肝细胞癌的风险评价方法与流程

本发明涉及利用了甲基化dna的检测的肝细胞癌的风险评价方法。

背景技术：

肝细胞癌(hcc)是全世界熟知的恶性肿瘤，并且可知其主要的发生要因是肝炎病毒的感染。作为肝细胞癌的发生要因的肝炎病毒主要是乙型肝炎病毒(hbv)和丙型肝炎病毒(hcv)。hcc通常在患有与肝炎病毒感染相关的慢性肝炎或肝硬化的患者中发病。而且，该患者中的大部分由于在hcc发病的阶段肝功能已经降低，因此，除非早期诊断为癌症，否则无法期待良好的治疗成果。因此，应优先进行慢性肝炎、肝硬化之类的前癌状态的监测(经过观察)。特别是对于具有高hcc发生风险的患者，即使没有主观症状，也应该进行密切监测而在早期发现hcc并进行治疗。另一方面，对没有hcc发生风险的患者而言，密切监测成为过度的负担。因此，为了对慢性肝炎、肝硬化之类的前癌状态的患者进行适当的管理，hcc发生的风险评价非常重要。

dna甲基化的变化是最普遍被观察到的伴随癌发生的表观遗传改变之一。表明dna甲基化的变化也参与早期癌症和前癌阶段。报告了在由hcc患者得到的可见慢性肝炎或肝硬化的肝脏组织中，发生了与dna甲基化转移酶的剪接和/或表达的异常相关的dna甲基化的变化。

此外，根据本发明人的研究，到此为止提出了一种方法，该方法通过焦磷酸测序、质谱等来检测肝脏组织的基因组dna的特定的cpg位点的dna甲基化水平，将检测出的dna甲基化水平与用于判别为非癌肝脏组织样品的截止值进行比较，从而评价患者的hcc的风险(专利文献1)。该方法实现了灵敏度和特异性高的hcc风险评价。然而，希望一种能够在确保高度的灵敏度和特异性的同时更高效且低成本地评价hcc的风险的方法。

最近，公开了一种通过将用亚硫酸氢盐进行了处理的样品dna供给到离子交换色谱来检测甲基化dna的方法(专利文献2)。此外，本发明人等提出了一种利用该原理将用亚硫酸氢盐进行了处理的样品dna供给到离子交换色谱，并基于其保留时间来判定肾细胞癌的预后的方法(专利文献3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开公报第2012/102377号

专利文献2：国际公开公报第2014/136930号

专利文献3：国际公开公报第2015/129916号

技术实现要素：

基于使用了焦磷酸测序等的dna甲基化水平的检测的肝细胞癌(hcc)的风险评价法(例如专利文献1)虽然灵敏度和特异性高，但存在dna甲基化水平的检测耗费时间、劳力、成本的难点。本发明提供具有高灵敏度和特异性的同时简便、迅速且低成本的hcc的风险评价方法。

本发明人等发现，将由受验体的肝脏组织得到的包含cpg位点的样品dna用亚硫酸氢盐进行处理，将dna进行扩增，将该扩增产物用离子交换色谱进行分离，从而能够简便且迅速地检测该cpg位点的dna甲基化。此外，本发明人等发现通过该色谱得到的检测信号的峰形状在hcc高风险组和低风险组中不同。通过该色谱得到的检测信号的峰形状成为hcc的风险评价的指标。

进一步令人吃惊的是，本发明人等发现在通过上述使用离子交换色谱的cpg位点的dna甲基化分析进行的hcc的风险评价中，在将特定的cpg位点作为分析对象时，与其它cpg位点相比，能够实现显著高的灵敏度和特异性。因此，通过将该使用离子交换色谱的dna甲基化分析与作为该特定的cpg位点的样品的利用进行组合，可实现兼具简便性和迅速性以及高度的灵敏度和特异性的hcc的风险评价。

因此，本发明提供以下方案。

〔1〕一种评价肝细胞癌的风险的方法，包括如下工序：

(1)将经亚硫酸氢盐处理的来自受验体的肝脏组织的dna进行扩增的工序，其中，该dna包含mgrn1基因的外显子区域的cpg位点，

(2)将得到的扩增产物供给到离子交换色谱的工序，

(3)基于该色谱的检测信号的峰的形状来判定该dna是否是由肝细胞癌的发病风险高的受验体得到的dna的工序。

〔2〕一种评价肝细胞癌的风险的方法，包括如下工序：

(1)将经亚硫酸氢盐处理的来自受验体的肝脏组织的dna进行扩增的工序，其中，该dna包含mgrn1基因的外显子区域的cpg位点，

(2)将得到的扩增产物供给到离子交换色谱的工序，

(3)基于该色谱的检测信号的峰的形状来判定该受验体的肝细胞癌的发病风险是否高的工序。

〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述dna包含由序列号1所示的核苷酸序列或者与该序列具有至少95％同源性的核苷酸序列构成的dna。

〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其中，所述(3)中，所述检测信号的峰的形状为单峰的甲基化dna的峰时，选择该dna作为由肝细胞癌的发病风险高的受验体得到的dna，所述检测信号的峰的形状为双峰性时，选择该dna作为由肝细胞癌的发病风险低的受验体得到的dna。

〔5〕根据〔4〕所述的方法，其中，所述(3)包括通过将所述检测信号的峰的保留时间与阳性对照或阴性对照的检测信号的峰的保留时间进行比较来确认获得所述甲基化dna的峰，

该阳性对照的检测信号是通过将由与来自所述受验体的肝脏组织的dna相同的序列构成且100％甲基化的dna被亚硫酸氢盐处理和扩增时得到的dna供给到离子交换色谱而得到的，

该阴性对照的检测信号是通过将由与来自该受验体的肝脏组织的dna相同的序列构成且没有甲基化的dna被亚硫酸氢盐处理和扩增时得到的dna供给到离子交换色谱而得到的。

〔6〕根据〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法，其中，所述离子交换色谱为阴离子交换色谱。

