j＝2.26,6.97hz,1h),7.33-7.38(m,1h),7.16-7.25(m,4h),6.80-6.88(m,2h),3.83-3.91(m,1h),3.79(s,3h),3.64-3.76(m,3h),3.16-3.36(m,4h),3.03(d,j＝9.61hz,1h),2.43-2.61(m,7h),1.79-2.05(m,3h),0.96(t,j＝7.06hz,6h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.2,158.8,135.8,134.0,130.8,129.5,129.4,128.6,126.9,113.9,67.2,56.8,56.1,55.3,51.5,51.2,46.6,37.3,36.2,11.1。ms(esi)[m]⁺473.5。

(2s,4s)-n-苄基-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(23)根据一般程序a被制备为黄色油状物(44％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.82(t,j＝5.75hz,1h),7.22-7.27(m,5h),7.10-7.21(m,6h),6.77-6.83(m,2h),4.32(dd,j＝5.93,8.95hz,2h),3.87(d,j＝13.19hz,1h),3.77(s,3h),3.58-3.71(m,3h),3.34-3.41(m,1h),3.31(dd,j＝5.56,9.70hz,1h),2.98(d,j＝10.36hz,1h),2.60(dd,j＝5.46,10.36hz,1h),2.49(ddd,j＝6.78,9.70,13.85hz,1h),1.92-2.02(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.9,159.1,138.3,135.4,134.1,131.0,129.7,129.7,128.8,128.6,127.8,127.3,126.9,114.0,67.0,58.7,56.9,56.0,55.3,50.7,43.1,36.3。ms(esi)[m]⁺464.4。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(24)根据一般程序a被制备为黄色油状物(59％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.52(t,j＝5.84hz,1h),7.32-7.37(m,1h),7.09-7.24(m,11h),6.83(d,j＝8.67hz,1h),3.73-3.81(m,4h),3.63-3.67(m,1h),3.56-3.62(m,2h),3.43-3.55(m,1h),3.30-3.42(m,1h),3.19-3.28(m,2h),2.92(d,j＝10.17hz,1h),2.67-2.76(m,2h),2.42-2.55(m,2h),1.96(br.s.,1h),1.81(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.1,158.7,138.9,135.8,134.1,132.0,130.7,129.6,129.4,128.7,128.6,128.5,126.9,126.4,113.9,67.3,59.5,57.2,56.0,55.3,51.2,39.8,37.3,35.5。ms(esi)[m]⁺478.4。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(3-苯丙基)吡咯烷-2-羧酰胺(25)根据一般程序a被制备为无色油状物(70％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.44(t,j＝5.37hz,1h),7.13-7.36(m,10h),7.09(d,j＝6.78hz,1h),6.80(d,j＝8.67hz,2h),3.83-3.90(m,1h),3.75(s,3h),3.66-3.73(m,3h),3.34-3.41(m,1h),3.25(dd,j＝5.56,9.70hz,1h),3.11-3.20(m,2h),3.05(d,j＝10.55hz,1h),2.43-2.64(m,4h),1.96(d,j＝3.20hz,1h),1.65-1.77(m,2h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.9,159.1,141.5,135.6,134.1,130.9,129.8,129.7,128.9,128.4,128.3,127.0,125.9,114.0,67.0,58.9,56.9,56.0,55.2,50.8,38.6,36.5,33.2,31.1。ms(esi)[m]⁺492.7。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(26)根据一般程序a被制备为无色油状物(20％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.40(t,j＝5.65hz,1h),7.32-7.36(m,1h),7.15-7.22(m,4h),7.10-7.14(m,1h),7.05(d,j＝8.67hz,2h),6.85(d,j＝8.67hz,2h),6.77(d,j＝8.48hz,2h),3.78(s,3h),3.75(s,3h),3.70-3.73(m,1h),3.65(d,j＝9.04hz,2h),3.42-3.52(m,1h),3.37(dd,j＝5.65,9.61hz,1h),3.23-3.32(m,1h),3.10-3.22(m,2h),2.67(dt,j＝3.30,7.02hz,2h),2.25(t,j＝8.01hz,1h),2.01-2.16(m,2h),1.40-1.68(m,2h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.8,158.8,158.2,135.7,134.2,132.1,131.0,130.9,129.6,129.6,129.2,128.8,126.9,114.0,113.9,66.7,60.1,57.8,56.1,55.3,55.2,52.1,40.0,37.9,34.8,30.9。ms(esi)[m]⁺508.6。

(2s,4s)-n-[2-(4-氯苯基)乙基]-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(27)根据一般程序a被制备为无色油状物(55％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.46(t,j＝5.93hz,1h),7.27-7.31(m,1h),7.08-7.25(m,7h),7.00-7.04(m,2h),6.81-6.86(m,2h),3.75-3.80(m,0h),3.73(s,3h),3.68(d,j＝13.19hz,2h),3.53-3.60(m,1h),3.31-3.50(m,3h),3.18(dd,j＝6.78,9.04hz,1h),3.08(d,j＝10.93hz,1h),2.69(q,j＝7.03hz,2h),2.42-2.55(m,2h),1.92(dt,j＝3.20,7.06hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.1,159.8,137.2,134.9,133.7,132.1,130.6,130.2,130.0,129.6,128.7,128.5,126.9,114.3,67.1,57.3,55.8,55.2,55.2,49.7,39.7,34.9,34.7。ms(esi)[m]⁺512.4。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(3,4-二甲氧基苯基)乙基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(28)根据一般程序a被制备为白色固体(61％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.29-7.35(m,1h),7.18-7.25(m,3h),7.09-7.15(m,2h),6.82(d,j＝8.67hz,2h),6.68(s,3h),3.63-3.88(m,13h),3.45-3.60(m,3h),3.28-3.41(m,1h),3.12-3.20(m,2h),2.70(qd,j＝7.21,14.93hz,2h),2.43-2.58(m,2h),1.99(ddd,j＝3.49,6.26,13.99hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ172.6,160.3,148.9,147.6,134.6,133.6,131.2,131.1,130.4,129.5,128.7,126.9,120.6,114.5,111.8,111.1,66.8,56.0,55.8,55.2,55.0,54.9,48.9,40.1,34.8,33.8。ms(esi)[m]⁺538.4。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-{2-[4-(二甲基氨基)苯基]乙基}-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(29)根据一般程序a被制备为黄色油状物(25％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.30-7.34(m,1h),7.15-7.25(m,5h),6.98(d,j＝8.67hz,2h),6.84(d,j＝8.67hz,2h),6.59(d,j＝8.48hz,2h),3.62-3.81(m,7h),3.33-3.45(m,3h),3.20(dd,j＝5.46,9.42hz,1h),3.05(d,j＝10.36hz,1h),2.86(s,6h),2.53-2.69(m,3h),2.40-2.51(m,1h),1.91(d,j＝13.56hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.7,159.3,149.4,135.4,133.9,130.8,130.1,129.5,129.2,128.6,126.9,126.5,114.1,112.9,66.8,58.2,56.1,55.8,55.3,50.3,40.7,40.3,35.8,34.4。ms(esi)[m]⁺521.8。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-乙酰胺基苯基)乙基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(30)根据一般程序a被制备为无色液体(50％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.44(br.s.,1h),7.67(t,j＝5.75hz,1h),7.37(dd,j＝1.60,7.44hz,1h),7.23-7.31(m,6h),7.11-7.21(m,2h),7.03(d,j＝8.29hz,2h),6.86(d,j＝8.67hz,2h),3.84(s,2h),3.76(s,3h),3.62-3.74(m,2h),3.39-3.48(m,2h),3.34(td,j＝6.31,12.62hz,1h),3.11-3.23(m,2h),2.66-2.75(m,2h),2.54(dd,j＝5.56,11.02hz,1h),2.28-2.41(m,1h),2.07(s,3h),1.76(d,j＝14.32hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.1,168.9,160.1,136.1,134.5,134.5,133.5,130.9,130.5,129.2,129.0,128.5,126.8,120.6,114.3,65.6,55.0,54.8,54.4,53.5,48.7,39.8,34.4,33.7,23.9。ms(esi)[m]⁺535.6。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-{2-[4-(甲基氨基甲酰基)苯基]乙基}吡咯烷-2-羧酰胺(31)根据一般程序a被制备为无色油状物(28％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)d7.75(t,j＝5.84hz,1h),7.53(d,j＝8.10hz,2h),7.37(dd,j＝2.17,6.88hz,1h),7.22(d,j＝8.67hz,2h),7.09-7.18(m,4h),6.82(d,j＝8.48hz,3h),3.86(d,j＝2.45hz,2h),3.71-3.77(m,3h),3.57-3.68(m,2h),3.33-3.54(m,3h),3.12-3.23(m,2h),3.06(q,j＝7.41hz,1h),2.89(d,j＝4.71hz,3h),2.74-2.83(m,2h),2.38-2.55(m,2h),1.94(dd,j＝3.58,14.13hz,1h),1.34-1.45(m,5h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d173.0,168.3,160.4,142.5,134.7,133.6,132.7,131.3,130.5,129.5,128.8,128.7,127.1,114.5,66.5,55.2,54.9,54.7,53.7,48.9,42.0,39.8,35.0,33.8,26.7,11.8。ms(esi)[m]⁺535.5。

