本申请包含根据37c.f.r.1.821–1.825的序列表。该申请附带的序列表以引用的方式完整地并入本文中。发明背景在1918年首次报道了猪的流感感染，并且在1930年将第一猪流感病毒从猪分离(shope，r.e.，1931，j.exp.med.54:373-385)。猪流感(si)是由a型及c型流感病毒引起的猪的急性呼吸道疾病。其严重程度取决于许多因素，包括宿主年龄、病毒株以及继发性感染(easterday,1980,philostransrsoclondbbiolsci288:433-7)。在1998年之前，在美国主要是将“典型”h1n1si病毒(siv)从猪分离(kida等人，1994，jgenvirol75:2183-8；scholtissek，1994，eurjepidemiol10:455-8；olsen等人，2000，archvirol.145:1399-419)。在1998年，在美国的多个州中将h3n2亚型siv分离出来。siv复制局限于猪的上呼吸道及下呼吸道的上皮细胞、鼻粘膜、筛骨、扁桃体、气管以及肺，并且病毒分泌及传播仅通过呼吸途径发生。因此可将传染性病毒从所提到的组织以及从扁桃体、支气管肺泡灌洗(bal)流体以及鼻、扁桃体或口咽拭子分离(kristienvanreeth以及wenjunma，2013，currenttopicsinmicrobiologyandimmunology370:173–200)。流感病毒粒体由包含单链rna基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋状的核壳体)以及内部衬有基质蛋白(m1)的外部脂蛋白包膜组成。流感a病毒的节段基因组由编码十一种多肽的八条线性负极性单链rna分子组成，这些多肽包括：形成核壳体的依赖于rna的rna聚合酶蛋白(pb2、pb1以及pa)以及核蛋白(np)；基质膜蛋白(m1、m2)；从含有脂质的包膜突出的两种表面糖蛋白：血凝素(ha)以及神经氨酸酶(na)；非结构蛋白(ns1)、核输出蛋白(nep)；以及促凋亡因子pb1-f2。a型流感病毒分为17种ha(血凝素)以及10种na(神经氨酸酶)亚型，其可以产生许多可能的组合(命名为h1n1、h1n2、h2n1、h2n2、h5n1、h5n2等等)(tong等人，2012，proc.natl.acad.sci.美国，109:4269-4274)。血凝素(ha)在使病毒依附到受感染细胞的表面方面发挥作用，而神经氨酸酶(na)在使子代病毒从受感染细胞解脱出来方面发挥作用，因此na在病毒的传播方面发挥作用(wang等人，2009，biochem.biophys.res.commun.，386:432-436)。疫苗接种是管理畜群健康的基本工具。生产者非常希望使用依从性标记来确定动物是否已适当地接种。wo2009/058835a1描述了几乎不可能区分由接种产生的抗体与响应于自然感染而形成的抗体。进一步，wo2009/058835a1描述了例如纯化木聚糖酶的使用，其作为依从性标记添加到猪流感疫苗，并且描述了在血清中的特异于木聚糖酶的抗体的检测。ns1的修饰可以用于产生减毒活siv，如solórzano等人2005(jvirol79:7535–7543)、vincent等人2012(journalofvirology19:10597至10605)wo2006/083286a2以及wo2016/137929a1所述。已经利用反求遗传学产生了表达具有73、99或126个氨基酸(tx/98ns1d73、tx/98ns1d99以及tx/98ns1d126)的h3n2siv(sw/texas/4199-2/98、tx/98)的ns1截短蛋白的减毒siv。wo2006/083286a2描述了经修饰的活猪流感疫苗，但仅描述了用于确认ns节段的截短的rt(逆转录酶)-pcr实验。进一步，pica等人2012(journalofvirology86:10293–10301)使用sybrqpcr技术来评估在小鼠的肺中疫苗抑制传染性野生型病毒复制的程度。然而，所有文件均未公开一种用于确定动物的适当接种的方法或一种允许在感染了siv的动物与接种了经修饰的活猪流感特异性疫苗的动物之间进行区分的方法。进一步，所有文件均未公开针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针。因此，需要用于确定动物的适当接种的方法并且需要允许在感染了siv的动物与接种了经修饰的活猪流感特异性疫苗的动物之间进行区分的方法。发明简述在描述本发明的各方面之前，须注意，如本文中所用以及在随附权利要求中，单数形式“一个”、“一种”以及“该”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“一种抗原”的引用包括多种抗原，对“病毒”的引用是对一个或多个病毒及本领域的技术人员已知的其等同物的引用，以此类推。除非另有限定，否则本文中所用的所有技术及科学术语均具有如本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所描述的类似或等同的任何方法及材料都可在本发明的实践或测试中使用，但现在描述优选的方法、装置及材料。本文所提及的所有出版物均以引用方式并入本文，以用于描述并公开出版物中所报道的可与本发明结合使用的细胞系、载体及方法。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权先于根据先前发明的这些公开。本发明解决现有技术中固有的问题并在现有技术中提供明显改进。总的来说，本发明提供一种用于检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的诊断试剂盒，其包括针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸。有利地，本发明所提供的实验数据揭露了本发明的寡核苷酸探针可以检测各种稀释度的不同样品中的猪流感病毒特异性疫苗。术语“诊断试剂盒”是指用于检测或测量所述经修饰的活猪流感特异性疫苗的试剂盒。如本文中所用的术语“试剂盒”是指在别处提到的组件、尤其是针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的集合。试剂盒还可以包括针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针、如在本文其他地方所描述的引物、缓冲液、说明书等等。所述组件可以或可以不包装在一起。试剂盒的组件可以由单独的小瓶构成(即，作为单独部件的试剂盒)或设置在单一小瓶中。此外，应理解，本发明的试剂盒是用于实践本文所提及的方法。优选地，设想以随时可用的方式提供所有组件以实践本文所提及的方法。进一步，试剂盒优选地包含用于执行所述方法的说明书。说明书可以通过呈纸或电子形式的用户手册来提供。例如，手册可以包括用于解释当使用本发明的试剂盒执行前述方法时所获得的结果的说明书。术语“动物”是指动物，优选指哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、荷兰猪(guineapig)、兔、仓鼠、猪、羊、狗、猫、马、猴子或牛，并且还优选指人。更优选地，受试者为猪。优选地，猪是大约1周龄及更小、更优选3周龄及更小、最优选6周龄及更小的猪仔。术语“经修饰的活”是指通过本领域中已知的多种方法中的任一种减轻毒性的病毒，这些方法包括但不限于在细胞培养物中重复的传代；强迫适应在正常限制性温度下生长；用化学诱变剂进行处理以推动大量突变以及对所需特征进行选择；以及使用重组技术进行基因的缺失或插入。优选地，通过ns-1蛋白的截短来减轻病毒的毒性。术语“猪流感病毒”是本领域的技术人员已知的。术语猪流感病毒是指来自正粘病毒科的导致猪流感的a型或c型流感病毒。优选地，术语猪流感病毒是指a型病毒，猪流感a病毒(siav)。虽然正粘病毒具有三类：a型、b型以及c型，但是只有a型以及c型流感病毒会使猪感染。猪流感病毒的亚型包括h1n1、h1n2、h3n2以及h3n1。还可在猪中发现h9n2以及h5n1。优选地，猪流感病毒是已经从猪分离出的流感病毒。猪流感病毒包含猪ns1基因。典型猪ns1基因可存在于诸如genbank之类的公共序列数据库中，并且包括但不限于genbank登记号aj293939(a/swine/italy/13962/95(h3n2))以及genbank登记号aj344041(a/swine/cotesd'armor/1121/00(h1n1))。