根据本发明，与以通过焦磷酸测序等而检测的dna甲基化水平为指标的现有方法(例如专利文献1)相比，能够在维持高度的检测灵敏度和特异性的同时更简便且迅速地评价肝细胞癌的风险。

附图说明

图1是由来自hcc患者的非癌肝脏组织样品(n组)的liv25区域得到的色谱图的例子。各图表示来自各个样品的数据，各图中的符号表示样品id。

图2是图1的数据的一次微分值的图表。

图3是由健康肝脏组织样品(c组)的liv25区域得到的色谱图的例子。各图表示来自各个样品的数据，各图中的符号表示样品id。

图4是图3的数据的一次微分值的图表。

具体实施方式

本说明书中，“肝细胞癌”(hepatocellularcarcinoma；也称为hcc)是指由肝脏的实质即肝细胞产生的原发性肝癌。

本说明书中，“肝细胞癌的风险”是指肝细胞癌的发生风险。

本说明书中，“cpg位点”是指dna序列上胞嘧啶(c)与鸟嘌呤(g)之间进行磷酸二酯键合(p)的部位。

本说明书中，“dna甲基化”是指在上述cpg位点中，胞嘧啶的5位的碳被甲基化的状态。

本说明书中，dna的“甲基化水平”是指该dna的甲基化的比例(也称为甲基化率)。

本说明书中，关于核苷酸序列的“至少95％同源性”是指95％以上、优选97％以上、更优选98％以上、进一步优选99％以上、进一步优选99.5％以上的同源性。

在一个实施方式中，本发明提供评价hcc的风险的方法，包括以下的工序：

(1)将经亚硫酸氢盐处理的来自受验体的肝脏组织的dna进行扩增的工序，其中，该dna包含mgrn1基因的外显子区域的cpg位点，

(2)将得到的扩增产物供给到离子交换色谱的工序，

(3)基于该色谱的检测信号的峰的形状来判断该dna是否是由hcc的发病风险高的受验体得到的dna的工序。

在另一个实施方式中，本发明提供评价hcc的风险的方法，包括以下的工序：

(1)将经亚硫酸氢盐处理的来自受验体的肝脏组织的dna进行扩增的工序，其中，该dna包含mgrn1基因的外显子区域的cpg位点；

(2)将得到的扩增产物供给到离子交换色谱的工序；

(3)基于该色谱的检测信号的峰的形状来判定该受验体是否是hcc的发病风险高的受验体的工序。

本发明中，由受验体得到的来自肝脏组织的包含mgrn1基因的外显子区域的cpg位点的dna(以下的本说明书中，也称为样品dna)被亚硫酸氢盐处理，接着，被扩增。

作为本发明的“受验体”，没有特别限制，例如可举出健康人以及乙型肝炎感染者、丙型肝炎感染者、慢性肝炎的患者、肝硬化的患者、肝细胞癌患者和疑似患有这些疾病的患者。优选该受验体为具有乙型肝炎、丙型肝炎、慢性肝炎或肝硬化的人，它们通常作为患肝细胞癌的可能性高的人被熟知。

作为制备本发明中使用的“来自肝脏组织的dna”的方法，没有特别限制，可以适当选择公知的方法而使用。作为制备基因组dna的公知的方法，例如可举出酚氯仿法(将肝脏组织用蛋白质分解酶(proteinasek)、表面活性剂(sds)和苯酚进行处理而使该组织的蛋白质变性，接着，用氯仿、乙醇等使dna沉淀而从该组织提取的方法)，使用市售的dna提取试剂盒、例如qiaampdnaminikit(qiagen公司制)、cleancolumns(nextec公司制)、aquapure(bio－rad公司制)、zrplant/seeddnakit(zymoresearch公司制)、prepgem(zygem公司制)、buccalquick(trimgen公司制)等的dna提取方法等。

作为利用该方法制备基因组dna的肝脏组织，没有特别限制，例如可举出在活检等时直接采取的肝脏组织、冷冻的肝脏组织、甲醛固定或石蜡包埋的肝脏组织等。从抑制组织中的基因组dna的分解的观点考虑，优选使用冷冻的肝脏组织。本发明中，基因组dna的制备中使用的肝脏组织的状态(慢性肝炎和肝硬化的阶段、肝炎病毒感染、炎症或纤维化等)和距肝细胞癌的病灶的距离没有特别限制。

本发明中的“mgrn1基因的外显子区域的cpg位点”是指ncbigeneid：23295([www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/23295])所示的人mgrn1(mahoguninringfinger1)基因的外显子区域的cpg位点。

本发明中使用的样品dna是包含mgrn1基因的外显子区域的cpg位点的dna。例如，该样品dna是包含位于mgrn1基因外显子的上游区域的cpg位点的dna。作为这样的样品dna的例子，可举出由序列号1所示的核苷酸序列构成的dna。或者，来自mgrn1基因的外显子区域且由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列构成的dna也是本发明的样品dna的例子。优选该样品dna包含由序列号1所示的核苷酸序列、或者与该序列具有至少95％同源性的核苷酸序列构成的dna，更优选为由序列号1所示的核苷酸序列构成的dna。

样品dna的亚硫酸氢盐处理的方法没有特别限制，可以适当选择公知的方法来使用。作为用于亚硫酸氢盐处理的公知的方法，例如可举出使用后述的epitectbisulfitekit(48)(qiagen公司制)、methyleasy(humangeneticsignaturespty公司制)、cells－to－cpgbisulfiteconversionkit(appliedbiosystems公司制)、cpgenometurbobisulfitemodificationkit(merckmillipore公司制)等市售的试剂盒的方法。