(2s,4s)-n-[2-(4-叔丁基苯基)乙基]-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(32)根据一般程序a被制备为无色油状物(36％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.51(br.s.,1h),7.31-7.36(m,1h),7.14-7.25(m,8h),7.05(d,j＝8.29hz,2h),6.83(d,j＝8.67hz,2h),3.75-3.83(m,5h),3.57-3.67(m,3h),3.40-3.50(m,1h),3.30-3.39(m,1h),3.20-3.26(m,2h),2.92(d,j＝10.17hz,1h),2.67(q,j＝7.03hz,2h),2.41-2.56(m,2h),1.80-1.89(m,1h),1.26(s,9h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.1,158.7,149.2,135.8,135.8,134.1,132.1,130.9,129.6,129.3,128.7,128.3,126.9,125.4,113.8,67.2,59.6,57.2,56.1,55.2,51.2,39.9,37.3,35.1,34.3,31.3。ms(esi)[m]⁺534.3。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-{[(4-硝基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(33)根据一般程序a被制备为黄色油状物(22％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.06(d,j＝8.67hz,2h),7.45-7.51(m,1h),7.31-7.36(m,1h),7.27(s,1h),7.13-7.26(m,6h),6.82-6.89(m,2h),3.79(s,3h),3.62-3.74(m,4h),3.34-3.53(m,3h),3.11-3.22(m,2h),2.83(dt,j＝2.92,6.92hz,2h),2.22-2.33(m,1h),2.08(t,j＝7.54hz,2h),1.46-1.72(m,2h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.1,158.9,146.7,146.7,135.5,134.1,130.9,129.7,129.5,129.2,129.0,128.8,127.0,123.7,113.9,66.6,60.1,58.1,55.9,55.3,52.0,39.2,37.8,35.6。ms(esi)[m]⁺523.7。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(3,4-二氟苯基)乙基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(34)根据一般程序a被制备为白色固体(62％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.55(t,j＝6.03hz,1h),7.29(d,j＝2.26hz,1h),7.11-7.25(m,5h),6.88-6.96(m,2h),6.75-6.86(m,3h),3.72-3.79(m,4h),3.54-3.71(m,3h),3.30-3.47(m,3h),3.19(dd,j＝6.69,9.14hz,1h),3.07(d,j＝10.93hz,1h),2.67(q,j＝6.91hz,2h),2.43-2.56(m,2h),1.94(dd,j＝3.11,6.50hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.2,159.7,135.8,135.0,133.7,130.5,130.2,129.6,128.7,126.9,124.5,124.5,124.4,124.4,117.5,117.2,117.1,116.9,114.2,67.2,57.6,56.0,55.3,55.2,49.8,39.6,38.6,35.1,34.5。ms(esi)[m]⁺514.5。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-氟苯基)乙基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(35)根据一般程序a被制备为无色油状物(74％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.38(t,j＝5.84hz,1h),7.16-7.26(m,4h),7.01-7.12(m,4h),6.77-6.86(m,4h),3.73-3.87(m,2h),3.70(s,3h),3.60-3.67(m,1h),3.47-3.58(m,3h),3.24-3.37(m,1h),3.10-3.21(m,2h),2.63-2.81(m,2h),2.44-2.56(m,2h),1.93-2.04(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ172.3,160.5,134.4,134.3,134.3,133.5,131.4,130.0,129.9,129.5,128.6,126.9,121.8,115.3,115.0,114.5,67.1,55.8,55.2,54.9,54.6,48.7,40.1,34.4,33.4。ms(esi)[m]⁺496.7。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-{2-[4-(三氟甲基)苯基]乙基}吡咯烷-2-羧酰胺(36)根据一般程序a被制备为黄色油状物(69％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.54(t,j＝5.84hz,1h),7.43(d,j＝8.10hz,2h),7.32(dd,j＝1.88,7.35hz,1h),7.14-7.24(m,7h),6.81-6.86(m,2h),3.73-3.80(m,4h),3.57-3.70(m,3h),3.38-3.48(m,2h),3.29-3.36(m,1h),3.23(dd,j＝5.84,9.80hz,1h),3.00(s,1h),2.71-2.81(m,2h),2.42-2.58(m,2h),1.80-1.90(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.0,159.0,143.0,135.5,134.0,130.6,129.6,129.0,128.8,126.9,125.4,125.3,114.0,67.1,59.0,57.0,56.0,55.2,50.9,39.5,36.7,35.4。ms(esi)[m]⁺546.7。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-[2-(吡啶-4-基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(37)根据一般程序a被制备为白色固体(73％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.34(d,j＝5.84hz,2h),7.65(t,j＝5.93hz,1h),7.24-7.33(m,3h),7.20(d,j＝8.67hz,2h),7.10-7.15(m,2h),7.05(d,j＝6.03hz,2h),6.82(d,j＝8.67hz,2h),3.75-3.86(m,2h),3.67(br.s.,5h),3.50(quin,j＝6.83hz,2h),3.35-3.44(m,1h),3.10-3.20(m,2h),2.76(dt,j＝2.83,7.06hz,2h),2.44-2.57(m,2h),1.93(ddd,j＝2.73,7.16,14.22hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ172.7,160.3,149.4,148.3,134.5,133.6,131.2,130.2,129.6,128.7,126.9,124.2,114.5,67.1,56.2,55.2,54.8,49.1,38.9,34.6,34.0。ms(esi)[m]⁺479.3。

(2s,4s)-n-[2-(4-乙酰基苯基)乙基]-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(38)根据一般程序a被制备为无色液体(35％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.65-7.72(m,2h),7.35-7.42(m,1h),7.18-7.24(m,3h),7.05-7.16(m,4h),6.83(d,j＝8.67hz,2h),3.78-3.89(m,2h),3.66-3.74(m,4h),3.48-3.61(m,3h),3.37(d,j＝5.65hz,1h),3.18(d,j＝8.10hz,2h),2.74-2.87(m,2h),2.43-2.60(m,2h),2.18(d,j＝5.84hz,3h),1.93-2.06(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ172.4,160.5,157.6,140.4,136.6,134.4,133.7,131.5,130.5,129.5,128.7,128.6,127.0,126.7,121.7,114.6,66.9,55.5,55.2,54.7,54.2,48.6,40.0,35.1,33.4,14.8。ms(esi)[m]⁺519.5。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-甲磺酰基苯基)乙基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(39)根据一般程序a被制备为无色油状物(55％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.75(d,j＝8.29hz,2h),7.64(t,j＝5.93hz,1h),7.25-7.35(m,5h),7.16-7.22(m,4h),6.81-6.86(m,2h),3.76(s,3h),3.59-3.74(m,4h),3.42(q,j＝6.97hz,2h),3.32-3.37(m,1h),3.23(dd,j＝5.84,9.61hz,1h),3.01(d,j＝1.70hz,1h),2.98(s,3h),2.79(qd,j＝6.99,14.46hz,2h),2.55(dd,j＝5.65,10.55hz,1h),2.41-2.50(m,1h),1.81-1.91(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.0,159.2,145.6,138.7,135.4,133.9,130.7,129.9,129.7,129.6,128.9,127.5,127.0,114.1,67.0,58.6,56.7,55.9,55.3,50.7,44.5,39.5,36.3,35.5。ms(esi)[m]⁺557.1。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n,n-二乙基-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(40)根据一般程序a被制备为黄色油状物(54％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.37-7.44(m,3h),7.31-7.35(m,1h),7.18-7.23(m,2h),6.87-6.93(m,2h),4.09(d,j＝2.07hz,2h),3.91-4.00(m,3h),3.82-3.86(m,1h),3.81(s,3h),3.39-3.51(m,2h),3.18-3.29(m,1h),2.88-3.08(m,3h),2.36-2.48(m,1h),2.14(d,j＝14.69hz,1h),1.04(t,j＝7.25hz,3h),0.97(t,j＝7.16hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.0,160.3,135.1,133.6,131.3,130.7,129.5,128.8,127.1,123.1,114.6,59.0,56.7,56.4,55.3,54.3,48.5,42.4,41.6,33.7,15.0,12.8。ms(esi)[m]⁺430.4。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n,n-二丙基吡咯烷-2-羧酰胺(41)根据一般程序a被制备为无色油状物(63％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.55(dd,j＝1.70,7.54hz,1h),7.13-7.34(m,6h),6.85(d,j＝8.48hz,2h),3.73-3.92(m,7h),3.70(dd,j＝4.52,8.85hz,1h),3.44(d,j＝5.84hz,1h),2.99-3.35(m,6h),2.81(dd,j＝6.03,9.61hz,1h),2.40(td,j＝8.34,13.28hz,1h),1.80-1.89(m,1h),1.43-1.57(m,4h),0.86(dt,j＝4.52,7.44hz,6h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.4,158.9,136.4,133.6,130.8,129.7,129.2,128.1,126.8,113.9,60.9,58.3,56.3,55.3,53.9,50.7,49.4,48.3,36.3,22.8,20.9,11.4,11.2。ms(esi)[m]⁺458.2。

(3s,5s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[(4-甲氧基苯基)甲基]-5-(4-苯基哌嗪-1-羰基)吡咯烷-3-胺(42)根据一般程序a被制备为无色油状物(23％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.45(dd,j＝1.79,7.44hz,1h),7.27-7.39(m,5h),7.14-7.25(m,2h),6.84-6.95(m,5h),3.90-3.99(m,4h),3.85(dd,j＝3.49,9.14hz,1h),3.80(s,3h),3.77(s,1h),3.54-3.71(m,3h),3.46(br.s.,1h),3.35(d,j＝10.55hz,1h),2.88-3.10(m,5h),2.37-2.49(m,1h),2.06(d,j＝14.13hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ172.6,159.7,150.7,135.4,133.7,130.9,130.6,129.6,129.3,128.8,127.0,120.7,116.6,114.3,57.5,56.4,55.3,54.6,49.7,49.6,49.3,45.6,42.2,34.7。ms(esi)[m]⁺519.8。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-乙基-4-{[(4-(甲基硫代)苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(43)根据一般程序a被制备为无色油状物(52％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)d7.45(br.s.,1h),7.37(dd,j＝3.67,5.56hz,1h),7.29-7.33(m,1h),7.23(dd,j＝3.58,5.84hz,2h),7.16-7.21(m,4h),3.83-3.90(m,1h),3.63-3.73(m,3h),3.29(d,j＝5.84hz,1h),3.24(dd,j＝5.46,9.98hz,1h),3.10-3.19(m,2h),2.98(d,j＝9.98hz,1h),2.61(dd,j＝5.56,10.08hz,1h),2.49-2.54(m,1h),2.46(s,3h),1.91(dd,j＝2.73,8.76hz,3h),1.02(t,j＝7.35hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d173.5,136.6,136.3,135.3,133.8,130.7,129.3,128.5,128.3,126.5,126.5,66.6,59.2,57.1,55.8,50.8,36.7,33.2,15.6,14.1。ms(esi)[m]⁺418.3。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-(甲基硫代)苯基)甲基]氨基}-n-戊基吡咯烷-2-羧酰胺(44)根据一般程序a被制备为无色油状物(62％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)d7.47(br.s.,1h),7.31-7.39(m,2h),7.21-7.26(m,2h),7.17-7.20(m,4h),3.84-3.91(m,1h),3.59-3.75(m,3h),3.30(br.s.,1h),3.25(dd,j＝5.46,9.80hz,1h),3.10(dt,j＝6.97,12.72hz,2h),2.99(d,j＝10.17hz,1h),2.60(dd,j＝5.46,9.98hz,1h),2.48-2.54(m,1h),2.46(s,3h),1.91(d,j＝10.36hz,2h),1.32-1.43(m,2h),1.17-1.29(m,4h),0.84(t,j＝6.78hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d174.0,137.1,136.7,135.8,134.2,131.0,129.7,128.9,128.7,126.9,67.1,59.6,57.5,56.3,51.3,38.9,37.1,29.2,29.1,22.3,16.1,13.9。ms(esi)[m]⁺460.3。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-(甲基硫代)苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(45)根据一般程序a被制备为无色油状物(46％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)d7.40(br.s.,1h),7.33(dd,j＝2.92,4.43hz,1h),7.09-7.24(m,12h),3.60-3.79(m,4h),3.37-3.50(m,2h),3.34(d,j＝6.03hz,1h),3.21(dd,j＝5.75,9.51hz,1h),2.98(d,j＝10.36hz,1h),2.67-2.76(m,2h),2.47-2.58(m,2h),2.45(s,3h),1.86(d,j＝12.62hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d173.8,138.8,137.8,135.5,134.7,134.0,130.7,129.6,129.1,128.7,128.6,128.5,126.9,126.8,126.4,67.0,58.6,56.6,55.9,50.7,39.9,36.4,35.4,15.9。ms(esi)[m]⁺494.7。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-(甲基硫代)苯基)乙基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(46)根据一般程序a被制备为无色油状物(50％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)d7.47(br.s.,1h),7.32-7.38(m,1h),7.15-7.24(m,7h),7.02(d,j＝8.48hz,2h),6.73(d,j＝8.67hz,2h),3.71-3.80(m,4h),3.59-3.69(m,3h),3.42(dd,j＝6.69,13.28hz,1h),3.32-3.38(m,1h),3.26(d,j＝4.14hz,1h),3.19-3.24(m,1h),2.93(d,j＝9.98hz,1h),2.61-2.71(m,2h),2.51(dd,j＝5.37,10.08hz,2h),2.45(s,3h),2.04(br.s.,2h),1.78-1.88(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d174.0,158.2,137.2,136.5,135.7,134.0,130.8,130.7,129.6,129.5,128.8,128.7,126.9,113.9,67.2,59.3,57.1,56.1,55.2,51.2,40.0,37.1,34.6,16.0。ms(esi)[m]⁺524.5。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-(甲基硫代)苯基)乙基]-4-{[(4-硝基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(47)根据一般程序a被制备为无色油状物(44％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)d7.93(d,j＝8.67hz,2h),7.53(t,j＝6.03hz,1h),7.23-7.28(m,1h),7.06-7.18(m,8h),3.51-3.70(m,4h),3.37(q,j＝6.78hz,2h),3.22(d,j＝3.20hz,1h),3.17(dd,j＝5.65,9.80hz,1h),2.88(d,j＝10.17hz,1h),2.72(qd,j＝7.10,14.13hz,2h),2.40-2.49(m,2h),2.39(s,3h),1.85(br.s.,1h),1.70-1.79(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d173.3,145.7,145.6,136.4,135.4,134.6,132.9,129.4,128.7,128.4,127.8,127.7,125.9,125.8,122.6,66.1,58.4,56.3,55.3,50.3,38.2,36.1,34.5,14.9。ms(esi)[m]⁺539.2。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(3,4-二氟苯基)乙基]-4-{[(4-(甲基硫代)苯基)甲基]氨基}吡咯烷-2-羧酰胺(48)根据一般程序a被制备为无色液体(56％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)d7.58(br.s.,1h),7.34(d,j＝7.35hz,1h),7.15-7.25(m,7h),6.88-7.00(m,2h),6.75-6.83(m,1h),3.70-3.80(m,1h),3.59-3.69(m,3h),3.35-3.45(m,1h),3.33(d,j＝6.97hz,2h),3.24(dd,j＝5.65,9.61hz,1h),2.96(d,j＝9.80hz,2h),2.60-2.70(m,2h),2.54(dd,j＝5.56,10.46hz,2h),2.41-2.49(m,4h),1.85(d,j＝13.00hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d174.1,137.5,135.9,135.6,134.0,130.6,129.7,128.8,128.8,126.9,126.9,124.5,124.5,124.4,124.4,117.5,117.3,117.2,117.0,67.1,59.2,57.1,56.1,51.2,39.6,36.9,34.7,15.9。ms(esi)[m]⁺530.9。