猪流感病毒变异体的实例包括但不限于：a/swine/colorado/1/77、a/swine/colorado/23619/99、a/swine/coted'armor/3633/84、a/swine/england/195852/92、a/swine/finistere/2899/82、a/swine/hongkong/10/98、a/swine/hongkong/9/98、a/swine/hongkong/81/78、a/swine/illinois/100084/01、a/swine/illinois/100085a/01、a/swine/illinois/21587/99、a/swine/indiana/1726/88、a/swine/indiana/9k035/99、a/swine/indiana/p12439/00、a/swine/iowa/30、a/swine/iowa/15/30、a/swine/iowa/533/99、a/swine/iowa/569/99、a/swine/iowa/3421/90、a/swine/iowa/8548-1/98、a/swine/iowa/930/01、a/swine/iowa/17672/88、a/swine/italy/1513-1/98、a/swine/italy/1523/98、a/swine/korea/cy02/02、a/swine/minnesota/55551/00、a/swine/minnesota/593/99、a/swine/minnesota/9088-2/98、a/swine/nebraska/1/92、a/swine/nebraska/209/98、a/swine/netherlands/12/85、a/swine/northcarolina/16497/99、a/swine/northcarolina/35922/98、a/swine/northcarolina/93523/01、a/swine/northcarolina/98225/01、a/swine/oedenrode/7c/96、a/swine/ohio/891/01、a/swine/oklahoma/18717/99、a/swine/oklahoma/18089/99、a/swine/ontario/01911-1/99、a/swine/ontario/01911-2/99、a/swine/ontario/41848/97、a/swine/ontario/97、a/swine/quebec/192/81、a/swine/quebec/192/91、a/swine/quebec/5393/91、a/swine/taiwan/7310/70、a/swine/tennessee/24/77、a/swine/texas/4199-2/98、a/swine/wisconsin/125/97、a/swine/wisconsin/136/97、a/swine/wisconsin/163/97、a/swine/wisconsin/164/97、a/swine/wisconsin/166/97、a/swine/wisconsin/168/97、a/swine/wisconsin/235/97、a/swine/wisconsin/238/97、a/swine/wisconsin/457/985、a/swine/wisconsin/458/98、a/swine/wisconsin/464/98以及a/swine/wisconsin/14094/99。在本发明的一个方面，所述猪流感病毒是猪流感a病毒。术语“疫苗”是指包括至少一种抗原的组合物，该至少一种抗原在注射了疫苗的宿主中引出免疫应答。此种免疫应答可以是针对本发明免疫原组合物的细胞及/或抗体介导的免疫应答。优选地，疫苗引起免疫应答，并且更优选地提供抵抗siv感染的一种或多种临床症状的保护性免疫。宿主也可以被描述为“受试者”。优选地，本文中所描述或提及的任何宿主或受试者均为动物。通常，“疫苗”包括但不限于以下效果中的一种或多种：产生或激活专门针对本发明疫苗中所包括的一种或多种抗原的抗体、b细胞、辅助性t细胞、抑制性t细胞及/或细胞毒性t细胞及/或γ-δt细胞。进一步，宿主将显示保护性免疫应答或治疗应答。“保护性免疫应答”或“保护性免疫”将通过以下证明：受感染宿主通常所显示的临床症状减少或没有、恢复时间较快及/或传染性持续时间缩短或受感染宿主的组织或体液或排泄物中的病原体滴度降低。术语“寡核苷酸探针”是指能够与目标核酸相互作用的天然存在的或合成的核苷酸聚合物。一般而言，构成寡核苷酸的核苷酸是天然存在的脱氧核糖核苷酸(诸如连接到t脱氧核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶)或核糖核甘酸(诸如连接到核糖的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶)。然而，寡核苷酸还可以包含核苷酸类似物，包括非天然存在的合成核苷酸或经修饰的天然存在的核苷酸。此种核苷酸类似物在本领域中众所周知且可商购获得，如包含此种核苷酸类似物的多核苷酸。可以使用例如通常采用的dna合成仪通过诸如磷酸三乙酯方法以及磷酸二酯方法之类的常规方法来合成寡核苷酸。“探针”是能够通常以序列特异性方式(诸如通过杂交)与目标核酸相互作用的分子。核酸的杂交是本领域人员熟知的。通常，探针可以由本领域中可获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制成。优选地，如本文中所表示的寡核苷酸探针在长度上具有15与50个之间的核苷酸，更优选在长度上具有18与40个之间的核苷酸，且最优选在长度上具有25与35个之间的核苷酸。优选地，寡核苷酸是单链寡脱氧核糖核苷酸。然而，由于自互补，寡核苷酸在某些条件下可以是部分双链(取决于例如寡核苷酸的序列、盐浓度以及温度)。优选地，本发明的寡核苷酸探针是单链核酸，其能够通过特异性地与产物(扩增子)杂交而形成双链分子(杂种)，该产物(扩增子)通过使用对应的寡核苷酸引物对进行扩增。优选地，单链核酸是单链dna。如本领域已知，术语“序列一致性”是指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列(即，参考序列与要与该参考序列进行比较的给定序列)之间的关系。通过在将序列进行最佳比对以产生最高程度的序列相似性之后比较给定序列与参考序列来确定序列一致性，该序列相似性由这些序列串之间的配对确定。当进行此种比对时，在逐个位置的基础上确定序列一致性，例如，如果在特定位置处核苷酸或氨基酸残基相同，则序列在该位置处是“相0同的”。然后，此种位置一致性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数以给出％序列一致性。可以通过已知方法轻而易举地计算序列一致性，这些方法包括但不限于以下文献中所述的那些方法：computationalmolecularbiology，lesk,a.n.编辑，牛津大学出版社，纽约(1988)，biocomputing:informaticsandgenomeprojects，smith,d.w.编辑，学术出版社，纽约(1993)；computeranalysisofsequencedata，第一部分，griffin,a.m.以及griffin,h.g.编辑，胡玛纳出版社(humanapress)，新泽西州(1994)；sequenceanalysisinmolecularbiology，vonheinge,g.，学术出版社(1987)；sequenceanalysisprimer，gribskov,m.以及devereux,j.编辑，m斯托克顿出版社(m.stocktonpress)，纽约(1991)；以及carillo,h.以及lipman,d.，siamj.appliedmath.，48:1073(1988)，其教导内容以引用的方式并入本文。对确定序列一致性的优选方法进行设计以给出测试序列之间的最大配对。确定序列一致性的方法被编纂入可公开获得的计算机程序中，这些计算机程序确定给定序列之间的序列一致性。此种程序的实例包括但不限于gcg程序包(devereux,j.等人，nucleicacidsresearch，12(1):387(1984))、blastp、blastn以及fasta(altschul,s.f.等人，j.molec.biol.，215:403-410(1990)。blastx程序可从ncbi以及其他来源(blastmanual，altschul,s.等人，ncvinlmnihbethesda，md20894，altschul,s.f.等人，j.molec.biol.，215:403-410(1990)，其教导内容以引用的方式并入本文)公开获得。这些程序使用默认缺口权重将序列进行最佳比对，以便产生给定序列与参考序列之间的最高水平的序列一致性。作为例证，在核苷酸序列相对于参考核苷酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％的“序列一致性”的多核苷酸的情况下，除了给定多核苷酸序列可在参考核苷酸序列的每100个核苷酸中包括多达15、优选多达10、甚至更优选多达5个点突变之外，给定多核苷酸的核苷酸序列旨在与参考序列相同。换句话说，在核苷酸序列相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％的一致性的多核苷酸中，参考序列中的核苷酸的多达15％、优选10％、甚至更优选5％可缺失或由另一核苷酸取代，或者参考序列中全部核苷酸的多达15％、优选10％、甚至更优选5％的一些核苷酸可以被插入到参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置处或在这些末端位置之间的任何地方，分别散布在参考序列中的核苷酸中或散布在参考序列内的一个或多个连续基团中。类似地，在给定氨基酸序列相对于参考氨基酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％的序列一致性的多肽的情况下，除了给定多肽序列可在参考氨基酸序列的每100个氨基酸中包括多达15、优选多达10、甚至更优选多达5个氨基酸改变之外，多肽的给定氨基酸序列旨在与参考序列相同。换句话说，为了获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％的序列一致性的给定多肽序列，参考序列中的氨基酸残基的多达15％、优选多达10％、甚至更优选多达5％可缺失或由另一氨基酸取代，或者参考序列中全部氨基酸残基的多达15％、优选多达10％、甚至更优选多达5％的一些氨基酸可以被插入到参考序列中。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置处或在这些末端位置之间的任何地方，分别散布在参考序列中的残基中或散布在参考序列内的一个或多个连续基团中。优选地，不相同的残基位置是由于保守性氨基酸取代而不同。