作为将经亚硫酸氢盐处理的样品dna进行扩增的方法，可举出pcr等任意的核酸扩增方法，没有特别限定。扩增反应的条件也没有特别限制，可以根据扩增对象的dna的序列、长度、量等适当选择公知的方法而使用。优选该dna通过pcr进行扩增。扩增产物的链长可以考虑扩增反应时间的缩短以及离子交换色谱中的分析时间的缩短、分离性能的维持等要素而适当调节。例如，pcr扩增产物的链长优选1000bp以下，更优选500bp以下，进一步优选300bp以下。另一方面，为了避免非特异性扩增，pcr用引物链长优选为15mer以上，因此，pcr扩增产物的链长优选31bp以上，更优选40bp以上。

作为用于本发明的dna的pcr扩增的引物组的优选的例子，可举出序列号4和5所示的引物组。该pcr的条件的优选的例子为[94℃1分钟→64℃1分钟→72℃1分钟]×5个循环→[94℃1分钟→62℃1分钟→72℃1分钟]×5个循环→[94℃1分钟→60℃1分钟→72℃1分钟]×5个循环→[94℃1分钟→58℃1分钟→72℃1分钟]×35个循环，但并不限定于此。

接下来，本发明中，将上述扩增工序中得到的经亚硫酸氢盐处理的样品dna的扩增产物供给到离子交换色谱。本发明中进行的离子交换色谱优选阴离子交换色谱。作为本发明中进行的离子交换色谱中使用的柱的填充剂，只要是在表面具有强阳离子性基团的基材粒子就没有特别限定，但优选国际公开公报第2012/108516号所示的在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者的基材粒子。

本说明书中，强阳离子性基团是指在ph为1～14的广范围解离的阳离子性基团。即，该强阳离子性基团能够不受水溶液的ph的影响而保持解离的(阳离子化的)状态。

作为该强阳离子性基团，可举出季铵基。具体而言，例如可举出三甲基铵基、三乙基铵基、二甲基乙基铵基等三烷基铵基等。另外，作为该强阳离子性基团的抗衡离子，例如可举出氯化物离子、溴化物离子、碘化物离子等卤化物离子。

存在于该基材粒子的表面的该强阳离子性基团量没有特别限定，相对于填充剂的干燥重量的优选的下限为1μeq/g，优选的上限为500μeq/g。如果该强阳离子性基团量小于1μeq/g，则有时保持力弱且分离性能变差。如果该强阳离子性基团量超过500μeq/g，则有时产生保持力变得过强而无法将dna容易地溶出、分析时间变得过长等问题。

本说明书中，弱阳离子性基团是指pka为8以上的阳离子性基团。即，该弱阳离子性基团受到水溶液的ph的影响，解离状态发生变化。即，如果ph变得比8高，则该弱阳离子性基团的质子解离，不具有正电荷的比例增加。相反，如果ph变得比8低，则该弱阳离子性基团质子化，具有正电荷的比例增加。

作为该弱阳离子性基团，例如可举出叔氨基、仲氨基、伯氨基等。其中，优选为叔氨基。

存在于该基材粒子的表面的该弱阳离子性基团量没有特别限定，相对于填充剂的干燥重量的优选的下限为0.5μeq/g，优选的上限为500μeq/g。如果该弱阳离子性基团量小于0.5μeq/g，则有时变得过少而分离性能没有提高。如果该弱阳离子性基团量超过500μeq/g，则有时与强阳离子性基团同样地产生保持力变得过强而无法将dna容易地洗脱、分析时间变得过长等问题。

该基材粒子表面的强阳离子性基团或弱阳离子性基团的量可以通过对基团中所含的氮原子进行定量来测定。作为对氮进行定量的方法，例如可举出凯氏定氮法。例如，在具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团的基材粒子的情况下，首先，在疏水性交联聚合物与强阳离子性基团的聚合后对强阳离子性基团中所含的氮进行定量。接着，对该聚合物导入弱阳离子性基团，对强阳离子性基团和弱阳离子性基团中所含的氮的合计量进行定量。可以由求出的值算出弱阳离子性基团中所含的氮量。如此可以基于基团的氮原子的定量值将填充剂中所含的强阳离子性基团量和弱阳离子性基团量调整为上述范围内。

作为该基材粒子，例如可以使用利用聚合性单体等得到的合成高分子微粒、二氧化硅系等无机微粒等，但优选为由合成有机高分子构成的疏水性交联聚合物粒子。

该疏水性交联聚合物可以为将至少1种疏水性交联性单体与至少1种具有反应性官能团的单体共聚而得到的疏水性交联聚合物、将至少1种疏水性交联性单体、至少1种具有反应性官能团的单体和至少1种疏水性非交联性单体共聚而得到的疏水性交联聚合物中的任一者。

作为该疏水性交联性单体，只要在单体1分子中具有2个以上乙烯基基的单体就没有特别限定，例如可举出乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯等二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯等三(甲基)丙烯酸酯或四(甲基)丙烯酸酯、或者二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、二乙烯基萘等芳香族系化合物。应予说明，本说明书中，上述(甲基)丙烯酸酯是指丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯，(甲基)丙烯酸是指丙烯酸或甲基丙烯酸。

作为该具有反应性官能团的单体，可举出(甲基)丙烯酸缩水甘油酯酯、异氰酸酯乙基(甲基)丙烯酸酯等。

作为该疏水性非交联性单体，只要是具有疏水性的性质的非交联性的聚合性有机单体就没有特别限定，例如可举出(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯等(甲基)丙烯酸酯、苯乙烯、甲基苯乙烯等苯乙烯系单体。

该疏水性交联聚合物为将该疏水性交联性单体与该具有反应性官能团的单体共聚而得到的共聚物时，该疏水性交联聚合物中的来自该疏水性交联性单体的链段的含有比例的优选的下限为10重量％，更优选的下限为20重量％。