(2s,4r)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-羟基吡咯烷-2-羧酸(49)。向在甲醇(30ml)中的3(0.87g，3.22mmol)的溶液中添加氢氧化锂(0.386g，16.12mmol)。在室温搅拌持续3h之后，将反应混合物在真空中浓缩。将残余物溶解在水中，并且将ph用3nhcl水溶液调节至5。将反应混合物用乙酸乙酯提取三次。合并的有机层经无水硫酸镁干燥并且在真空中浓缩，以提供作为白色固体的产物(0.63g，76％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)d7.74-7.79(m,2h),7.37-7.46(m,1h),7.28-7.35(m,3h),7.17-7.23(m,2h),5.01(d,j＝5.46hz,1h),3.74-4.04(m,2h),3.69(s,1h),3.66(s,1h),3.29(dd,j＝6.03,11.11hz,1h),3.12-3.17(m,1h),2.67-2.73(m,1h),2.44(s,3h),2.28(dd,j＝5.46,7.54hz,2h)。ms(esi)[m]⁺256.4,[m-h]^-254.3。

(2s,4r)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-羟基-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(50)。向在dmf(10ml)中的49(0.825g，3.2mmol)的溶液中添加4-硝基苯乙胺(0.981g，4.8mmol)、hbtu(1.346g，3.5mmol)和二异丙基乙胺(2.8ml，16.1mmol)。在室温搅拌持续24h之后，将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用水(每次100ml，三次)和盐水(100ml)洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过快速柱色谱法纯化(硅胶，甲醇/二氯甲烷)，以提供作为白色固体的产物(0.55g，42％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.02(d,j＝8.67hz,2h),7.53(t,j＝6.03hz,1h),7.16-7.35(m,6h),4.28-4.37(m,1h),3.72-3.87(m,2h),3.56(t,j＝8.10hz,1h),3.44(q,j＝6.78hz,2h),3.23(dd,j＝4.90,10.55hz,1h),2.77-2.89(m,2h),2.53(dd,j＝4.14,10.55hz,1h),2.28(ddd,j＝4.24,8.62,12.95hz,1h),1.86-1.98(m,1h)。ms(esi)[m]⁺404.3。

(3r,5s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-5-{[2-(4-硝基苯基)乙基]氨基甲酰基}吡咯烷-3-基-4-甲基苯-1-磺酸酯(51)。向在二氯甲烷(5ml)中的50(0.550g，1.36mmol)的溶液中添加甲苯磺酰氯(0.519g，2.72mmol)和吡啶(5ml)。在室温搅拌持续24h之后，将反应混合物在真空中浓缩。将残余物溶解在二氯甲烷中，用饱和硫酸铜水溶液洗涤两次。将合并的有机级分汇集，用盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过快速柱色谱法纯化(硅胶，乙酸乙酯/己烷)，以提供作为白色固体的产物(0.44g，58％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.76(d,j＝8.29hz,2h),7.30-7.37(m,4h),7.15-7.25(m,4h),4.86-4.94(m,j＝5.65hz,1h),3.75(d,j＝2.64hz,2h),3.39-3.52(m,3h),3.17(dd,j＝4.90,11.87hz,1h),2.73-2.88(m,3h),2.45(s,3h),2.32-2.42(m,1h),1.90-2.01(m,1h)。

一般程序b：向在thf(2ml)中的45(0.12mmol，0.068g)的溶液中添加相应的胺(1.2mmol)和三乙胺(0.36mmol，0.05ml)。将反应物回流持续72h。在冷却至室温之后，在真空中蒸发溶剂。将残余物通过柱色谱法纯化(sio2，meoh/dcm)，以给出期望的产物。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]-4-丙基氨基)吡咯烷-2-羧酰胺(52)根据一般程序b被制备为黄色油状物(11％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.02-8.08(m,2h),7.61(t,j＝6.03hz,1h),7.32-7.36(m,1h),7.29(d,j＝8.67hz,2h),7.16-7.25(m,3h),3.60-3.77(m,2h),3.47(dq,j＝3.77,6.72hz,2h),3.21-3.29(m,2h),2.80-2.95(m,3h),2.38-2.59(m,4h),1.67-1.78(m,1h),1.40(qd,j＝7.29,14.67hz,3h),0.87(t,j＝7.35hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.4,146.8,146.7,135.7,133.9,130.4,129.7,129.4,128.8,126.9,123.7,67.4,59.8,57.4,56.9,49.9,39.3,37.6,35.6,23.3,11.7。ms(esi)[m]⁺445.6。

(2s,4s)-4-(丁基氨基)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(53)根据一般程序b被制备为黄色油状物(39％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.88-7.99(m,2h),7.79(t,j＝5.93hz,1h),7.69(d,j＝7.91hz,1h),7.29-7.36(m,2h),7.10-7.25(m,5h),3.61-3.66(m,2h),3.56(dd,j＝6.69,14.03hz,1h),3.44-3.51(m,1h),3.34-3.43(m,1h),3.26(dd,j＝6.78,8.67hz,1h),3.09(d,j＝10.55hz,1h),2.82(qd,j＝7.08,13.99hz,2h),2.61-2.70(m,2h),2.48-2.58(m,2h),2.39(s,1h),1.86-1.98(m,1h),1.52(quin,j＝7.49hz,2h),1.27(qd,j＝7.42,15.05hz,2h),0.85(t,j＝7.44hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.6,146.8,146.5,142.0,140.7,135.1,133.7,130.3,129.6,129.4,129.0,128.7,126.9,125.7,123.5,66.9,56.7,55.8,46.9,39.3,35.8,35.2,30.0,21.3,20.1,13.6。ms(esi)[m]⁺459.3。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]-4-(戊基氨基)吡咯烷-2-羧酰胺(54)根据一般程序b被制备为无色油状物(59％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.05(d,j＝8.67hz,2h),7.62(t,j＝5.93hz,1h),7.26-7.36(m,3h),7.16-7.25(m,2h),3.59-3.76(m,2h),3.47(td,j＝6.57,12.67hz,2h),3.21-3.29(m,2h),2.81-2.96(m,3h),2.42-2.58(m,3h),1.72(ddd,j＝3.77,5.75,13.28hz,1h),1.19-1.44(m,6h),0.87(t,j＝6.88hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.4,146.8,146.7,135.7,133.9,130.4,129.7,129.4,128.8,126.9,123.7,67.4,59.7,57.3,56.9,48.0,39.3,37.6,35.6,29.9,29.5,22.5,14.0。ms(esi)[m]⁺473.8。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-(己基氨基)-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(55)根据一般程序b被制备为无色油状物(25％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.05(d,j＝8.67hz,2h),7.54(t,j＝5.93hz,1h),7.27-7.36(m,3h),7.15-7.25(m,3h),3.61-3.77(m,2h),3.46(td,j＝6.73,13.28hz,2h),3.22-3.33(m,2h),2.75-2.99(m,3h),2.43-2.60(m,3h),1.64-1.80(m,4h),1.36-1.45(m,2h),1.21-1.32(m,6h),0.84-0.91(m,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.4,146.7,135.6,133.9,130.4,129.7,129.4,128.8,126.9,123.7,67.2,59.5,57.2,57.0,48.0,39.3,37.4,35.5,31.6,30.0,27.0,22.6,14.0。ms(esi)[m]⁺487.4。

(2s,4s)-4-(苄基氨基)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(56)根据一般程序b被制备为无色油状物(81％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.96-8.03(m,2h),7.62(t,j＝5.75hz,1h),7.15-7.37(m,11h),3.59-3.78(m,4h),3.45(q,j＝6.97hz,2h),3.22-3.34(m,2h),2.96(d,j＝10.17hz,1h),2.79(qd,j＝7.07,14.20hz,2h),2.43-2.60(m,2h),1.82(td,j＝3.72,13.47hz,1h),1.53(br.s.,2h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.4,146.7,146.6,140.0,135.7,134.0,130.5,129.7,129.4,128.8,128.5,128.1,127.2,126.9,123.6,67.2,59.6,57.4,56.4,52.0,39.2,37.4,35.5。ms(esi)[m]⁺493.8。