然而，在确定序列一致性时，保守性取代不作为配对包括在内。术语“序列一致性”或“一致性百分数”在本文中可互换使用。就本发明的目的而言，在此定义：为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的一致性百分数，将序列进行比对以实现最佳比较的目的(例如，可以在第一氨基酸或核酸的序列中引入缺口以实现与第二氨基酸或核酸序列的最佳比对)。然后比较在对应氨基酸或核苷酸位置处的氨基酸或核苷酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则分子在该位置处是相同的。这两个序列之间的一致性百分数是这些序列所共有的相同位置的数目的函数(即，％一致性＝相同位置的数目/位置(即，重叠位置)的总数x100)。优选地，这两个序列具有相同的长度。可以在所比较的这两个序列的整个长度上或在这两个序列的片段上执行序列比较。通常，在所比较的这两个序列的全长上执行比较。然而，可以在例如二十、五十、一百或更多个连续氨基酸残基的区域上执行序列一致性。在本发明的上下文中尤其应理解的是，术语“与序列相同”等效于术语“与序列一致”。如本文中所用，尤其应理解的是，术语“与seqidno:y(的序列)至少x％相同”分别等效于术语“在seqidno:y(的序列)的长度上与seqidno:y(的序列)至少x％相同”或等效于术语“在seqidno:y(的序列)的整个长度上与seqidno:y(的序列)至少x％相同”。在该上下文中，“x”是90至100的任一数，尤其是选自90至100的任一整数，从而“与seq(序列)x％相同”表示本文中所提及的任一序列一致性百分数。分别地，在该上下文中，“y”是选自seqidno:1至seqidno:36的任一整数，从而“seqidno:y”表示本文中所提及的任一seqidno。此外应理解的是，如本文中所述的术语“至少99％相同”还(在范围的一个极端)包括并分别涉及术语“100％相同”或“相同”。本领域的技术人员将意识到，可获得一些不同的计算机程序来确定两个序列之间的同源性。例如，可使用数学算法来完成序列的比较以及两个序列之间一致性百分数的确定。在优选的实施方案中，使用blosum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重及1、2、3、4、5或6的长度权重，使用needleman及wunsch(j.mol.biol.(48):444-453(1970))算法来确定两个氨基酸或核酸序列之间的一致性百分数，该算法已被并入accelrysgcg软件包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/获得)中的gap程序中。本领域的技术人员将理解，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略有不同的结果，但是两个序列的整体一致性百分数不会有显著改变。本发明还提供一种用于区分接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物的诊断试剂盒，其包括：a.针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；b.针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针，其用于检测猪流感病毒感染。有利地，本发明所提供的实验数据揭露了，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针与针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针可以同时在一个实验装置中使用，因为甚至在病毒浓度高时也没有证据表明在不同探针(wt与mlv)之间存在干扰。术语“感染”或“被感染”是指受试者或动物感染猪流感病毒。本发明还提供一种用于在生物样品中检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的生物样品；b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对与所述生物样品接触；d.使用针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及e.检测所述信号，其中检测出所述信号指示在生物样品中接种了猪流感病毒特异性疫苗。术语“获得”可包括本领域的技术人员已知的分离及/或纯化步骤，优选使用沉淀、柱等。术语“生物样品”是指体液样品、分离的细胞样品或来自组织或器官的样品。体液样品可以通过公知的技术获得，并且优选地包括鼻样品或口腔液样品(诸如鼻拭子样品或口腔拭子样品或扁桃体拭子样品或口咽拭子样品等等)。可通过例如活组织检查从任何组织或器官获得组织或器官样品。优选地，组织样品是呼吸组织样品或肺样品。可通过诸如离心或细胞分选之类的分离技术从体液或组织或器官获得分离的细胞。术语“核酸”是指多核苷酸，其包括dna分子、rna分子、cdna分子或衍生物。该术语包括单链以及双链多核苷酸。本发明的核酸包括分离的多核苷酸(即，从其天然环境中分离出来)以及基因修饰形式。此外，还包括化学修饰的多核苷酸，其包括天然存在的经修饰的多核苷酸(诸如糖基化或甲基化的多核苷酸)或人造的经修饰的多核苷酸(诸如生物素化的多核苷酸)。术语“核酸”以及“多核苷酸”还具体包括由除五种生物学上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶以及尿嘧啶)之外的碱基构成的核酸。术语“cdna”是指互补dna，其在由逆转录酶催化的反应中由信使rna(mrna)模板合成。然而，术语“cdna”是本领域的技术人员所熟知的。术语“寡核苷酸引物对”是指用作用于多核苷酸扩增的启动分子的天然存在的或合成的核苷酸聚合物。优选地，扩增技术是本领域的技术人员所熟知的pcr或qpcr等，并且可无需再费周折而立即使用。应理解，例如由于寡核苷酸序列与目标多核苷酸的序列片段之间的错配，寡核苷酸引物可以不与目标序列100％互补。优选地，如本文中所表示的寡核苷酸引物在长度上具有15与35个之间的核苷酸，更优选在长度上具有15与30个之间的核苷酸，且最优选在长度上具有18与25个之间的核苷酸。优选地，寡核苷酸是单链寡脱氧核糖核苷酸。然而，由于自互补，寡核苷酸在某些条件下可以是部分双链(取决于例如寡核苷酸的序列、盐浓度以及温度)。本领域的技术人员理解如本文中所用的术语“在允许多核苷酸扩增的条件下”。该术语涉及依赖模板的过程，其会导致核酸分子的量相对于其最初量增加。根据本发明，目的多核苷酸的扩增应允许通过被认为合适的及/或例如下文所述的任何方法对其进行检测。目的多核苷酸的扩增可以通过众所周知的方法、优选通过pcr执行，而且还可以通过逆转录酶pcr、实时pcr、逆转录酶实时pcr、templex-pcr、基于核酸序列的扩增(nasba)以及使用聚合酶及特异性寡核苷酸作为引物的等温扩增方法执行。上述扩增方法在本领域中众所周知。在本发明上下文中的pcr的优选实施方案将在实施例中进行描述。本发明还提供一种用于在生物样品中检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的生物样品；b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述生物样品接触；d.产生扩增产物以及寡核苷酸探针信号；以及e.检测所述寡核苷酸探针信号，其中检测出寡核苷酸探针信号指示在生物样品中接种了猪流感病毒特异性疫苗。然而，应理解，还可以通过本文中所述的方法来测试环境样品。本发明还提供一种用于在环境样品中检测经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的环境样品；b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对与所述环境样品接触；d.使用针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及e.检测所述信号，其中检测出所述信号指示在环境样品中存在猪流感病毒特异性疫苗。本发明还提供一种用于在环境样品中检测经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的环境样品；b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述环境样品接触；d.产生扩增产物以及寡核苷酸探针信号；以及e.检测所述寡核苷酸探针信号，其中检测出所述信号指示在环境样品中存在猪流感病毒特异性疫苗。本发明还提供一种区分接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物的方法，其包括：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的生物样品；b.提供i)至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对，以及ii)用于检测猪流感病毒特异性疫苗接种的针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸，以及iii)用于检测猪流感病毒感染的针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对与所述生物样品接触；d.使用针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针及/或针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及e.