本发明中使用的离子交换色谱用填充剂优选为在该基材粒子的表面包含具有该强阳离子性基团和该弱阳离子性基团的聚合物层的填充剂。另外，在具有该强阳离子性基团和弱阳离子性基团的聚合物中，该强阳离子性基团和该弱阳离子性基团优选分别来自独立的单体。具体而言，本发明中使用的离子交换色谱用填充剂优选在由该疏水性交联聚合物粒子和共聚于该疏水性交联聚合物粒子的表面的具有该强阳离子性基团的亲水性聚合物的层构成的被覆聚合物粒子的表面导入有该弱阳离子性基团。

具有该强阳离子性基团的亲水性聚合物由具有该强阳离子性基团的亲水性单体构成，可以含有来自1种以上具有该强阳离子性基团的亲水性单体的链段。即，作为制造具有该强阳离子性基团的亲水性聚合物的方法，可举出使具有该强阳离子性基团的亲水性单体单独聚合的方法、使2种以上具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法、使具有该强阳离子性基团的亲水性单体与不具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法等。

作为具有该强阳离子性基团的亲水性单体，优选为具有季铵基的单体。具体而言，例如可举出甲基丙烯酸乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酸乙基三乙基氯化铵、甲基丙烯酸乙基二甲基乙基氯化铵、甲基丙烯酸乙基二甲基苄基氯化铵、丙烯酸乙基二甲基苄基氯化铵、丙烯酸乙基三甲基氯化铵、丙烯酸乙基三乙基氯化铵、丙烯酸乙基二甲基乙基氯化铵、丙烯酰胺乙基三甲基氯化铵、丙烯酰胺乙基三乙基氯化铵、丙烯酰胺乙基二甲基乙基氯化铵等。

作为在该疏水性交联聚合物的表面形成具有该强阳离子性基团的亲水性聚合物的层的方法，可举出使具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚于该疏水性交联聚合物的表面的方法。

作为对该被覆聚合物粒子的表面导入弱阳离子性基团的方法，可以使用公知的方法。具体而言，例如，作为导入叔氨基作为该弱阳离子性基团的方法，可举出使具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚于具有来自具有缩水甘油基的单体的链段的疏水性交联聚合物粒子的表面，接着，使具有叔氨基的试剂与该缩水甘油基反应的方法；使具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚于具有来自具有异氰酸酯基的单体的链段的疏水性交联聚合物粒子的表面，接着，使具有叔氨基的试剂与该异氰酸酯基反应的方法；在该疏水性交联聚合物粒子的表面使具有该强阳离子性基团的亲水性单体与具有叔氨基的单体共聚的方法；使用具有叔氨基的硅烷偶联剂对包含具有该强阳离子性基团的亲水性聚合物的层的被覆聚合物粒子的表面导入叔氨基的方法；将具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚于具有来自具有羧基的单体的链段的疏水性交联聚合物粒子的表面，接着，使用碳二亚胺使该羧基与具有叔氨基的试剂缩合的方法；将具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚于具有来自具有酯键的单体的链段的疏水性交联聚合物粒子的表面，将该酯键部水解，接着，使用碳二亚胺使通过该水解而生成的羧基与具有叔氨基的试剂进行缩合的方法等。其中，优选将具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚于具有来自具有缩水甘油基的单体的链段的疏水性交联聚合物粒子的表面，接着，使具有叔氨基的试剂与该缩水甘油基反应的方法；将具有该强阳离子性基团的亲水性单体共聚于具有来自具有异氰酸酯基的单体的链段的疏水性交联聚合物粒子的表面，接着，使具有叔氨基的试剂与该异氰酸酯基反应的方法。

作为与缩水甘油基、异氰酸酯基等反应性官能团反应的具有叔氨基的试剂，只要是具有叔氨基和能够与该反应性官能团反应的官能团的试剂就没有特别限定。作为能够与该反应性官能团反应的官能团，例如可举出伯氨基、羟基等。其中，优选在末端具有伯氨基的基团。作为具有该官能团的具体的具有叔氨基的试剂，可举出n,n－二甲基氨基甲胺、n,n－二甲基氨基乙胺、n,n－二甲基氨基丙胺、n,n－二甲基氨基丁胺、n,n－二乙基氨基乙胺、n,n－二乙基氨基丙胺、n,n－二乙基氨基丁胺、n,n－二乙基氨基戊胺、n,n－二乙基氨基己胺、n,n－二丙基氨基丁胺、n,n－二丁基氨基丙胺等。

该强阳离子性基团、优选为季铵盐与该弱阳离子性基团、优选为叔氨基的相对的位置关系优选该强阳离子性基团位于与该弱阳离子性基团相比距离基材粒子的表面远的位置、即外侧。例如，优选该弱阳离子性基团位于距离基材粒子表面以内，该强阳离子性基团位于距离基材粒子表面以内且比弱阳离子性基团更靠外侧。

本发明中使用的离子交换色谱用填充剂所使用的该基材粒子的平均粒径没有特别限定，优选的下限为0.1μm，优选的上限为20μm。如果该平均粒径小于0.1μm，则有时柱内变得过于高压而引起分离不良。如果该平均粒径超过20μm，则有时柱内的无效体积变得过大而引起分离不良。应予说明，本说明书中，平均粒径表示体积平均粒径，可以使用粒度分布测定装置(accusizer780/particlesizingsystems公司制等)进行测定。

对该离子交换色谱柱的试样注入量没有特别限定，只要根据柱的离子交换容量和试样浓度适当调整即可。流速优选0.1ml/min～3.0ml/min，更优选0.5ml/min～1.5ml/min。如果流速变慢，则虽然可以期待分离的提高，但如果变得过慢，则分析需要长时间，或者有可能招致因峰的宽化引起的分离性能的降低。相反，如果流速变快，则在分析时间的缩短方面有优势，但由于峰被压缩而招致分离性能的降低。因此，虽然是根据柱的性能适当调整的参数，但优选设定为该流速的范围。各样品的保留时间可以通过对各样品进行预备实验而预先决定。送液方法可以使用线性梯度洗脱法、阶梯式洗脱法等公知的送液方法，作为本发明中的送液方法，优选线性梯度洗脱法。梯度(gradient)的大小只要将洗脱中使用的洗脱液在0％～100％的范围内根据柱的分离性能和分析对象物(在此为上述扩增工序中得到的扩增产物dna)的特性进行适当调整即可。