(2s,4s)-4-(苄基氨基)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(57)根据一般程序b被制备为无色油状物(13％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.00(d,j＝8.85hz,1h),7.16-7.42(m,12h),3.62-3.75(m,1h),3.46-3.60(m,3h),3.32(t,j＝8.10hz,1h),3.19-3.28(m,1h),3.14(dd,j＝4.24,10.64hz,1h),2.86(dt,j＝4.43,6.83hz,2h),2.54-2.64(m,1h),2.49(dd,j＝6.03,13.37hz,1h),2.10-2.17(m,2h),1.88-2.00(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d173.7,146.7,146.6,135.5,133.8,130.2,129.7,129.4,129.3,128.8,128.5,127.7,127.0,125.5,123.7,67.8,62.7,59.5,57.6,56.9,39.3,38.6,35.4,34.5。ms(esi)[m]⁺507.2。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]-4-[(2-(苯乙基)氨基]吡咯烷-2-羧酰胺(58)根据一般程序b被制备为黄色油状物(30％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.99-8.06(m,1h),7.48(t,j＝5.93hz,1h),7.28-7.36(m,3h),7.13-7.25(m,7h),3.60-3.71(m,2h),3.48(td,j＝6.90,13.89hz,1h),3.28-3.35(m,1h),3.18-3.25(m,1h),2.88-3.02(m,2h),2.70-2.83(m,6h),2.44-2.56(m,2h),1.85(d,j＝6.97hz,1h),1.63-1.73(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.2,146.7,139.7,135.6,133.9,130.3,129.7,129.4,128.8,128.8,128.6,128.6,128.5,128.5,126.9,126.3,123.6,67.3,59.2,57.2,56.7,48.9,39.2,37.6,36.2,35.5。ms(esi)[m]⁺507.2。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(3-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(59)根据一般程序b被制备为黄色油状物(20％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.01(d,j＝8.67hz,2h),7.60(t,j＝5.93hz,1h),7.31-7.35(m,1h),7.18-7.25(m,6h),6.74-6.88(m,4h),3.79(s,3h),3.69-3.72(m,1h),3.62-3.69(m,3h),3.45(q,j＝6.97hz,2h),3.32(td,j＝2.99,5.51hz,1h),3.25(dd,j＝5.37,9.89hz,1h),2.97(d,j＝9.98hz,1h),2.80(q,j＝7.35hz,2h),2.51-2.58(m,1h),2.48(td,j＝3.58,9.98hz,1h),1.77-1.81(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.5,159.8,146.7,146.7,141.1,135.6,134.0,130.5,129.7,129.5,129.4,128.8,126.9,123.6,120.4,114.1,112.4,67.1,59.4,57.2,56.5,55.2,51.8,39.3,37.2,35.5。ms(esi)[m]⁺523.5。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(3,4-二甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(60)根据一般程序b被制备为无色油状物(41％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.00(d,j＝8.67hz,2h),7.60(t,j＝6.03hz,1h),7.30-7.36(m,1h),7.16-7.25(m,5h),6.76-6.84(m,4h),3.82-3.91(m,9h),3.64-3.72(m,2h),3.58-3.63(m,2h),3.45(q,j＝6.78hz,2h),3.22-3.34(m,2h),2.95(d,j＝10.36hz,1h),2.79(q,j＝7.10hz,2h),2.45-2.59(m,2h),1.77-1.96(m,2h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.3,149.1,148.3,146.7,135.7,134.0,132.5,130.5,129.7,129.4,128.9,126.9,123.6,120.2,111.6,111.3,111.1,67.2,59.6,57.5,56.2,55.9,51.8,39.2,37.4,35.5。ms(esi)[m]⁺553.7。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-羟基苯基)甲基]氨基}-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(61)根据一般程序b被制备为无色油状物(27％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.94(d,j＝8.67hz,2h),7.69(t,j＝7.72hz,1h),7.28-7.35(m,1h),7.14-7.25(m,4h),7.05(d,j＝8.48hz,2h),6.61-6.74(m,2h),3.58-3.70(m,3h),3.46(td,j＝6.69,13.37hz,1h),3.38(d,j＝6.78hz,1h),3.24(dd,j＝6.12,9.32hz,1h),3.01(d,j＝10.36hz,1h),2.74-2.82(m,2h),2.42-2.56(m,2h),1.84(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.3,155.7,146.7,135.4,133.8,130.4,129.8,129.6,129.4,129.0,128.8,126.9,125.8,123.6,115.6,67.2,58.8,56.9,56.3,51.3,39.3,36.8,35.4。ms(esi)[m]⁺509.4。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]-4-({[4-(三氟甲基)苯基]甲基}氨基)吡咯烷-2-羧酰胺(62)根据一般程序b被制备为无色油状物(9％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.02(d,j＝8.67hz,2h),7.55(d,j＝8.10hz,3h),7.32-7.38(m,3h),7.16-7.24(m,4h),3.61-3.79(m,4h),3.46(dd,j＝2.54,6.50hz,2h),3.26(dd,j＝5.37,9.89hz,2h),2.93(d,j＝10.17hz,1h),2.76-2.85(m,2h),2.44-2.59(m,2h),1.84(dd,j＝4.14,13.38hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.2,146.6,144.1,135.5,134.0,130.5,129.8,129.4,129.0,128.2,126.9,125.3,123.6,67.1,59.6,57.6,56.5,51.4,39.2,37.3,35.5。ms(esi)[m]⁺561.3。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-氯苯基)甲基]氨基}-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(63)根据一般程序b被制备为无色油状物(14％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.02(d,j＝8.67hz,2h),7.58(t,j＝6.03hz,1h),7.14-7.36(m,10h),3.85(s,2h),3.59-3.77(m,5h),3.45(q,j＝6.84hz,2h),3.25(dd,j＝5.37,9.89hz,2h),2.92(d,j＝10.17hz,1h),2.80(qd,j＝6.91,13.56hz,2h),2.42-2.57(m,2h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.3,146.6,138.5,135.6,134.0,132.9,130.5,129.7,129.6,129.4,128.9,128.6,128.5,126.9,123.7,67.1,59.6,57.5,56.4,51.3,39.2,37.3,35.5。ms(esi)[m]⁺527.5。

(2s,4s)-1-[(2-氯苯基)甲基]-4-{[(4-氟苯基)甲基]氨基}-n-[2-(4-硝基苯基)乙基]吡咯烷-2-羧酰胺(64)根据一般程序b被制备为无色油状物(55％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ8.01(d,j＝8.67hz,2h),7.59(t,j＝6.12hz,1h),7.31-7.36(m,1h),7.15-7.28(m,7h),6.95-7.02(m,2h),3.57-3.77(m,4h),3.45(q,j＝6.91hz,2h),3.21-3.32(m,2h),2.93(d,j＝9.98hz,1h),2.80(qd,j＝6.92,13.54hz,2h),2.42-2.58(m,2h),1.76-1.86(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.3,146.7,135.6,134.0,130.5,129.7,129.7,129.6,129.4,128.9,126.9,123.6,115.4,115.1,67.1,59.6,57.5,56.4,51.2,39.2,37.3,35.5。ms(esi)[m]⁺511.3。

1-叔丁基2-甲基(2s,4r)-4-羟基吡咯烷-1,2-二羧酸酯(65)。在0℃，向在1nnaoh溶液(28.5ml)和1,4-二噁烷(28.5ml)中的甲基反式-4-羟基-l-脯氨酸5(27.6mmol，5.0g)的溶液中逐滴添加boc2o(30.3mmol，6.6g)。在室温搅拌持续8h之后，在真空下去除溶剂。将残余物溶解在乙酸乙酯中，用水和盐水洗涤。有机层经无水mgso4干燥，并且在真空中浓缩，以给出作为无色液体的期望的产物(6.1g，90％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ4.51(m,1h),4.43(m,1h),3.74(s,3h),3.64(m,2h),2.29(d,j＝7.54hz,1h),2.10(dd,j＝4.52,8.48hz,1h),1.44(m,9h)。ms(esi)[m+h]⁺246.3,[m+na]⁺268.1。

1-叔丁基2-甲基(2s,4r)-4-[(4-甲基苯磺酰基)氧基]吡咯烷-1,2-二羧酸酯(66)。在0℃，向在二氯甲烷(35ml)中的5(11g，45mmol)的溶液中添加甲苯磺酰氯(10.27g，53.9mmol)和吡啶(35ml)。在回流下搅拌持续24h之后，将反应混合物在真空中浓缩，并且再溶解在二氯甲烷中。然后用饱和硫酸铜水溶液和盐水洗涤。有机级分经无水硫酸镁干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过快速柱色谱法纯化(硅胶，乙酸乙酯/己烷)，以提供作为浅黄色液体的产物(12.6g，70％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.79(d,j＝8.29hz,2h),7.36(d,j＝8.10hz,2h),4.99-5.09(m,1h),4.32-4.43(m,1h),3.72(s,3h),3.57-3.65(m,2h),2.46(s,4h),2.09-2.22(m,j＝8.70hz,1h),1.36-1.44(m,9h)。ms(esi)[m+h]⁺400.3,[m+na]⁺422.3。

1-叔丁基2-甲基(2s,4s)-4-叠氮基吡咯烷-1,2-二羧酸酯(67)。向在dmf(40ml)中的66(4.28g，10.7mmol)的溶液中添加叠氮化钠(1.393g，21.4mmol)。在70℃加热持续16h之后，将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用水洗涤两次，并且用盐水洗涤一次。有机级分经无水硫酸镁干燥并且在真空中浓缩，以提供作为黄色液体的期望的产物(2.87g，99％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ4.30-4.47(m,1h),4.10-4.20(m,1h),3.66-3.80(m,4h),3.43-3.54(m,1h),2.47(ddt,j＝6.03,8.38,13.89hz,1h),2.13-2.22(m,1h),1.40-1.51(m,9h)。ms(esi)[m+h]⁺271.1,[m+na]⁺293.1。

1-叔丁基2-甲基(2s,4s)-4-氨基吡咯烷-1,2-二羧酸酯(68)。在氮气下向在thf(46ml)中的叠氮化物67(2.87g，10.6mmol)的溶液中添加pph3(5.57g，21.2mmol)和水(0.5ml)。将反应混合物在搅拌下回流持续6h。在去除溶剂之后，将残余物溶解在乙醚中，用0.1nhcl处理持续5min，并且然后用乙醚提取两次。然后将水层用1nnaoh处理直至ph10，并且然后用二氯甲烷提取。合并的二氯甲烷级分经无水硫酸镁干燥，在真空中浓缩，以提供作为黄色液体的期望的产物(2.08g，80％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ4.20-4.37(m,1h),3.72-3.79(m,3h),3.63-3.72(m,1h),3.50-3.58(m,1h),3.26(dd,j＝4.99,10.64hz,1h),2.38-2.53(m,1h),1.75-1.86(m,1h),1.39-1.48(m,9h)。ms(esi)[m+h]⁺245.3。