检测所述信号，其中i)使用针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针检测出信号指示生物样品中接种了猪流感特异性疫苗，并且ii)使用针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针检测出信号指示生物样品中感染了猪流感病毒。所述方法允许在自然感染野毒(与疾病相关)的动物与已接种的动物之间进行识别。此种区分方法的主要优点在于，其允许对在已接种的动物种群中取样之前急性感染或感染某些时间(至少大约3周)的动物(优选猪)进行检测，并因此为监测猪流感病毒在动物种群中的传播或再引入提供可能性。因此，这使得能够基于实验室测试结果而以一定程度的把握宣称，已接种的猪种群无猪流感病毒。区分感染了猪流感病毒范围或接种了经修饰的活疫苗的动物或检测接种了如本文中所述的经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物优选通过呼吸细胞的rna分离及逆转录酶以及随后的cdna扩增来提供。使用针对ns节段的特异性引物以及如本文中所述的寡核苷酸探针，可以执行pcr或qpcr。本发明还提供一种区分接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物的方法，其包括：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的生物样品；b.提供i)至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对，以及ii)用于检测猪流感病毒特异性疫苗接种的针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸，以及提供iii)用于检测猪流感病毒感染的针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述生物样品接触；d.产生扩增产物以及寡核苷酸探针信号；以及e.检测所述寡核苷酸探针信号，其中i)检测出来自针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号指示生物样品中接种了猪流感特异性疫苗，并且ii)检测出来自针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号指示生物样品中感染了猪流感病毒。本发明还提供一种用于在动物组内检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的环境样品；b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述环境样品接触；d.使用针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及e.检测寡核苷酸探针信号，其中寡核苷酸探针信号的存在指示在所述动物组内接种了猪流感病毒特异性疫苗。本发明还提供一种用于在动物组内检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的环境样品；b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述环境样品接触；d.产生扩增产物以及寡核苷酸探针信号；以及e.检测寡核苷酸探针信号，其中寡核苷酸探针信号的存在指示在所述动物组内接种了猪流感病毒特异性疫苗。术语“环境样品”是指并未直接取自动物而是取自动物所居住的环境的样品。优选地，环境样品是空气过滤器样品、用于收集口腔液的绳样品、拖把垫或海绵样品。然而，环境样品可以是来自动物所居住的环境的任何其他样品，诸如来自地面、墙壁、门、嵌板、工作人员的衣物或喂食/饮水系统的拭子。感染了猪流感病毒或接种了经修饰的活疫苗的动物分别散布出野生型病毒以及经修饰的活疫苗病毒若干天。因此，可以获取环境样品以评估在环境中是否存在经修饰的活疫苗病毒。阳性测试结果(在环境中存在经修饰的活疫苗病毒)意味着居住在该环境中的动物已经成功地(至少部分地)接种。使用针对野生型病毒的特异性寡核苷酸探针并且具有阳性测试结果(在环境中存在野生型病毒)意味着居住在该环境中的动物被野生型病毒感染。本发明还提供一种用于确定在动物组内接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物之间的比率的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的环境样品；b.提供i)至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对，以及ii)用于检测猪流感病毒特异性疫苗接种的针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸，以及提供iii)用于检测猪流感病毒感染的针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述环境样品接触；d.使用针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针及/或针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及e.检测i)来自针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号，以及ii)来自针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号；f.产生步骤e的i)与ii)或ii)与i)的比率。本发明还提供一种用于确定在动物组内接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物之间的比率的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的环境样品；b.提供i)至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对，以及ii)用于检测猪流感病毒特异性疫苗接种的针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸，以及提供iii)用于检测猪流感病毒感染的针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述环境样品接触；d.产生扩增产物以及寡核苷酸探针信号；以及e.检测i)来自针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号，以及ii)来自针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号；f.产生步骤e的i)与ii)或ii)与i)的比率。假如步骤e的i)与ii)信号的比率高，这反映了动物接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗，而野生型siv的感染率低。假如步骤e的i)与ii)信号的比率低，这反映了动物未接种或很少接种经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗，而野生型siv的感染率高。然而，假如步骤e的i)与ii)信号的比率相似，这反映了接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与野生型siv感染处于相似的水平。然而，假如步骤e的ii)与i)信号的比率高，这反映了动物接种经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的比率低，而野生型siv的感染率高。假如步骤e的ii)与i)信号的比率低，这反映了动物接种经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的比率高，而野生型siv的感染率低。进一步，假如步骤e的ii)与i)信号的比率相似，这反映了接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与野生型siv感染处于相似的水平。在本发明的一个方面，步骤a或c包括从所述生物样品或所述环境样品提取所述核酸。术语“提取”是本领域的技术人员已知的并且可以包括增溶溶解、分离及/或纯化步骤。在本发明的一个方面，步骤a或c包括rna的逆转录。术语“逆转录”是本领域的技术人员已知的。逆转录是由逆转录酶催化。通过此种逆转录，从rna模板合成cdna。在本发明的一个方面，所述诊断试剂盒包括至少一个正向及反向寡核苷酸引物对。针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％序列一致性的序列中的至少十二、十四、十六或十七个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:3所示序列或其反向互补序列(seqidno:4)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十四个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:3所示序列或其反向互补序列(seqidno:4)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十五个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:3所示序列或其反向互补序列(seqidno:4)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十六个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:3所示序列或其反向互补序列(seqidno:4)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十七个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:3所示序列或其反向互补序列(seqidno:4)或与其具有至少70％序列一致性的序列。