作为本发明中进行的离子交换色谱所使用的洗脱液的组成，可以使用公知的条件。

作为该洗脱液中使用的缓冲液，优选使用公知的含有盐化合物的缓冲液类、有机溶剂类。具体而言，例如可举出tris盐酸缓冲液、由tris和edta构成的te缓冲液、由tris、硼酸和edta构成的tba缓冲液等。

该洗脱液的ph没有特别限定，优选的下限为5，优选的上限为10。认为通过设定为该范围，该弱阳离子性基团也有效地作为离子交换基团(阴离子交换基团)发挥作用。该洗脱液的ph的更优选的下限为6，更优选的上限为9。

作为该洗脱液中所含的盐，例如可以使用氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾等由卤化物和碱金属构成的盐；氯化钙、溴化钙、氯化镁、溴化镁等由卤化物和碱土金属构成的盐；高氯酸钠、高氯酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾等无机酸盐等。另外，也可以使用乙酸钠、乙酸钾、琥珀酸钠、琥珀酸钾等有机酸盐。该盐均可单独或组合使用。

作为该洗脱液的盐浓度，只要根据分析条件适当调整即可，优选的下限为10mmol/l，优选的上限为2000mmol/l，更优选的下限为100mmol/l，更优选的上限为1500mmol/l。

进而，为了进一步提高分离性能，可在该洗脱液中含有反离液离子。反离液离子具有与离液离子相反的性质，具有使水合结构稳定化的作用。因此，具有增强填充剂与核酸分子之间的疏水性相互作用的效果。本发明中使用的离子交换色谱的主要的相互作用是静电相互作用，此外，通过也利用疏水性相互作用的作用，分离性能提高。

作为该洗脱液中所含的反离液离子，可举出磷酸离子(po4^3-)、硫酸离子(so4^2-)、铵离子(nh4⁺)、钾离子(k⁺)、钠离子(na⁺)等。这些离子的组合中，优选使用硫酸离子和铵离子。该反离液离子均可单独或组合使用。应予说明，该反离液离子的一部分可含有上述洗脱液中所含的盐、缓冲液的成分。这样的成分由于具备作为洗脱液中所含的盐的性质或缓冲能力和作为反离液离子的性质这两者，因此，适于本发明。

该洗脱液中所含的反离液离子的浓度只要根据分析对象物而适当调整即可，以反离液盐计优选为2000mmol/l以下。具体而言，可举出使反离液盐的浓度在0～2000mmol/l的范围内进行梯度洗脱的方法。因此，色谱分析开始时的反离液盐的浓度不需要为0mmol/l，另外，分析结束时的反离液盐的浓度也不需要为2000mmol/l。该梯度洗脱的方法可以为低压梯度法，也可以为高压梯度法，优选一边进行利用高压梯度法的精密的浓度调整一边进行洗脱的方法。

该反离液离子可以仅添加于溶出所使用的洗脱液中的1种，也可以添加于多种洗脱液。另外，该反离液离子可以具备增强填充剂与dna之间的疏水性相互作用的效果或缓冲能力以及使扩增产物dna从柱洗脱的效果这两者的作用。

在本发明中使用的离子交换色谱中，对上述扩增工序中得到的扩增产物dna进行分析时的柱温优选为30℃以上，更优选为40℃以上，进一步优选为45℃以上，还优选为60℃以上。如果该柱温小于30℃，则填充剂与该扩增产物dna之间的疏水性相互作用变弱，难以得到期望的分离效果。另一方面，如果离子交换色谱的柱温变高，则来自甲基化dna的扩增产物与来自非甲基化dna的扩增产物更清楚地分离。该柱温为60℃以上时，来自甲基化dna的扩增产物与来自非甲基化dna的扩增产物的之间的色谱检测信号的峰的保留时间的差扩大，且各个的峰也更清楚，因此，能够进行精度更好的dna的甲基化的检测和hcc的风险的评价。

另一方面，如果离子交换色谱的柱温度为90℃以上，则扩增产物dna的双链解离，因此，在分析上不优选。进而，如果柱温为100℃以上，则有可能产生洗脱液的沸腾，因此，在分析上不优选。因此，在本发明中使用的离子交换色谱中，对扩增产物dna进行分析时的柱温只要为30℃以上且小于90℃即可，优选为40℃以上且小于90℃，更优选为45℃以上且小于90℃，进一步优选为55℃以上且小于90℃，进一步优选为60℃以上且小于90℃，进一步优选为55℃以上且85℃以下，还优选为60℃以上且85℃以下。

mgrn1基因的外显子区域的cpg位点的甲基化可以作为用于评价hcc的风险的指标使用(专利文献1；日本特开2010－148426号公报；intjcancer,2009,125,2854-2862；intjcancer,2011,129,1170-1179)。因此，可以基于包含该mgrn1基因的外显子区域的cpg位点的样品dna的甲基化水平来评价hcc的风险。本发明中，样品dna的甲基化水平以上述离子交换色谱分析中得到的检测信号的峰形状不同的形式呈现。

对dna进行亚硫酸氢盐处理时，该dna中的非甲基化·br>v胞嘧啶变换为尿嘧啶，但甲基化胞嘧啶仍是胞嘧啶。如果对该经亚硫酸氢盐处理的dna进行扩增，则来自非甲基化胞嘧啶的尿嘧啶进一步被置换为胸腺嘧啶，因此，在甲基化dna与非甲基化dna之间，胞嘧啶与胸腺嘧啶的存在比率产生差异。因此，所扩增的dna具有与甲基化对应的不同的序列。如果将该具有不同的序列的dna供给到离子交换色谱，则可得到显示与该序列的不同相应的不同的信号的色谱图。