1-叔丁基2-甲基(2s,4s)-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}吡咯烷-1,2-二羧酸酯(69)。向在1,2-二氯乙烷(26ml)中的68(2.08g，7.74mmol)的溶液中添加4-甲氧基苯甲醛(0.94ml，7.74mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(2.461g，11.6mmol)和乙酸(0.44ml，7.74mmol)。在室温搅拌持续24h之后，将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液猝灭，并且用二氯甲烷提取三次。合并的有机层经无水硫酸镁干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过快速柱色谱法纯化(硅胶，乙酸乙酯/己烷)，以提供作为无色液体的产物(2.193g，73％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.21(d,j＝8.48hz,2h),6.85(d,j＝8.67hz,2h),4.20-4.35(m,1h),3.79(s,3h),3.58-3.75(m,6h),3.25-3.37(m,2h),2.29-2.45(m,1h),1.90-2.01(m,1h),1.39-1.48(m,9h)。ms(esi)[m+h]⁺365.9。

1-叔丁基2-甲基(2s,4s)-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基][(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]氨基}吡咯烷-1,2-二羧酸酯(70)。在0℃，向在二氯甲烷(2.5ml)中的69(0.2g，0.5mmol)的溶液中添加troccl(0.11ml，0.77mmol)和三乙胺(0.14ml，1.02mmol)。使反应混合物达到室温，并且搅拌持续16h。然后将反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。有机级分经无水硫酸镁干燥并且在真空中浓缩，以给出作为无色液体的产物(0.23g，定量收率)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.14(d,j＝8.29hz,2h),6.85(d,j＝8.48hz,2h),4.73-4.89(m,2h),4.40-4.60(m,3h),4.15-4.26(m,1h),3.79(s,3h),3.67-3.75(m,4h),3.37-3.51(m,1h),2.34-2.46(m,1h),2.06-2.23(m,1h),1.35-1.47(m,9h)。ms(esi)[m+h]⁺539.3,[m+na]⁺563.3。

(2s,4s)-1-[(叔丁氧基)羰基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基][(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]氨基}吡咯烷-2-羧酸(71)。向在甲醇(2ml)中的70(0.274g，0.5mmol)的溶液中添加氢氧化锂(0.048g，2mmol)。在室温搅拌之后，在减压下去除甲醇。将残余物悬浮在水中，并且将ph通过1nhcl水溶液调节至5。将水层用二氯甲烷提取三次。合并的有机级分经无水硫酸镁干燥，并且在真空中浓缩，以给出作为白色固体的产物(0.225g，84％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ9.02(br.s.,1h),7.14(d,j＝4.33hz,2h),6.86(d,j＝7.16hz,2h),4.72-4.91(m,2h),4.35-4.63(m,3h),4.16-4.33(m,1h),3.80(s,3h),3.70-3.76(m,1h),3.23-3.54(m,1h),2.20-2.52(m,2h),1.41(d,j＝17.52hz,9h)。ms(esi)[m-h]^-523.1。

叔丁基-(2s,4s)-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基][(2,2,2-三氯乙氧基)羰基]氨基}-2-[(2-苯乙基)氨基甲酰基]吡咯烷-1-羧酸酯(72)。向在无水二氯甲烷(17ml)中的71(2.629g，5mmol)的溶液中添加苯乙胺盐酸盐(0.7ml，5.5mmol)、hbtu(2.086g，5.5mmol)和二异丙基乙胺(3.2ml，18mmol)。在室温搅拌持续16h之后，将反应混合物用1nhcl水溶液洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过快速柱色谱法纯化(硅胶，乙酸乙酯/己烷)，以提供作为黄色固体的产物(2g，64％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.27(t,j＝3.67hz,2h),7.12-7.21(m,5h),6.85(d,j＝8.67hz,2h),4.78(br.s.,2h),4.33-4.64(m,3h),3.74-3.83(m,4h),3.50(d,j＝5.84hz,2h),2.81-2.88(m,2h),2.17-2.55(m,2h),1.33-1.46(m,11h)。

2,2,2-三氯乙基-n-[(4-甲氧基苯基)甲基]-n-[(3s,5s)-5-[(2-苯乙基)氨基甲酰基]吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(73)。向在二氯甲烷(4.4ml)中的三氟乙酸的20％v/v溶液中添加72(2g，3.2mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。然后将反应混合物在真空中浓缩，以提供作为黄色液体的产物(1.60g，定量收率)。ms(esi)[m]⁺528.7。

一般程序c。向在1,2-二氯乙烷(4ml)中的73(0.1g，0.19mmol)的溶液中添加相应的醛(0.042g，0.28mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(0.12g，0.57mmol)和乙酸(1滴)。在室温搅拌持续48h之后，将反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液猝灭，并且用二氯甲烷提取三次。有机提取物经无水硫酸镁干燥，并且在真空中浓缩。将残余物溶解在甲醇(8ml)中。向反应混合物中添加锌(0.1g，1.5mmol)和乙酸(2滴)。在回流下搅拌持续1h之后，将反应混合物冷却至室温并且在真空中浓缩。将残余物通过快速柱色谱法纯化(sio2，meoh/dcm)，以提供期望的产物。

(2s,4s)-1-己基-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(74)根据一般程序c被制备为无色油状物(27％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.50(t,j＝6.03hz,2h),7.27-7.30(m,1h),7.24(s,1h),7.14-7.22(m,6h),6.83-6.87(m,2h),3.79(s,3h),3.61(d,j＝3.77hz,2h),3.41-3.59(m,2h),3.23(dt,j＝3.01,5.84hz,1h),2.97-3.04(m,2h),2.75-2.82(m,2h),2.33-2.52(m,3h),2.21-2.31(m,1h),1.69-1.78(m,1h),1.07-1.38(m,9h),0.89(t,j＝6.78hz,3h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.8,158.7,139.0,132.3,129.3,128.7,128.5,126.4,113.8,67.6,59.3,56.2,56.0,55.3,51.3,39.8,37.1,35.6,31.7,28.8,27.0,22.6,14.0。ms(esi)[m]⁺438.5。

(2s,4s)-1-(环己基甲基)-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(75)根据一般程序c被制备为无色油状物(24％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.41(t,j＝5.84hz,1h),7.14-7.25(m,6h),6.83-6.89(m,2h),3.76-3.82(m,3h),3.61-3.70(m,2h),3.50-3.59(m,2h),3.24(td,j＝2.76,5.98hz,1h),2.94-3.01(m,2h),2.80(qd,j＝6.98,19.00hz,2h),2.31-2.45(m,2h),2.08-2.25(m,2h),1.48-1.81(m,8h),1.23-1.37(m,1h),1.04-1.21(m,3h),0.67-0.82(m,1h),0.44(dd,j＝3.20,11.68hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.6,157.6,137.7,131.1,128.2,127.6,127.5,127.4,125.3,112.7,66.9,61.9,58.1,55.2,54.1,50.2,38.5,35.8,35.6,34.4,30.6,29.6,25.5,24.9,24.8。ms(esi)[m]⁺450.6。

(2s,4s)-1-苄基-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(76)根据一般程序c被制备为无色油状物(29％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.44-7.53(m,1h),7.30(m,1h),7.12-7.26(m,9h),7.03-7.09(m,2h),6.83(d,j＝8.48hz,2h),3.73-3.81(m,4h),3.46-3.60(m,4h),3.36(d,j＝13.00hz,1h),3.15-3.26(m,2h),2.87(d,j＝10.36hz,1h),2.72-2.81(m,2h),2.39-2.52(m,2h),1.74-1.83(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.3,158.7,138.9,138.3,132.2,129.3,128.7,128.6,128.5,128.4,127.2,126.4,113.8,67.1,59.6,59.2,56.0,55.3,51.3,39.7,37.4,35.6。ms(esi)[m]⁺444.5。

(2s,4s)-1-[(3-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(77)根据一般程序c被制备为无色油状物(21％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.45(t,j＝5.18hz,1h),7.11-7.25(m,10h),6.94(d,j＝6.97hz,1h),6.80-6.86(m,2h),3.78(s,3h),3.73(d,j＝13.37hz,1h),3.60(d,j＝5.65hz,2h),3.51-3.57(m,1h),3.41-3.50(m,1h),3.30(d,j＝13.56hz,1h),3.22-3.27(m,1h),3.16(dd,j＝6.12,9.51hz,1h),2.87(d,j＝10.36hz,1h),2.78(dt,j＝2.35,6.92hz,2h),2.36-2.52(m,4h),1.74-1.83(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.9,158.9,140.3,138.8,134.3,131.3,129.7,129.5,128.6,128.6,128.5,127.4,126.6,126.5,113.9,67.3,58.9,55.8,55.3,51.1,39.7,37.2,35.5。ms(esi)[m]⁺478.3。

(2s,4s)-1-[(4-氯苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(78)根据一般程序c被制备为无色油状物(19％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.43(t,j＝5.75hz,1h),7.10-7.26(m,10h),6.94(d,j＝8.29hz,2h),6.81-6.86(m,2h),3.75-3.82(m,5h),3.60-3.74(m,3h),3.48-3.60(m,4h),3.26-3.33(m,1h),3.19-3.25(m,1h),3.13-3.18(m,1h),2.67-2.90(m,4h),2.35-2.50(m,2h),1.77(ddd,j＝3.49,5.13,13.42hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.1,158.8,138.8,136.7,132.9,132.1,130.1,129.8,129.3,129.2,129.1,128.9,128.8,128.7,128.6,128.6,128.5,126.5,113.9,113.8,67.2,59.1,58.8,56.0,55.3,51.3,39.6,37.4,35.5。ms(esi)[m]⁺478.5。

(2s,4s)-1-[(2-甲氧基苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(79)根据一般程序c被制备为无色油状物(25％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.82(t,j＝5.84hz,1h),7.28(d,j＝1.70hz,1h),7.13-7.24(m,7h),7.10(dd,j＝1.51,7.35hz,1h),6.80-6.92(m,4h),3.87(d,j＝12.81hz,1h),3.77(s,3h),3.72(s,3h),3.51-3.65(m,3h),3.32-3.44(m,2h),3.15-3.24(m,2h),2.85(d,j＝10.17hz,1h),2.77(dt,j＝1.98,7.21hz,2h),2.42-2.54(m,2h),1.82(ddd,j＝3.30,5.75,13.56hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ173.4,157.7,156.6,138.1,131.2,129.6,128.3,127.7,127.6,127.5,125.4,125.3,119.5,112.8,109.5,65.8,58.2,54.8,54.3,54.2,53.6,50.2,39.2,36.4,34.9。ms(esi)[m]⁺474.6。