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5(agtagatcttgattaattaagagggagc)或seqidno7:(atggaaaagtagatcttgattaattaagagg)、seqidno9:(agtagatcttgattaattaagagggagcaatcg)或seqidno:39(agtagatcttgattaattaagagggagcaatcg)所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％序列一致性的序列中的至少十二、十四、十六、十八、二十、二十二、二十四或二十六个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十四个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十六个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十八个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十二个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十四个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十六个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少80％。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少90％。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少95％。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少97.5％。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的序列包括seqidno:5中所示序列或其互补反向序列(seqidno:6)。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的序列包括seqidno:7中所示序列或其反向互补序列(seqidno:8)。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的序列包括seqidno:9中所示序列或其互补反向序列(seqidno:10)。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的序列包括seqidno:39中所示序列或其互补反向序列(seqidno:40)。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针与经修饰的活猪流感特异性疫苗内的非天然存在的序列结合。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针与经修饰的活猪流感特异性疫苗内在ns(非结构蛋白)基因节段内的非天然存在的序列结合。术语“ns(非结构蛋白)”是本领域的技术人员已知的。流感a病毒的节段基因组由编码十一个多肽的线性负极性单链rna的八个分子组成。基因节段8编码这两种非结构(ns)蛋白，ns1及ns2。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针与经修饰的活猪流感a特异性疫苗内在ns-1(非结构蛋白)与ns-2orf之间的非天然存在的序列结合。术语“ns-1(非结构蛋白)与ns-2orf”是指由猪流感a病毒的基因节段ns编码的开放阅读框(orf)ns-1及ns-2。猪流感a病毒的基因节段ns编码两种蛋白ns-1及ns-2。术语“基因或基因节段”是本领域的技术人员熟知的。然而，如上所述，诸如猪流感病毒的基因组之类的流感a基因组包含编码11种蛋白的八个基因节段。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针被硫醇化。针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针与猪流感病毒内的天然存在的序列结合。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针是针对猪流感病毒的ha、na、pb1、pb2、pa、np、m或ns基因节段具有特异性。术语“ha、na、pb1、pb2、pa、np、m或ns基因节段”在本文中的别处进行描述。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针是针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针是针对ns-1(非结构蛋白-1)orf具有特异性。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11(gtgtgatctttaaccgattagagactttgt)或seqidno:13(tgatactactaagggctttcactga)或seqidno:15(tgatactactaagagctttcactga)或seqidno:17(taatactactaagggctttcactga)或seqidno:19(tgatactactgagagctttcactga)或seqidno:21(tggtactactaagggctttcactg)或seqidno:23(tgatactactaagggctttcaccg)或seqidno:25(tgatactactgagggctttcactg)所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％序列一致性的序列中的至少十二、十四、十六、十八、二十、二十二、二十四、二十六或二十八个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十四个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或其互补反向序列或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十六个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十八个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十二个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十四个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十六个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十八个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少80％。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少90％。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少95％。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少97.5％。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针的序列包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)。在本发明的一个方面，针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针被硫醇化。信号在本发明的一个方面，信号是酶信号、荧光信号或电化学信号。用于寡核苷酸探针或引物的荧光标记在本发明的一个方面，寡核苷酸探针或引物与可检测标记偶连，该可检测标记选自由放射性元素以及荧光化学物质组成的组。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针与可检测标记偶连，该可检测标记选自由放射性元素以及荧光化学物质组成的组。在本发明的一个方面，荧光化学物质标记选自荧光素、花青染料、香豆素、藻红蛋白、藻胆蛋白、丹酰氯、镧系络合物或荧光染料。在本发明的一个方面，所述荧光染料是r-藻红蛋白、cy3、cy5、quasar670、罗丹明、alexa或texasred。