更详细而言，在上述离子交换色谱分析中，dna的甲基化水平的高度反映于检测信号的峰的保留时间。例如，在该离子交换色谱分析中，100％甲基化dna与非甲基化dna可以分别作为独立的峰进行检测，典型而言，甲基化dna的峰以比非甲基化dna的峰短的保留时间出现(参照专利文献2)。因此，在样品dna中不存在甲基化的dna或其量为微量时，该色谱的检测信号的峰成为仅出现非甲基化dna的峰的单峰的形状。另一方面，样品dna中甲基化dna的比率增加时，以更短的保留时间另行出现甲基化dna的峰，该检测信号成为具有甲基化dna的峰和非甲基化dna的峰的双峰性的形状。此时，如果样品dna中的dna甲基化的比例低，则第二个峰的甲基化dna的峰作为第一个峰的非甲基化dna的峰的斜面上的鼓起或肩出现。进而，如果甲基化dna的比例上升，第二个峰的峰可清楚地出现。进而，如果甲基化dna的比例上升而甲基化dna变得优势，则第一个峰的峰变小，可作为第二个峰的峰的斜面上的鼓起或肩出现。进而，如果dna的甲基化进行并且样品dna被大致完全地甲基化，则该检测信号的峰成为仅出现甲基化dna的峰的单峰的形状。如此，样品dna的离子交换色谱分析中得到的信号的峰形状表示该样品dna的甲基化水平。

该样品dna的色谱分析中得到的信号的峰形状反映该dna甲基化水平，在与hcc的风险之间具有相关性。因此，可以基于本发明的离子交换色谱的检测信号的峰的形状来评价受验体的hcc的发病风险。该检测信号的峰中甲基化dna的峰的成分越多，表示肝脏组织中癌化进行，受验体的hcc的风险更高。另一方面，该检测信号的峰中非甲基化dna的峰的成分越多，表示肝脏组织中癌化没有进行，受验体的hcc的风险更低。

在本发明的优选的实施方式中，可判断该离子交换色谱的检测信号的峰的形状为单峰或双峰性。在此，单峰是指甲基化dna的峰作为单峰的峰出现。峰的形状为单峰或双峰性的判断可以由将该检测信号对保留时间绘图而成的曲线的形状进行判断，或者为了更精密的分析，可以基于该检测信号的微分值进行判断。例如，将检测信号的一次微分值对保留时间进行绘图时，在以具有2个以上极大值的曲线表示的情况下，可判断该检测信号的峰的形状为双峰性。

在本发明的一个实施方式中，基于该色谱的检测信号的峰的形状来判断该样品dna是否是由hcc的发病风险高的受验体得到的dna。优选该峰为单峰时，判定该样品dna是由hcc的发病风险高的受验体得到的dna，该峰为双峰性时，判定该样品dna是由hcc的发病风险低的受验体得到的dna。

在本发明的另一个实施方式中，基于该色谱的检测信号的峰的形状来判定该受验体是否是hcc的发病风险高的受验体。优选该峰为单峰时，判定该受验体为hcc的发病风险高的受验体，该峰为双峰性时，判定该受验体为hcc的发病风险低的受验体。

作为判定该色谱的检测信号的峰的有无的方法，可举出使用已有的数据处理软件例如lcsolution(岛津制作所)、grams/ai(thermofisherscientific公司)、igorpro(wavemetrics公司)等的峰检测。例示使用了lcsolution的峰的有无的判定方法。具体而言，首先指定要检测出峰的保留时间的区间。接着，为了除去噪音等不需要的峰，设定各种参数。例如，可举出通过使参数“width”大于不需要的峰的半峰宽、使参数“slope”大于不需要的峰的上升斜率、改变参数“drift”的设定来选择垂直分割或基线分割分离度低的峰等。参数的值由于分析条件、分析的dna的种类、量等而得到不同的色谱图，因此，只要根据色谱图设定适当的值即可。

检测信号的微分值可以通过上述的数据处理软件自动地计算。或者可以利用表计算软件(例如，microsoft(注册商标)excel(注册商标))等计算该微分值。

算出色谱的检测信号的微分值的时间范围可以适当设定。另外，检测一次微分值的极大值的时间范围也可以适当设定。例如，可以在从该检测信号的峰曲线的上升到结束的时间范围内检测该一次微分值的极大值。

本发明中，可以将上述样品dna的色谱的检测信号与对照dna的检测信号进行比较。对照dna使用与样品dna序列相同且甲基化水平已知(例如，0％或100％)的dna。

例如，0％甲基化对照(阴性对照)的检测信号可以通过使用序列与样品dna相同但没有甲基化的dna，并通过上述的步骤进行亚硫酸氢盐处理、核酸扩增和离子交换色谱而获得。另外，例如，100％甲基化对照(阳性对照)的检测信号可以通过使用序列与样品dna相同且100％甲基化的dna，并通过上述的步骤进行亚硫酸氢盐处理、核酸扩增和离子交换色谱而获得。或者，阴性对照和阳性对照的检测信号可以分别通过合成使甲基化率为0％和100％的样品dna进行亚硫酸氢盐处理和核酸扩增而得到的dna序列，接着将其供给到离子交换色谱而获得。

样品dna中所含的非甲基化dna作为具有与阴性对照同等的保留时间的峰出现。另一方面，来自样品dna中所含的甲基化dna的峰的保留时间应该根据其甲基化水平向阳性对照的峰移动。通过将样品dna的峰的保留时间与阴性对照或阳性对照进行比较，能够确认正确地取得了来自包含非甲基化dna或甲基化dna的样品dna的信号。该步骤能够有效地防止由样品dna的制备、其后的处理工序中的操作误差引起的判定错误。但是，特别是可从样品dna得到清楚的单峰或双峰性的峰时，未必需要该步骤。