(2s,4s)-1-[(3-甲氧基苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(80)根据一般程序c被制备为无色油状物(45％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.54(br.s.,1h),7.31(d,j＝8.48hz,2h),7.10-7.24(m,6h),6.69-6.87(m,4h),3.80-3.90(m,2h),3.75(d,j＝15.82hz,0h),3.01-3.65(m,6h),2.74-2.87(m,2h),2.34-2.52(m,2h),1.87-2.04(m,2h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d171.3,157.7,157.5,136.5,128.8,127.3,126.6,126.3,124.2,122.9,122.6,118.9,112.2,110.9,107.3,64.1,56.0,54.2,53.1,53.1,52.7,47.2,38.1,33.1,32.5。ms(esi)[m]⁺474.9。

(2s,4s)-1-[(3,4-二甲氧基苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(81)根据一般程序c被制备为无色油状物(55％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.02-7.26(m,3h),6.80-6.94(m,6h),6.46-6.79(m,2h),3.83-3.91(m,12h),3.75-3.79(m,2h),3.43-3.73(m,2h),2.95-3.33(m,1h),2.68-2.91(m,2h),1.68-2.50(m,4h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d172.1,146.8,146.2,131.4,127.0,126.8,126.4,126.3,126.2,126.1,124.0,118.4,117.0,111.5,111.5,108.8,108.2,62.7,56.6,53.6,53.5,52.9,49.6,48.9,37.6,35.0,33.2,30.7。ms(esi)[m]⁺504.7。

(2s,4s)-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-1-[(2-甲基苯基)甲基]-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(82)根据一般程序c被制备为无色油状物(19％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.36(t,j＝5.75hz,1h),7.12-7.19(m,7h),7.07-7.11(m,2h),6.84(d,j＝8.48hz,2h),3.75-3.80(m,4h),3.51-3.70(m,5h),3.45-3.50(m,1h),3.29-3.38(m,1h),3.17-3.28(m,2h),2.95(d,j＝9.98hz,1h),2.67(dt,j＝2.73,7.02hz,2h),2.42-2.51(m,2h),2.21-2.27(m,3h),2.19(d,j＝3.01hz,1h),1.74-1.82(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ172.2,156.5,136.6,134.3,134.0,129.9,128.0,127.1,126.9,126.5,126.4,126.3,124.9,124.1,123.8,111.6,111.6,65.6,57.4,55.4,53.9,53.0,49.1,37.5,35.2,33.3,16.9。ms(esi)[m]⁺458.4。

(2s,4s)-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-1-[(4-甲基苯基)甲基]-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(83)根据一般程序c被制备为无色油状物(26％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.48(t,j＝5.84hz,1h),7.13-7.25(m,6h),7.07(d,j＝7.91hz,2h),6.92-6.98(m,2h),6.81-6.86(m,2h),3.78(s,3h),3.72(d,j＝13.00hz,1h),3.57(d,j＝3.77hz,2h),3.46-3.54(m,2h),3.33(d,j＝13.00hz,1h),3.22(d,j＝3.20hz,1h),3.17(dd,j＝6.03,9.61hz,1h),2.87(d,j＝10.17hz,1h),2.76(dt,j＝4.43,6.92hz,2h),2.39-2.50(m,2h),2.33(s,3h),1.73-1.82(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d173.1,157.5,137.7,135.6,133.9,130.8,128.1,127.8,127.4,127.3,127.2,125.2,112.6,65.8,58.0,57.8,54.8,54.0,50.0,38.5,36.1,34.4,19.8。ms(esi)[m]⁺458.4。

(2s,4s)-1-[(4-羟基苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(84)根据一般程序c被制备为无色油状物(9％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.50(t,j＝5.56hz,1h),7.12-7.23(m,7h),6.80-6.89(m,4h),6.60(d,j＝8.29hz,2h),3.74(s,3h),3.61-3.70(m,3h),3.50(td,j＝7.18,14.46hz,2h),3.31(s,1h),3.21(d,j＝13.00hz,1h),3.09(dd,j＝6.40,9.42hz,1h),2.92(d,j＝10.36hz,1h),2.69-2.85(m,3h),2.36-2.48(m,2h),1.83(dd,j＝4.24,13.47hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ174.1,159.5,155.7,138.7,130.2,129.9,129.0,128.7,128.6,128.6,126.5,115.4,114.2,66.5,58.2,57.8,55.4,55.2,50.3,40.0,35.6,35.4。ms(esi)[m]⁺460.5。

(2s,4s)-1-{[4-(二甲基氨基)苯基]甲基}-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(85)根据一般程序c被制备为无色油状物(3％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.37(br.s.,1h),7.28(d,j＝1.88hz,0h),7.15-7.22(m,4h),6.95(d,j＝8.67hz,1h),6.82-6.86(m,1h),6.63(d,j＝8.67hz,1h),3.78(s,2h),3.61-3.69(m,2h),3.44-3.52(m,1h),3.32(d,j＝12.81hz,1h),3.25(d,j＝5.09hz,1h),3.15(dd,j＝5.84,9.61hz,1h),2.89-2.97(m,5h),2.76(td,j＝3.49,6.97hz,1h),2.46-2.53(m,1h),2.36-2.45(m,1h),1.81(s,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ172.6,148.1,137.1,127.8,127.7,126.9,126.7,124.6,124.0,112.1,110.7,64.7,56.9,54.1,53.4,49.1,38.8,38.1,35.0,33.8,29.0。ms(esi)[m]⁺487.6。

(2s,4s)-1-[(4-氰基苯基)甲基]-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(86)根据一般程序c被制备为无色油状物(27％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)d7.52(d,j＝8.29hz,2h),7.44(t,j＝5.75hz,1h),7.08-7.25(m,9h),6.84(d,j＝8.67hz,2h),3.75-3.82(m,4h),3.50-3.65(m,4h),3.38(d,j＝13.75hz,1h),3.23-3.29(m,1h),3.20(dd,j＝5.93,9.70hz,1h),2.70-2.89(m,3h),2.42-2.51(m,1h),2.37(dd,j＝5.65,9.98hz,1h),1.73-1.83(m,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)d228.8,173.8,158.8,143.8,138.8,132.2,129.3,128.9,128.7,128.6,126.5,113.9,67.5,59.2,59.1,56.1,55.3,51.4,39.5,37.4,35.4。ms(esi)[m]⁺469.4。

(2s,4s)-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-1-(萘-2-基甲基)-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(87)根据一般程序c被制备为无色油状物(23％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.80-7.84(m,1h),7.72-7.79(m,2h),7.58(s,1h),7.43-7.55(m,3h),7.10-7.24(m,8h),6.82(d,j＝8.67hz,2h),3.93(d,j＝13.00hz,1h),3.77(s,3h),3.43-3.59(m,5h),3.21-3.29(m,2h),2.89(d,j＝10.17hz,1h),2.76(dt,j＝3.20,6.88hz,2h),2.42-2.55(m,2h),1.80(ddd,j＝3.49,5.65,13.47hz,1h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ172.5,157.1,137.2,134.1,131.7,131.1,130.1,127.7,127.0,126.9,126.5,126.1,126.0,125.4,125.0,124.8,124.5,124.1,112.2,65.6,58.1,57.4,54.2,53.6,49.5,38.1,35.7,33.9。ms(esi)[m]⁺494.4。

(2s,4s)-1-(2h-1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-4-{[(4-甲氧基苯基)甲基]氨基}-n-(2-苯乙基)吡咯烷-2-羧酰胺(88)根据一般程序c被制备为无色油状物(11％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.35(br.s.,1h),7.14-7.25(m,7h),6.84(d,j＝8.67hz,2h),6.69(d,j＝7.91hz,1h),6.59(s,1h),6.53(d,j＝7.72hz,1h),5.92(d,j＝2.07hz,2h),3.78(s,3h),3.61-3.70(m,3h),3.51(td,j＝6.64,13.09hz,2h),3.27(d,j＝13.00hz,2h),3.13(dd,j＝5.84,9.61hz,1h),2.92(d,j＝10.93hz,1h),2.79(dt,j＝3.77,6.97hz,2h),2.37-2.49(m,2h),1.82(d,j＝16.39hz,2h)。¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ172.7,146.3,145.4,137.4,130.5,128.3,127.3,127.2,125.1,120.3,112.6,107.6,106.7,99.5,97.0,65.4,57.6,57.1,54.4,53.9,49.4,38.4,35.2,34.1。ms(esi)[m]⁺488.6。

钙动员测定。通过在cho-rd-hga16(moleculardevices)细胞中过表达人npffr1受体和人npffr2受体，创建了两个单独的稳定细胞系。在测定之前的一天，将细胞以30,000个细胞/孔(100μl体积)铺板到96孔黑色壁的测定板中的补充有10％胎牛血清、100单位的青霉素/链霉素以及100μg/mlnormocin^tm的ham’sf12中。

将细胞在37℃、5％co2孵育过夜。在测定之前，根据制造商的使用说明，将钙5染料(calcium5dye；moleculardevices)重构。将重构的染料在温的测定缓冲液(1xhbss、20mmhepes、2.5mm丙磺舒、ph7.4，在37℃)中1:40稀释。去除生长培养基，并且将细胞用100μl的温的测定缓冲液轻轻洗涤。将细胞在37℃、5％co2在200μl的稀释的钙5染料中孵育持续45分钟。在2.25％bsa/8％dmso/测定缓冲液中，以10x期望的最终浓度制备单一浓度的每种测试化合物。在0.25％bsa/1％dmso/测定缓冲液中，以10x期望的最终浓度制备npff的连续稀释液，等分在96孔聚丙烯板中，并且加温至37℃。在染料加载孵育期之后，将细胞用25μl的测试化合物预处理，并且在37℃孵育持续15min。在预处理孵育期之后，用ii(moleculardevices)读取板。在60秒的时间段内，每1.52秒监测钙介导的荧光变化，其中ii在19秒的时间点添加25μl的npff连续稀释液(在485nm处激发，在525nm处检测)。将峰动力学减少(softmax,moleculardevices)相对荧光单位(rfu)相对于化合物浓度的对数绘图。

将数据拟合到三参数逻辑曲线，以生成ec50值(graphpadprism,graphpadsoftware,inc.,sandiego,ca)。表观ke值使用方程式ke＝[l]/((ec50⁺/ec50^-)–1)来计算，其中[l]是测试化合物的浓度，ec50⁺是具有测试化合物的npff的ec50，并且ec50^-是单独的npff的ec50。当ec50⁺/ec50^-比率为至少4时，ke值被认为是有效的。