在本发明的一个方面，所述荧光素是6-fam(6-羧基荧光素)、tet(6-羧基-4,7,2′,7′-四氯荧光素)、joe(2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基荧光素)或hex(6-羧基-2′,4′,7′,4,7-六氯荧光素)。优选地，本发明的寡核苷酸探针是用标记物质进行标记，以检测通过使用对应的寡核苷酸引物对扩增的产物。优选地，寡核苷酸探针与可检测标记偶连，该可检测标记选自由放射性元素、酶、抗体以及荧光化学物质组成的组。更优选地，本发明的寡核苷酸探针是用荧光化学物质进行标记，以便以高的灵敏度快速检测扩增产物。更优选地，本发明的寡核苷酸探针是用荧光化学物质以及猝灭剂进行双重标记。优选地，本发明的寡核苷酸探针具有用荧光物质(报告荧光染料)修饰的5′末端以及用猝灭剂(猝灭荧光染料)修饰的3′末端，或反之亦然。优选地，报告染料是荧光素(包括6-fam(6-羧基荧光素)、tet(6-羧基-4,7,2′,7′-四氯荧光素)、joe(2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基荧光素)以及hex(6-羧基-2′,4′,7′,4,7-六氯荧光素))、花青染料、香豆素、藻红蛋白、藻胆蛋白、丹酰氯、镧系络合物或荧光染料(诸如r-藻红蛋白、cy3、cy5、quasar670、罗丹明、alexa或texasred)。猝灭荧光染料的实例包括罗丹明类荧光染料，诸如6-羧基四甲基罗丹明(tamra)、黑洞猝灭剂(bhq)bhq-1及2以及6-羧基-x-罗丹明(rox)。然而，此种标记及技术是本领域的技术人员熟知的，并且已经广泛地描述于诸如tagman试验之类的文献中。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针进一步用猝灭剂标记，该猝灭剂选自6-羧基四甲基罗丹明(tamra)、黑洞猝灭剂(bhq)bhq-1及2或6-羧基-x-罗丹明(rox)。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针或引物与荧光标记偶连。在本发明的一个方面，方法是qpcr。用于寡核苷酸探针或引物的酶及电化学标记在本发明的一个方面，寡核苷酸探针或引物与第一偶连基偶连。在本发明的一个方面，引物与第一偶连基偶连。在本发明的一个方面，信号的产生包括提供第二偶连基。在本发明的一个方面，所述第一及第二偶连基选自由抗体-抗原、受体-配体、生物素-链霉亲和素、糖-外源凝集素以及互补寡核苷酸组成的组。在本发明的一个方面，对第二偶连基进行标记。优选地，寡核苷酸探针或引物是用生物素进行标记，并且标记的链霉亲和素用于产生信号。在本发明的一个方面，标记选自由放射性元素、荧光化学物质或酶组成的组。在本发明的一个方面，所述荧光化学物质标记是如本文中所述的荧光。在本发明的一个方面，所述酶标记选自辣根过氧化物酶(hrp)、酯酶、碱性磷酸酶(ap)、葡萄糖氧化酶、β半乳糖苷酶或荧光素酶。酶标记是本领域的技术人员熟知的，并且任何酶试验均可无需再费周折而立即完成。基质也是本领域的技术人员熟知的，并且实例包括用于hrp的3,3'-二氨基联苯胺(dab)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)、2,2'-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸](abts)或邻苯二胺盐酸盐(opd)，用于ap的氯化硝基四氮唑蓝(nbt)与5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(bcip)或对硝基苯磷酸盐(pnpp)或对氨基苯酚(pap)的组合、用于葡萄糖氧化酶的氯化硝基四氮唑蓝(nbt)以及用于β半乳糖苷酶的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷(bcig或x-gal)。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针或引物信号是酶信号。优选地，寡核苷酸探针或引物是用生物素进行标记，并且用碱性磷酸酶(ap)标记的链霉亲和素用于产生信号。在本发明的一个方面，所述酶将基质转化成可逆氧化还原偶。一般而言，氧化还原循环是电化学过程，其中在至少两个产生电流(电化学信号)的电极之间分子被可逆地氧化及/或还原(即，氧化还原活性分子；氧化还原偶)。然而，在这方面的方法及技术在本领域中众所周知。基质/氧化还原偶的实例是本领域的技术人员熟知的。然而，合适的实例包括但不限于，二茂铁衍生物、二茂铁盐(ferrocinium)衍生物、二茂铁衍生物与二茂铁盐衍生物的混合物、氯化铜、氯化亚铜、氯化铜与氯化亚铜的混合物、钌-三联吡啶、六氰基亚铁酸钾、六氰基铁酸钾、以及六氰基亚铁酸钾与六氰基铁酸钾的混合物、卟啉大环、茂金属、线性聚烯、环状聚烯、杂原子取代的线性聚烯、杂原子取代的环状聚烯、四硫富瓦烯、四硒富瓦烯、金属配位络合物、巴克球、三芳胺、1,4-苯二胺、氧杂蒽、黄素、吩嗪、吩噻嗪、吖啶、喹啉、2,2'-联吡啶、4,4'-联吡啶、四硫并四苯(tetrathiotetracene)以及迫位桥萘二硫属化物(peri-bridgednaphthalenedichalcogenide)。优选地，基质是具有磷酸基团的氧化还原分子。更优选地，基质是具有焦磷酸根的氧化还原分子。磷酸酶的作用是从氧化还原分子去除焦磷酸根。合适的磷酸酶包括例如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、蛋白磷酸酶、多磷酸盐磷酸酶、糖磷酸酶以及焦磷酸酶。在本发明的一个方面，基质是对氨基苯酚磷酸盐。在本发明的一个方面，氧化还原偶是对氨基苯酚(pap)与醌亚胺。氧化还原循环技术包括芯片技术，诸如例如cmos芯片技术。cmos芯片技术已经在现有技术中充分地描述。例如，wo2018/065104a1，rolandthewes(启用基于cmos的dna阵列芯片)以及frey等人2005(数字cmosdna芯片)描述了cmos技术。一般而言，这背后的电化学原理是基于酶标记的电流产生过程，使得互补dna链的杂交转变成1pa至100na之间的在传感器电极处的传感器电流。将探针分子(诸如本文中所述的寡核苷酸探针)固定在传感器元件的表面上。将加上酶标记(通过使用碱性磷酸酶标记的引物)的扩增产物施加到芯片。在杂交及洗涤阶段之后，将化学基质(对氨基苯磷酸盐)施加到芯片。可以在进行杂交的位置获得的酶标记使磷酸基团裂解，并且产生具有电化学活性的对氨基苯酚。同时将氧化及还原电势施加到传感器电极，在一个电极处将对氨基苯酚氧化成醌亚胺，并且在另一个电极处将醌亚胺还原为对氨基苯酚。在本发明的一个方面，寡核苷酸探针或引物信号是电化学信号。在本发明的一个方面，方法是基于dna芯片的技术。在本发明的一个方面，方法是基于cmos的技术。扩增在本发明的一个方面，多核苷酸的所述扩增是pcr(聚合酶链反应)或实时pcr(聚合酶链反应)。优选地，当使用实时pcr时，使用“标准”制订校正曲线，这些“标准”是包含已知数量的目标核酸序列拷贝的样品。进行独立的反应，每一反应包含不同的标准。使用来自涉及不同标准量的每一反应的ct值制订ct与logn(起始拷贝数)的曲线图或“标准曲线”。通过将来自包含生物样品的反应的ct值插入到标准曲线上来确定生物样品中目标核酸序列的拷贝数。优选地，软件程序产生针对所有“标准”的ct与logn(起始拷贝数)的“标准曲线”，然后通过内插确定未知数的起始拷贝数。测试样品中目标基因序列的拷贝数的确定指示测试样品中病毒或病毒残余部分的数量。此种实时pcr方法需要至少三种寡核苷酸以对每一目标核酸序列进行分析。正向及反向寡核苷酸引物的序列与目标核酸序列的末端互补。探针序列与目标核酸序列的末端之间所发现的序列互补。当与目标杂交时，“正向引物”及“反向引物”为目标核酸序列的聚合酶催化的扩增提供模板。需要单链寡核苷酸探针进行目标检测。在此种方法中，两个反应合并成单一反应形式：用以检测特异性目标核酸序列的寡核苷酸探针杂交以及用以扩增目标核酸序列的pcr。通过荧光共振能量转移，猝灭剂减少寡核苷酸探针内的荧光报告基团的荧光发射。由于taq聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性催化互补链合成，因此其将猝灭剂部分从结合寡核苷酸探针切除，从而由于报告因子不再被猝灭，导致探针的荧光发射增加。扩增反应期间的荧光信号的增加因此取决于荧光寡核苷酸探针及寡核苷酸引物二者与目标序列的杂交。由于未检测到非特异性引物杂交所导致的虚假扩增，因此增强了目标识别。(lee等人，1993，nucleicacidsres.21:3761-3766)。优选地，采用多重形式来检测单一反应中的一个以上的目标核酸序列。例如，针对一个以上的目标基因的引物或针对同一目标基因上的不同位置的引物(具有连接至不同荧光报告因子的对应目标特异性探针)可以检测单一反应中的多个目标。更优选地，针对一个目标基因的引物(具有连接至不同荧光报告因子的两个对应目标特异性寡核苷酸探针)用于检测单一反应中的多个目标。引物对在本发明的一个方面，所述正向及所述反向寡核苷酸引物针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性。在本发明的一个方面，所述正向寡核苷酸引物针对ns-1(非结构蛋白-1)orf具有特异性。在本发明的一个方面，所述反向寡核苷酸引物针对ns-2(非结构蛋白-2)orf具有特异性。