本发明的评价hcc的风险的方法由于在dna甲基化的检测中使用离子交换色谱，因此，与通过焦磷酸测序等检测dna甲基化的现有方法(例如专利文献1)相比，是非常简便且迅速的方法。进一步令人吃惊的是，在本发明中，通过以mgrn1基因的外显子区域的cpg位点的甲基化为指标，能够以显著高的灵敏度和特异性进行hcc的风险的评价。如后述的实施例所示，在使用基于离子交换色谱的dna甲基化的检测的hcc的风险评价中，选择包含mgrn1基因的外显子区域的cpg位点的dna(liv25区域；序列号1)作为检测甲基化的靶dna时，与包含其附近的cpg位点(mgrn1基因的内含子区域的cpg位点)的dna(liv27区域；序列号2)或包含不同的基因(kdm4b)的cpg位点的dna(liv28区域；序列号3)相比，灵敏度和特异性显著提高。该附近的cpg位点和kdm4b基因的cpg位点是在基于焦磷酸测序的hcc风险评价中实现了100％的灵敏度和特异性的部位(参照专利文献1、表4)。然而，这2个部位在基于离子交换色谱的评价中均使灵敏度或特异性大幅降低。与此相对，包含mgrn1基因的外显子区域cpg位点的dna即使在本发明的基于离子交换色谱的hcc风险评价中也实现了与使用焦磷酸测序的方法同等的极高的灵敏度和特异性。因此，本发明的hcc的风险评价方法是能够兼具迅速性、简便性以及极高的灵敏度和特异性的优异的方法。

实施例

以下，通过实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不限定于以下的实施例。

〔方法〕

(1)患者和检体

将从具有肝炎病毒(hbv或hcv)感染史且具有hcc的患者摘出的非癌肝脏组织(n组)36个样品以及从不具有肝炎病毒感染史和hcc的患者摘出的健康肝脏组织(c组)36个样品作为检体。

2)dna的制备

将从上述患者得到的新鲜冷冻组织样品用苯酚－氯仿进行处理，接着，实施透析，从而提取高分子量dna(参照sambrook，j.等，分子克隆：实验手册第3版，coldspringharbo出版，ny，6.14～6.15页)。将得到的dna500ng使用ezdnamethylation－gold^tm试剂盒(zymoresearch公司制)进行亚硫酸氢盐处理。

(3)pcr扩增

将(2)中得到的亚硫酸氢盐处理基因组dna进行pcr扩增。pcr中，将基因组dna中的包含cpg位点的以下的3个不同区域进行扩增。

liv25区域：包含mgrn1基因的外显子区域的cpg位点的dna区域

liv27区域：包含liv25区域附近的cpg位点(mgrn1基因的内含子区域的cpg位点)的dna区域

liv28区域：包含不同基因(kdm4b)的cpg位点的dna区域

将所扩增的区域(亚硫酸氢盐处理前的序列)和用于扩增的引物的核苷酸序列示于表1。对于各区域，制备相同序列且甲基化率0％的dna(阴性对照)和甲基化率100％的dna(阳性对照)，通过同样的步骤在亚硫酸氢盐处理后进行pcr扩增。

pcr反应液(50μl)的组成：模板dna75ng、1×qiagenpcrbuffer(qiagen公司制)、200μmol/ldntpmix(toyobo公司制)、2.5uhotstarttaqplusdnapolymerase(qiagen公司制)、0.2μmol/l正义和反义引物。pcr条件如下：

liv25：

[94℃1分钟→64℃1分钟→72℃1分钟]×5个循环→[94℃1分钟→62℃1分钟→72℃1分钟]×5个循环→[94℃1分钟→60℃1分钟→72℃1分钟]×5个循环→[94℃1分钟→58℃1分钟→72℃1分钟]×35个循环

liv27：

[94℃1分钟→56℃1分钟→72℃1分钟]×50个循环

liv28：

[94℃1分钟→56℃1分钟→72℃1分钟]×50个循环

pcr结束后，对预先添加了溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶上样在反应液5μl中混合loadingdyesolution1μl而得的液体而进行电泳，确认得到目标pcr扩增产物。

[表1]

(4)阴离子交换柱的制备

向带搅拌机的反应器中的3重量％聚乙烯醇(日本合成化学公司制)水溶液2000ml添加四乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)200g、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)100g、甲基丙烯酸缩水甘油酯(和光纯药工业公司制)100g和过氧化苯甲酰(kishida化学公司制)1.0g的混合物。一边搅拌一边加热，在氮气氛下在80℃聚合1小时。接着，将作为具有强阳离子性基团的亲水性单体的甲基丙烯酸乙基三甲基氯化铵(和光纯药工业公司制)100g溶解于离子交换水。将其添加于相同的反应器，同样地一边搅拌一边在氮气氛下在80℃聚合2小时。将得到的聚合组合物用水和丙酮清洗，从而得到在表面包含具有季铵基的亲水性聚合物的层的被覆聚合物粒子。使用粒度分布测定装置(accusizer780/particlesizingsystems公司制)对得到的被覆聚合物粒子进行测定，结果平均粒径为10μm。

使得到的被覆聚合物粒子10g分散于离子交换水100ml，准备反应前浆料。接着，一边搅拌该浆料一边加入作为具有弱阳离子性基团的试剂的n,n－二甲基氨基丙胺(和光纯药工业公司制)10ml，在70℃反应4小时。反应结束后，使用离心分离机(日立制作所公司制，“himaccr20g”)除去上清液，用离子交换水清洗。清洗后，使用离心分离机除去上清液。将该利用离子交换水的清洗进一步重复4次，得到在基材粒子的表面具有季铵基和叔氨基的离子交换色谱用填充剂。