384孔高通量筛选

使用配备有5μl盒(biotek)的microflo^tm选择分配器，将稳定的人npffr1cho-rd-hga16细胞以5,000个细胞/孔以30μl/孔体积铺板到384孔greiner黑色壁的微孔板中的补充有1％fbs和100单位青霉素/链霉素的ham’sf12培养基中。将铺板的细胞在37℃、5％co2、95％相对湿度孵育过夜。第二天，通过以下来制备化合物测试板：用测定缓冲液稀释先前复制的文库子板以获得100μm(10x期望的最终浓度)工作溶液，并且用阳性对照和阴性对照填充第1、2、23和24列。制备另外的含有npffec60浓度(250nm，在1％dmso/测定缓冲液中以10x期望的最终浓度制备)的化合物测试板，以用于筛选的拮抗剂部分。将根据制造商的使用说明重构的钙5染料(bulkkit，moleculardevices)在预加温(37℃)的测定缓冲液(1xhbss、20mmhepes、2.5mm丙磺舒，ph7.4，在37℃)中1:20稀释，并且用biomeknx将30μl添加至板，然后在37℃、5％co2、95％相对湿度孵育持续45分钟。使用biomeknx，用8.5μl的8％dmso/测定缓冲液预处理染料加载的板，并且在37℃、5％co2、95％相对湿度孵育持续15分钟。在该孵育期之后，用tetra读取板以评估激动剂活性。在60秒的时间段内，每1秒监测钙介导的荧光变化，其中tetra在10秒的时间点添加来自化合物板的8.5μl(在470nm-495nm处激发，在515nm-575nm处检测)。然后将细胞板在37℃、5％co2、95％相对湿度孵育持续另外的15分钟，之后用tetra读取该细胞板以评估拮抗剂活性。在60秒的时间段内，每1秒监测钙介导的荧光变化，其中tetra在10秒的时间点添加来自npffec60板的8.5μl(在470nm-495nm处激发，在515nm-575nm处检测)。使用相对于基线的响应(theresponseoverbaseline；rob)统计分析从screenworks(moleculardevices)中导出数据，这将数据呈现为与基线样品相比的倍数响应。抑制百分比使用方程式(1–(cmpdrob/npffec60rob))×100计算。

camp测定。稳定的人npffr1-cho(es-491-c)和npffr2-cho(es-490-c)细胞系购自perkinelmer，并且与ultra试剂盒(trf0262)一起使用以检测低容量96孔板中的camp积累。在室温制备含有1xhbss、5mmhepes、0.1％bsa稳定剂和0.5mmibmx的刺激缓冲液，并且滴定至7.4。激动剂对照npff的连续稀释液在2％dmso/刺激缓冲液中以8x期望的最终浓度制备，并且将2.5μl添加至测定板。

在2％dmso/刺激缓冲液中，以4x期望的最终浓度制备单一浓度的每种测试化合物，并且将5μl添加至测定板。ec80浓度的毛喉素(forskolin)(1μm)在2％dmso/刺激缓冲液中以8x制备，并且将2.5μl添加至测定板。

用versene分散(lift)细胞，并且以270g旋转持续10分钟。将细胞沉淀物重悬在刺激缓冲液中，并且向每个孔添加4,000个细胞(10μl)。在室温孵育持续30min之后，按照制造商的使用说明添加eu-camp示踪剂和ulight-抗-camp工作溶液。在室温孵育持续1小时之后，在clariostar多模式读板器(bmgbiotech,carync)上读取tr-fret信号(ex337nm)。

使用非线性回归分析将在665nm处的荧光值对化合物浓度的对数绘图，以产生ec50值(graphpadprism,graphpadsoftware,inc.,sandiegoca)。ke值使用与钙动员方法中描述的相同的方程式来计算。

放射性配体结合测定。结合测定在500μl的最终体积的测定缓冲液(50mmtris-hcl、1mmmgcl2、60mmnacl、0.5％bsa，ph7.4)中，根据perkinelmer的方案进行。对于npff1，测定混合物包含25μl的0.065nm[¹²⁵i]npff(perkinelmer，kd＝0.11nm，nex381)、25μl的测试化合物(在8％dmso/测定缓冲液中以8x最终期望的浓度制备)以及150μl的cho-hnpffr1膜(1μg蛋白质/孔，perkinelmer，rbhnf1m400ua)。特异性结合被定义为在100nm最终非放射性标记的npff的不存在和存在下，[¹²⁵i]npff结合之间的差异。在27℃孵育持续120分钟之后，结合测定通过以下来终止：使用brandel(gaithersburg,md,usa)96孔收集器真空过滤到unifiltergf/c玻璃纤维过滤器(预浸泡在0.1％pei中)上，随后用冰冷的洗涤缓冲液(50mmtris-hcl、0.1％bsa，ph7.4)洗涤三次。将过滤器板在55℃干燥持续1小时。向每个孔添加microscint20(50μl)，并且在packardtopcountnxt微孔板闪烁和发光计数器上计数过滤器结合的放射性。将特异性[¹²⁵i]npff结合的百分比对化合物浓度的对数绘图。

使用graphpadprism(graphpadsoftware,inc.,sandiegoca)，将数据拟合到一个位点(拟合ki)竞争性结合模型，logec50＝log(10^logki*(1+放射性配体nm/hotkdnm))，以产生测试化合物的ki值。除了使用0.1nm[¹²⁵i]npff(perkinelmer，kd＝0.15nm，nex381)和cho-hnpffr2膜(1μg蛋白质/孔，perkinelmer，rbhnf2m400ua)之外，用相同的方案进行npff2结合测定。

动力学溶解度测定。将10μl的测试化合物储备溶液(10mmdmso)与490μl的pbs(磷酸二氢钾1mm、磷酸氢二钠3mm和氯化钠155mm缓冲液)合并。将溶液在室温在vx-2500多管漩涡混匀器(vwr)上搅拌持续2小时。搅拌后，将样品在玻璃纤维过滤器(1μm)上过滤，并且将洗脱物用乙腈:水(1:1)的混合物稀释200倍。在每个实验场合，尼卡地平(nicardipine)和丙咪嗪(imipramine)作为参考化合物，分别评估低溶解度和高溶解度。一式三份地评估所有样品，并且使用电喷雾离子化通过lc-ms/ms针对在相同基质中制备的标准品来分析。

双向mdck-mdr1渗透性测定。将第5代的mdck-mdr1细胞接种在12孔板中的可渗透聚碳酸酯载体上，并且允许生长和分化持续3天。在第3天，从transwell插入物的两侧去除培养基(补充有10％fbs的dmem)，并且用温的hbss冲洗细胞。在冲洗步骤之后，用温的转运缓冲液(包含10mmhepes、0.25％bsa的hbss，ph7.4)填充室，并且将板在37℃孵育持续30min，然后进行teer(跨上皮电阻)测量。

去除供体室(a-至-b测定的顶侧，b-至-a测定的基底侧)中的缓冲液，并且用工作溶液(转运缓冲液中的10μm测试品)替代。然后在轻微搅拌下将板放置在37℃。在指定的时间点(30min、60min和90min)，从接收室(receiverchamber)去除等分的转运缓冲液，并且用新鲜的转运缓冲液补充。样品用含有内标的冰冷的acn猝灭，并且然后离心以沉淀蛋白质。产生的上清液进一步用50/50acn/h2o(对于阿替洛尔(atenolol)仅h2o)稀释，并且提交用于lc-ms/ms分析。报告的表观渗透性(papp)值根据单次测定计算。阿替洛尔和普萘洛尔(propranolol)作为低渗透性参考和中等渗透性参考被测试。评估地高辛(digoxin)的双向转运以证明pgp活性/表达。

化合物的表观渗透性(papp，以cm/s计测量)根据以下式确定：

dq/dt是接收隔室中的净表观速率

a是以cm²计测量的transwell的面积(1.12cm²)

ci是添加至供体室的化合物的初始浓度

60是从分钟到秒的转换系数。

体内药理学。

动物。将称重225g-300g的成年雄性(n＝18)sprague-dawley大鼠(harlan,indianapolis,in)单独饲养在12/12小时的光照/黑暗周期中，在光照时间段期间进行行为实验。除了在测试时期期间，大鼠可以自由获得食物和水，并且根据国际疼痛研究协会(theinternationalassociationforthestudyofpain)的指南(zimmermann,m.,ethicalguidelinesforinvestigationsofexperimentalpaininconsciousanimals,pain,16,109-110,1983)和2011年实验动物护理和使用(thecareanduseoflaboratoryanimals)的指南(生命科学实验动物资源研究所，国家研究委员会，国家科学院，washington，dc(instituteoflaboratoryanimalresourcesonlifesciences,nationalresearchcouncil,nationalacademyofsciences,washington,dc))进行维护和实验，并且由动物护理和使用机构委员会(institutionalanimalcareandusecommittee),universityatbuffalo,thestateuniversityofnewyork(buffalo,ny)批准。

药物。芬太尼购自sigma-aldrich(st.louis,mo)，溶解在0.9％盐水中，并且以1ml/kg的体积皮下注射。将化合物16和化合物33溶解在盐水中的20％二甲基亚砜的媒介物中，并且以1ml/kg的体积腹膜内注射。

芬太尼诱导的痛觉过敏。痛感阈值使用校准的vonfrey丝(1.4g-26g；northcoastmedical,morganhill,ca)测量。将大鼠(n＝6只/组)放置在具有金属丝网底的高架塑料室(iitclifescienceinc.,woodlandhills,ca)内，并且在测试之前允许其习惯。将丝以丝力(filamentforce)的上升顺序，从最低的丝开始，从网底下方垂直于后足的足底内侧表面施加。施加丝直至屈曲发生持续约两秒。机械缩足阈值(pwt)对应于在三次施加的至少二次中引起缩后足的最低力。大于26g的力将使未经cfa处理的足物理地抬高，并且不反映疼痛样行为。

在芬太尼处理的前一天和芬太尼处理的当天(d-1和d0)，建立每只大鼠的痛感基线，然后进行4次0.06mg/kg芬太尼的皮下注射，每次以15min间隔注射，总剂量为0.24mg/kg。在一组大鼠中，在第1-5天进行pwt测量，以监测芬太尼诱导的痛觉过敏的发作和从其中的恢复。在另外两组大鼠中，化合物16和化合物33的抗痛感剂量-效应曲线在第1天使用多循环累积给药程序建立，其中测量在药物施用之前立即进行，然后在下一次注射之前在药物施用之后30min进行，并且针对在从3.2mg/kg-32mg/kg的范围内的剂量继续进行。

数据分析。对每个组中的pwt求平均值，并且将其绘制为剂量的函数。使用重复测量单因素anova，其中将时间或处理作为受试者内因素输入，随后使用bonferroni事后检验以确定统计学显著性。对于所有测试，p<0.05被认为是统计学显著的。

化合物16和化合物33的药理学评估

化合物16和化合物33被鉴定为有效的npff1拮抗剂，并且被选择用于进一步表征和评估。

在npff1和npff2钙动员测定中化合物16的浓度-响应曲线在图4中示出，其中a图示出了在npff1钙动员功能性ke测定中化合物16的拮抗剂活性，并且b图示出了在npff2钙动员功能性ke测定中化合物16的拮抗剂活性。a图示出了在稳定的npff1-rd-hga16细胞中单独的npff(○)和npff+5μm最终16(□)的浓度-响应曲线。b图示出了在稳定的npff2-rd-hga16细胞中单独的npff(○)和npff+10μm最终16(□)的浓度-响应曲线。在测试化合物的存在下npff曲线的右移被用于计算ke值。示出了来自一个实验的代表性数据，并且每个数据点是一式两份测定的平均值±sd。