在本发明的一个方面，针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1(gataataggctctctttgtg)或seqidno:2(aggtaatggtgaaatttctc)或seqidno:27至seqidno:38所示序列或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1、seqidno:2或seqidno:27至seqidno:38所示序列或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％序列一致性的序列中的至少十二、十四、十六或十八个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1、seqidno:2或seqidno:27至seqidno:38所示序列或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十四个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1、seqidno:2或seqidno:27至seqidno:38所示序列或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十六个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1、seqidno:2或seqidno:27至seqidno:38所示序列或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十八个连续核苷酸。在本发明的一个方面，针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1；seqidno:2或seqidno:27至seqidno:38所示序列或与其具有至少70％序列一致性的序列。在本发明的一个方面，寡核苷酸引物的所述序列一致性为至少80％。在本发明的一个方面，寡核苷酸引物的所述序列一致性为至少90％。在本发明的一个方面，寡核苷酸引物的所述序列一致性为至少95％。在本发明的一个方面，寡核苷酸引物的所述序列一致性为至少97.5％。在本发明的一个方面，针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1、seqidno:2或seqidno:27至seqidno:38中所示序列。在本发明的一个方面，寡核苷酸引物被生物素化。动物在本发明的一个方面，所述动物是猪。样品在本发明的一个方面，样品是鼻样品、口腔液样品、呼吸组织样品或肺样品。优选地，样品是鼻样品或口腔液样品。优选地，样品取自1天与10周龄之间、更优选1天与6周龄之间的猪或猪仔。优选地，样品取自猪或猪仔，该猪或猪仔在取样之前的1天至15天接种了猪流感病毒特异性疫苗。在本发明的一个方面，环境样品是空气过滤器样品或用于收集口腔液的绳样品。浓度样品在本发明的一个方面，经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗或猪流感病毒的浓度在2至12logeid50之间。在本发明的一个方面，经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗或猪流感病毒的浓度在4至10logeid50之间。在本发明的一个方面，经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗或猪流感病毒的浓度在6至8logeid50之间。经修饰的活猪流感特异性疫苗在本发明的一个方面，经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗包括与如本文中所述的针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针相同或互补的序列。在本发明的一个方面，如本文中所述的所述相同或互补序列是经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗内的非天然存在的序列。在本发明的一个方面，如本文中所述的所述相同或互补序列位于经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的ns(非结构蛋白)基因节段内。在本发明的一个方面，如本文中所述的所述相同或互补序列位于经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的ns-1(非结构蛋白)与ns-2orf之间。在本发明的一个方面，经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗是减毒的。术语“减毒”是指毒性降低的病原体。在本发明中，“减毒”与“无毒性”同义。在本发明中，减毒siv是其中毒性已经被降低的siv，因此它不会引起猪流感感染的临床症状，但能够诱导目标哺乳动物中的免疫应答，但还可以表示与感染了非减毒siv且未接受减毒病毒的动物的“对照组”相比，在感染了减毒siv的动物中临床症状在发生率或严重程度方面降低。在该上下文中，术语“降低/被降低”是指与如上文所定义的对照组相比，降低至少10％、优选25％、甚至更优选50％、还更优选60％、甚至更优选70％、还更优选80％、还更优选90％、甚至更优选95％以及最优选100％。因此，减毒、无毒性的siv株是适合于并入包括经修饰的活siv的免疫原性组合物中的siv株。优选地，如本文中所提到的术语“减毒”尤其指诸如通过ns1基因或蛋白的截短实现的基因组序列中的基因工程变化，该基因工程变化尤其会导致当在相同条件下增殖及/或具有有缺陷的ifn拮抗活性时，在受感染宿主中病毒生长为明显低于野生型猪流感病毒的滴度。在本发明的一个方面，经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗是二价的。在本发明的一个方面，经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗包括经修饰的活h3n2及h1n1猪流感病毒。在本发明的一个方面，猪流感病毒的经修饰的活h3n2及h1n1病毒具有在ns1基因内的缺失。进一步，术语“ns1基因内的缺失”分别是指在ns1蛋白内缺失一个或多个氨基酸以及在ns1orf或核苷酸序列内缺失一个或多个核酸。然而，术语ns1并非仅指ns1orf，而是还指ns1orf所编码的ns1orf产物(诸如rna或蛋白)。在蛋白的情况下，ns1基因产物是全长并具有野生型ns1活性(例如，来自influenzaa/swine/texas/4199-2/98)。全长野生型猪ns1蛋白在217至237个氨基酸之间变化。然而，在大多数情况下，全长野生型猪ns1蛋白为219个氨基酸。典型猪ns1基因可存在于诸如genbank之类的公共序列数据库中，并且包括但不限于genbank登记号aj293939(a/swine/italy/13962/95(h3n2))以及genbank登记号aj344041(a/swine/cotesd'armor/1121/00(h1n1))。术语“h1n1”及“h3n2”是本领域的技术人员已知的。然而，一般而言，a型流感病毒分为17种ha(血凝素)以及10种na(神经氨酸酶)亚型，其可以产生许多可能的组合(命名为h1n1、h1n2……h2n1、h2n2……h5n1、h5n2……等等)。因此，术语“h1n1”及“h3n2”是指siv的血凝素(ha)及神经氨酸酶(na)亚型的具体组合。在本发明的一个方面，猪流感的经修饰的活h3及h1病毒具有羧基末端截短的ns1蛋白。术语“羧基末端截短”是指羧基末端的ns1蛋白的截短。术语“羧基末端”已在上文中描述。术语“被截短或截短”是指ns1蛋白内的一个或多个氨基酸的缺失或ns1基因或核苷酸序列内的一个或多个核酸的缺失。因此，ns1基因产物的氨基末端区域的部分被保留，而ns1基因产物的羧基末端区域的部分缺失。术语“氨基酸序列”、“多肽”与“蛋白”可互换使用。术语“氨基酸序列”是指由天然存在的氨基酸及其衍生物构成的氨基酸序列。天然存在的氨基酸在本领域中众所周知，并且在生物化学的标准教科书中有所描述。在氨基酸序列内，氨基酸由肽键连接。进一步，氨基酸序列的两个末端被称为羧基末端(c末端)以及氨基末端(n末端)。优选地，本发明的减毒猪流感病毒包括基因组，该基因组包含ns1基因中的突变，从而导致由来自ns1羧基末端的5个、优选10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、100、105、110、115、119、120、121、125、130、135、140、145、146、147、148、150、155、160、165、170或175个氨基酸残基组成的缺失或来自羧基末端的在5-170、25-170、50-170、100-170、90-160、100-160或105-160、90-150、5-75、5-50或5-25个之间的氨基酸残基的缺失。更优选地，本发明的减毒猪流感病毒包括基因组，该基因组包含ns1基因中的突变，从而导致除氨基酸残基1-130、氨基酸残基1-129、氨基酸残基1-128、氨基酸残基1-127、氨基酸残基1-126、氨基酸残基1-125、氨基酸残基1-124、氨基酸残基1-123、氨基酸残基1-122、氨基酸残基1-121、氨基酸残基1-120、氨基酸残基1-115、氨基酸残基1-110、氨基酸残基1-100、氨基酸残基1-99、氨基酸残基1-95、氨基酸残基1-85、氨基酸残基1-80、氨基酸残基1-75、氨基酸残基1-73、氨基酸残基1-70、氨基酸残基1-65或氨基酸残基1-60之外ns1基因产物的所有氨基酸残基的缺失，其中氨基末端氨基酸为1号。在本发明的一个方面，猪流感病毒的经修饰的活h3n2及h1n1病毒对包括ns1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短的ns1蛋白进行编码，其中氨基末端氨基酸为1号。