将得到的离子交换色谱用填充剂填充于液相色谱系统的不锈钢制柱(柱尺寸：内径4.6mm×长度20mm)。

(5)hplc分析

使用(4)中准备的阴离子交换柱在以下的条件下进行离子交换色谱，对(3)中得到的各pcr扩增产物进行分离检测。

系统：lc－20a系列(岛津制作所公司制)

洗脱液：洗脱液a25mmol/ltris盐酸缓冲液(ph7.5)

洗脱液b25mmol/ltris盐酸缓冲液(ph7.5)+1mol/l硫酸铵

分析时间：分析时间为15分钟

洗脱法：通过以下的梯度条件使洗脱液b的混合比率线性增加。

0分钟(洗脱液b40％)→10分钟(洗脱液b100％)

检体：(2)中得到的pcr扩增产物

流速：1.0ml/min

检测波长：260nm

试样注入量：5μl，阴性对照和阳性对照为2μl

柱温：70℃

(6)基于使用了色谱的mgrn1基因外显子区域的cpg位点的甲基化解析的hcc风险评价

将由来自hcc患者的非癌肝脏组织样品(n组)的包含mgrn1基因的外显子区域的cpg位点的dna(liv25区域)得到的hplc色谱图中典型的例子示于图1。图1的各图中还重叠示出非甲基化dna(阴性对照)和100％甲基化dna(阳性对照)的色谱图。这些n组样品中，仅出现与阳性对照的峰重叠的单峰性的峰。另外，这些数据的一次微分值(图2)是具有1个极大值的曲线。色谱图中峰出现肩等并非单峰的样品可以通过成为一次微分值具有2个极大值的曲线来判别(未图示)。

将由健康肝脏组织样品(c组)的liv25区域得到的hplc色谱图中典型的例子示于图3。图3中还重叠示出非甲基化dna(阴性对照)和100％甲基化dna(阳性对照)的色谱图。这些c组样品中，出现双峰性的峰。根据与阴性对照和阳性对照的比较，推定这些双峰性的峰包含100％甲基化dna的峰和甲基化率更低的dna的峰。另外，这些数据的一次微分值(图4)是具有2个极大值的曲线。

如上所述，可以通过离子交换色谱分析来检测hcc患者的非癌肝脏组织中的包含mgrn1基因的外显子区域的cpg位点的dna(liv25区域)的dna甲基化水平的上升。另外，liv25区域的色谱分析的峰的形状在n组和c组中明显不同，可以基于该峰的形状来区别hcc患者的组织和健康组织。

(7)其它区域的基于甲基化解析的hcc风险评价

由liv27区域得到的hplc色谱图也与liv25区域同样地发现在n组中具有单峰的峰、在c组中具有双峰性的峰的趋势。另一方面，由liv28区域得到的hplc色谱图发现在n组中具有双峰性峰、在c组中具有单峰的峰的趋势。然而，在liv27区域和liv28区域中，在许多情况下n组、c组均得到与上述趋势不一致的峰，表明仅通过峰的形状无法精度良好地区别hcc患者的组织和健康组织。

(8)hcc风险评价的灵敏度和特异性的区域间比较

使用liv25区域、liv27区域和liv28区域的色谱图进行hcc风险评价，算出其灵敏度(阳性一致率)和特异性(阴性一致率)。liv25和liv27区域中，将得到具有单峰的峰的色谱图的样品判定为hcc风险阳性，将得到具有双峰性的峰的色谱图的样品判定为hcc风险阴性。liv28区域中，将得到具有双峰性的峰的色谱图的样品判定为hcc风险阳性，将得到具有单峰的峰的色谱图的样品判定为hcc风险阴性。将关于各区域的n组和c组中的判定为hcc风险阳性和阴性的样品数以及评价的灵敏度和特异性示于表2。对于liv25区域的评价，灵敏度和特异性均非常高，与其它区域相比，是显著高的精度。

[表2]

序列表

<110>国立研究开发法人国立癌研究中心

积水医疗株式会社

<120>肝细胞癌的风险评价方法

<130>dc0112

<150>jp2017-160284

<151>2017-08-23

<160>9

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>283

<212>dna

<213>智人

<400>1

tactggagaagcgggctgtgtccacatagccacctccacggcccctcagcctggcagggg60

aggaggcagcctccgcagatggggccgctgacccgctgcctttctctccaccgcctgggg120

taggtacaaagacgatgccgacagccccaccgaggacggcgacaagccccgggtgctcta180

cagcctggagttcaccttcgacgccgatgcccgcgtggccatcaccatctactgccaggc240

atcggaggagttcctgaacggcagggcagtgtgagtcccgcgg283

<210>2

<211>208

<212>dna

<213>智人

<400>2

agctggccctgcgggaaagcagctcccctgaggtgaggcccccccggggaagctttgcgc60

acccgcccgggccagccctcctccagcttctgtcgctggaatcagaccccatcccactgc120

ccgcctgggcgcccccgtgcttgttggctcttgctgagctgcgcggctccttagcctcgg180

tctgtggaggcagcaccccctggtggag208

<210>3

<211>300

<212>dna

<213>智人

<400>3

caggccctacagttaggagggcagggcgtggcgctgcaggcctgtgtgcagtgtggtgga60

cctgcccctgcccgggaggtgccgggtgcagcgtgggcgctgctgtggcgggctgagttc120

caggaccttctcctggctccctgtgcacgtcgcagcgaggccgtgtgggggtgtgtgtga180

atgtgcacgtgtgcgcgcgcatgtgagtgcgcacgtgagtgagtgtgagtatgcatgcgt240

gtgtgtgcccctgtgtcaccgggctctgcttgtgactgcggaacctgctgggtgctccgc300

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>4

tattggagaagagggttgtgtttatat27

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>5

cccccaaactcacactaccctac23

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>6

agttggttttgagggaaagtagt23

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>7

ctccaccaaaaaatactacctcc23

<210>8

<211>25

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>8

taggttttatagttaggagggtagg25

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>人工合成引物序列

<400>9

cccaaacacccaacaaattc20