在npff1和npff2camp测定中化合物16和化合物33的浓度-响应曲线在图5中示出，其中a图示出了在npff1camp功能性ke测定中化合物16和化合物33的拮抗剂活性，并且b图示出了在npff2camp功能性ke测定中化合物16和化合物33的拮抗剂活性。a图示出了在稳定的npff1-cho细胞中单独的npff(○)、npff+4μm最终16(□)和npff+2μm最终33(◇)的浓度-响应曲线。b图示出了在稳定的npff2-cho细胞中单独的npff(○)、npff+10μm最终16(□)和npff+10μm最终33(◇)的浓度-响应曲线。在测试化合物的存在下npff曲线的右移被用于计算ke值。每个数据点是一式两份进行的至少n＝3的平均值±sem。

在camp测定中，npff+16曲线在npff1细胞和npff2细胞两者中具有1.3的hill斜率(hillslope)，而npff+33曲线在npff1细胞和npff2细胞中分别具有1.4和1的hill斜率，因此指示这些化合物的活性不是由于聚集物的形成。这些结果与来自钙动员测定的结果相关，其中npff+16曲线在npff1细胞和npff2细胞中分别具有1.7和1.1的hill斜率，并且npff+33曲线在两种细胞系中具有1.4的hill斜率。

下表6列出了针对化合物1、化合物16和化合物33确定的选择的物理化学和初步adme(吸收、分布、代谢和排泄)性质。

表6

hbd：h键供体；hba：h键受体。n.d.：未确定。

化合物16和化合物33作为游离碱形式在动力学溶解度和双向mdck-mdr1渗透性测定中被测试。如表6中可见，化合物16可溶于水溶液，显示出146.8±6.9μm(平均值±％cv)的动力学溶解度，化合物16落在具有良好溶解度的化合物的范围内，而化合物33具有45.9±7.7μm的较低溶解度，这是对于具有较高分子量的较大分子所预期的。此外，这些化合物包含多于一个可质子化的氮原子，它们可以转化为盐形式，以提高溶解度和生物利用度。

中枢神经系统(cns)药物的主要挑战之一是它们穿越血脑屏障(bbb)并且到达cns的能力。对于大多数药物，bbb渗透性受两个因素影响：被动地渗透通过bbb的能力和避免通过转运蛋白诸如p-糖蛋白被外排。化合物16和化合物33在使用mdck-mdr1细胞的双向转运测定中被评估，所述mdck-mdr1细胞用人mdr1cdna稳定转染，并且与野生型相比表达更高水平的p-糖蛋白(pgp)。表6示出，化合物16以7.6×10^-6cm/s的速率从顶端(a)至基底侧(b)穿过细胞屏障，并且以6.7×10^-6cm/s的速率以反向方向b至a穿过细胞屏障，证明了中等的bbb渗透性(在3×10^-6cm/s-6×10^-6cm/s的范围内)。化合物33也能够穿透bbb，尽管与化合物16相比渗透性较低。如通过外排比率(pb→a/pa→b)指示的，两种化合物都不是pgp底物。总之，数据证明了这些化合物作为cns正向配体的特性。

化合物16和化合物33在大鼠中的抗痛觉过敏效果

化合物16和化合物33在大鼠的芬太尼诱导的痛觉过敏模型中被测试，结果在图6中示出，图6中的a图示出了芬太尼诱导的机械痛觉过敏的结果，并且图6中的b图示出了化合物16和化合物33的抗痛觉过敏效果(n＝6只/组)。图中的纵坐标是缩足阈值，以g计，并且横坐标是时间。与芬太尼处理前(第0天)相比或与“v”(媒介物)处理相比，p<0.05。

在芬太尼处理之前，经i.p.施用，测试大鼠显示出24.2±1.8g的平均缩足阈值(pwt)，该阈值在芬太尼施用之后第1天降低至5.7±0.8g。单因素重复测量anova(其中时间作为重复测量因素输入)揭示了芬太尼处理对缩足阈值的显著的主要效果(f(6,35)＝23.42，p<0.0001)。bonferroni事后检验揭示了第1天-第3天与第0天相比的显著差异。

如图6所示，当在第1天测试时，化合物16和化合物33两者在3.2mg/kg-32mg/kg的剂量范围内剂量依赖性地增加了pwt。用化合物16处理产生了显著的主要效果，如通过单因素重复测量anova确定的，其中处理作为受试者内因素输入：f(3,20)＝15.10，p<0.0001。此外，bonferroni事后检验揭示，10mg/kg和32mg/kg的16与媒介物相比的显著差异。类似地，用化合物33处理产生了显著的主要效果(f(3,20)＝12.45，p<0.001)，并且bonferroni事后检验揭示，32mg/kg的33与媒介物相比的显著差异。

前述结果证实了化合物16和化合物33在大鼠中逆转阿片类诱导的痛觉过敏(作为用于人类对这样的化合物响应的模型系统)的有效性。

__________

因此，本公开内容预期了包括根据本文的式(i)的化合物的神经肽ff受体调节剂，其中r2选自–n-(c2-c5烷基)2和nh-r1，其中r1选自c2-c9烷基、杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；r3选自c3-c9烷基、芳基、杂芳基、杂环、杂芳基烷基、杂环烷基和芳基烷基；r4选自h和c1-c2烷基；并且r5选自c3-c9烷基、杂芳基烷基、杂芳基、杂环烷基、杂环、环烷基烷基和芳基烷基；或其药学上可接受的盐。这样的神经肽ff受体调节剂可以由以下构成：r2为nh-r1，其中r1选自c3-c9烷基、杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；例如，r1可以是c3-c6烷基，或可选择地，r1可以是被低级烷氧基、硝基、低级烷基、卤素或卤化的低级烷基取代的苯乙基。

神经肽ff受体调节剂可以被构成为包括式ii的化合物，其中r2选自–n-(c2-c5烷基)2；并且x是s、so、so2、o、nh或ch2。

可选择地，神经肽ff受体调节剂可以被构成为包括式iia的化合物，其中r1选自c2-c9烷基、杂环烷基、环烷基烷基、氨基烷基和芳基烷基；并且x是s、so、so2、o、nh或ch2；例如，r1可以是被取代的或未被取代的c3-c6烷基、苄基或苯乙基，并且x可以是氧。更具体地，r1可以是c3-c6烷基，或者r1可以是被低级烷氧基、硝基、低级烷基、卤素或卤化的低级烷基取代的苯乙基。

神经肽ff受体调节剂可以被构成为包括式iii的化合物，其中r3选自c3-c9烷基、芳基、杂芳基、杂环、杂芳基烷基、杂环烷基和芳基烷基；并且r4选自h和c1-c2烷基。可以构成这样的调节剂，其中r3是苄基或被取代的苄基、苯乙基或被取代的苯乙基，并且r4是h。可选择地，可以构成这样的调节剂，其中r3是被甲氧基单取代的苄基；并且r4是h。作为另一种选择，可以构成这样的调节剂，其中r3是苄基或被取代的苄基，并且r4是甲基。作为仍然另外的选择，可以构成这样的调节剂，其中r3是c3-c6烷基。

神经肽ff受体调节剂可以被构成为包括式iv的化合物，其中r5选自c3-c9烷基、杂芳基烷基、杂芳基、杂环烷基、杂环、环烷基烷基和芳基烷基；并且x是s、so、so2、o、nh或ch2。可以构成这样的调节剂，其中r5是苄基或被取代的苄基，例如，其中r5是被单取代的苄基，并且取代基是在2位或3位的卤素或甲氧基。

在另一个方面中，神经肽ff受体调节剂可以由具有表1中就此列出的结构的化合物构成，其中r2选自由在这样的表中列出的r2种类组成的组。

在另外的方面中，神经肽ff受体调节剂可以由具有表2中就此列出的结构的化合物构成，其中r1选自由在这样的表中列出的r1种类组成的组。

在另外的方面中，神经肽ff受体调节剂可以由具有表3中就此列出的结构的化合物构成，其中r3和r4选自由在这样的表中列出的r3和r4种类组成的组。

在又另一个方面中，神经肽ff受体调节剂可以由具有表4中就此列出的结构的化合物构成，其中r5选自由在这样的表中列出的r5种类组成的组。

在另外的方面中，神经肽ff受体调节剂可以由以下化合物构成：

在仍然另外的方面中，神经肽ff受体调节剂可以由以下化合物构成：

本公开内容还预期了药物组合物，该药物组合物包含如本文多方面地描述的神经肽ff受体调节剂和药学上可接受的载体。药物组合物还可以包含阿片类药物，例如，选自由以下组成的组的至少一种：芬太尼、吗啡、羟考酮、氢可酮和丁丙诺啡。可选择地，药物组合物还可以包含抗精神病药物，例如，选自由氟哌啶醇和阿立哌唑组成的组的至少一种。作为仍然另外的选择，药物组合物还可以包含单胺再摄取抑制剂，例如，选自由氟西汀和舍曲林组成的组的至少一种。

本公开内容还预期了用于治疗患有或易患其中神经肽ff受体活性的调节具有治疗益处的状况或紊乱的受试者的方法，所述方法包括向患有或易患这样的状况或紊乱的受试者施用治疗有效量的如本文多方面地描述的神经肽ff受体调节剂。在这样的方法中，状况或紊乱可以包括使用或滥用一种或更多种阿片类药物，例如，芬太尼、吗啡、羟考酮、氢可酮、丁丙诺啡、海洛因以及前述药物的阿片类衍生物。在上文广泛描述的方法中，治疗益处可以包括阿片类诱导的痛觉过敏的至少部分减轻，例如，其中阿片类诱导的痛觉过敏由包括选自由以下组成的组的至少一种的阿片类药物诱导：芬太尼、吗啡、羟考酮、氢可酮和丁丙诺啡。可以进行上文广泛描述的方法，其中如本文多方面地描述构成的神经肽ff受体调节剂的施用在治疗性干预中进行，所述治疗性干预包括共施用神经肽ff受体调节剂减轻其副作用的药物，例如，其中神经肽ff受体调节剂减轻其副作用的药物是产生耐受性或痛觉过敏作为副作用的药物。

上文广泛描述的方法可以在具体实施方式中进行，还包括施用有效量的第二治疗有效的剂。可选择地，上文广泛描述的方法可以在其他具体实施方式中进行，其中所述其中神经肽ff受体活性的调节具有治疗益处的状况或紊乱选自由以下组成的组：阿片类耐受性的减轻和痛觉过敏的减轻。

因此，将理解，本公开内容预期了各种各样的化合物、神经肽ff受体调节剂、药物组合物和治疗组合物和制剂，以及制备和使用前述各项的方法。

因此，虽然在本文中已经参考本发明的特定方面、特征和例证性的实施方案描述了本发明，但将理解，本发明的效用没有因此被限制，而是扩展至并且涵盖许多其他变型、修改和可选择的实施方案，基于本文的描述，本公开内容的领域中的普通技术人员将会想到这些变型、修改和可选择的实施方案。相应地，如在权利要求中所要求保护的主题意图被广泛地解释和理解为包括在其精神和范围内的所有这样的变型、修改和可选择的实施方案。