术语“羧基末端”或“羧基端”是本领域的技术人员熟知的。羧基末端也被称为羧基端、c末端、c末端尾部、c端或cooh末端。当蛋白从信使rna进行翻译时，它是从n末端到c末端形成。因此，羧基末端是氨基酸链(蛋白或多肽)的末端，其由游离羧基(-cooh)封端。在本发明的一个方面，猪流感病毒的经修饰的活h3n2及h1n1病毒编码包括ns1氨基酸1至126的羧基末端截短的ns1蛋白，其中氨基末端氨基酸为1号。在本发明的一个方面，猪流感病毒的经修饰的活h3n2及h1n1病毒具有羧基末端截短的ns1蛋白，从而导致91、92、93或94氨基酸残基从ns1的羧基末端缺失。在本发明的一个方面，猪流感病毒的经修饰的活h3n2及h1n1病毒具有来自a/swine/texas/4199-2/98的ns1基因或蛋白。在本发明的一个方面，猪流感的经修饰的活h3n2病毒是tx/98/del126。术语“tx/98/del126”是指具有ns1缺失突变体的a/swine/texas/4199-2/98株，其编码包括ns1氨基酸1至126的羧基末端截短的ns1蛋白，其中氨基末端氨基酸为1号。在本发明的一个方面，猪流感的经修饰的活h1n1病毒包含来自a/swine/minnesota/37866/1999(h1n1)的ha及na以及来自a/swine/texas/4199-2/98(h3n2)的pb2、pb1、pa、np、m，并且ns1-126基因来自a/swine/texas/4199-2/98(h3n2)。在本发明的一个方面，猪流感的经修饰的活h1病毒是a/swine/minnesota/37866/1999与tx/98/del126的嵌合体。在本发明的一个方面，猪流感的经修饰的活h3n2病毒是包含来自a/swine/texas/4199-2/98的ha、na、pb2、pb1、pa、np以及m的tx/98/del126，并且ns1-126基因来自a/swine/texas/4199-2/98，并且其中猪流感的经修饰的活h1n1病毒包含来自a/swine/minnesota/37866/1999(h1n1)的ha及na以及来自a/swine/texas/4199-2/98(h3n2)的pb2、pb1、pa、np、m，并且ns1-126基因来自a/swine/texas/4199-2/98(h3n2)。术语“ha、na、pb2、pb1、pa、np以及m”是指猪流感病毒的基因节段或基因。一般而言，流感a基因组包含编码11种蛋白的八个基因节段。这些蛋白包括形成核壳体的依赖于rna的rna聚合酶蛋白(pb2、pb1以及pa)以及核蛋白(np)；基质膜蛋白(m1、m2)；从含有脂质的包膜突出的两种表面糖蛋白：血凝素(ha)以及神经氨酸酶(na)；非结构蛋白(ns1)、核输出蛋白(nep)；以及促凋亡因子pb1-f2。在本发明的一个方面，猪流感的经修饰的活h3病毒是被命名为tx/98/del126的在wo2006/083286a2中所述的猪流感病毒的h3n2ns1缺失突变体。在本发明的一个方面，经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗是如在wo2016/137929a1中所述的二价疫苗或ingelvacprovenzatm疫苗。具体而言，在wo2016/137929a1的第15段至第140段或在wo2016/137929a1的实施例1中描述了该二价疫苗。试剂盒在本发明的一个方面，所述至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针位于一个容器中。在本发明的一个方面，所述至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针位于两个或更多个单独的容器中。在本发明的一个方面，所述至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对、针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针以及针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针位于一个容器中。在本发明的一个方面，所述至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对、针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针以及针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针位于两个或更多个单独的容器中。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针以及针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针位于一个容器中。在本发明的一个方面，针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针以及针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针位于两个或更多个单独的容器中。在本发明的一个方面，所述试剂盒包括一个或多个对照样品。在本发明的一个方面，所述对照样品是rna、cdna或dna样品。在本发明的一个方面，对照是阳性对照，其包括针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性rna、cdna或dna。在本发明的一个方面，对照是阳性对照，其包括针对猪流感病毒的特异性rna、cdna或dna。在本发明的一个方面，所述试剂盒包括说明书，其提供试剂盒使用的信息。序列概述：将详细描述以下序列并以此在本发明中公开这些序列：seqidno:1nsfor引物(gataataggctctctttgtg)seqidno:2nsrev引物(aggtaatggtgaaatttctc)seqidno:3mlvfluprobetagatcttgattaattaa(18nt)：针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针(“核心序列”)seqidno:4ttaattaatcaagatcta(18nt)：seqidno:3的反向互补序列seqidno:5mlvfluprobe(agtagatcttgattaattaagagggagc)seqidno:6gctccctcttaattaatcaagatctact：seqidno:5的反向互补序列seqidno:7mlvprobe(atggaaaagtagatcttgattaattaagagg)seqidno:8cctcttaattaatcaagatctacttttccat：seqidno:7的反向互补序列seqidno:9mlvprobe(agtagatcttgattaattaagagggagcaatcg)seqidno:10cgattgctccctcttaattaatcaagatctact：seqidno:9的反向互补序列seqidno:11wtfluprobe(gtgtgatctttaaccgattagagactttg)seqidno:12caaagtctctaatcggttaaagatcacac：seqidno:11的反向互补序列seqidno:13wtfluprobe(tgatactactaagggctttcactga)seqidno:14tcagtgaaagcccttagtagtatca：seqidno:13的反向互补序列seqidno:15wtfluprobe(tgatactactaagagctttcactga)seqidno:16tcagtgaaagctcttagtagtatca：seqidno:15的反向互补序列seqidno:17wtfluprobe(taatactactaagggctttcactga)seqidno:18tcagtgaaagcccttagtagtatta：seqidno:17的反向互补序列seqidno:19wtfluprobe(tgatactactgagagctttcactga)seqidno:20tcagtgaaagctctcagtagtatca：seqidno:19的反向互补序列seqidno:21wtfluprobe(tggtactactaagggctttcactg)seqidno:22cagtgaaagcccttagtagtacca：seqidno:21的反向互补序列seqidno:23wtfluprobe(tgatactactaagggctttcaccg)seqidno:24cggtgaaagcccttagtagtatca：seqidno:23的反向互补序列seqidno:25wtfluprobe(tgatactactgagggctttcactg)seqidno:26cagtgaaagccctcagtagtatca：seqidno:25的反向互补序列seqidno:27nsfor引物(gataataggccctctttgtg)seqidno:28nsfor引物(gataataggccctctttgc)seqidno:29nsfor引物(gataacaggctctctttgtg)seqidno:30nsfor引物(caataggccctctttgtg)seqidno:31nsfor引物(gataataggctttctttgtgtg)seqidno:32nsrev引物(aggcaatggtgaaatttctc)seqidno:33nsrev引物(aaggtaatgatgaaatttctcc)seqidno:34nsrev引物(aggtaatggtgaaatttcac)seqidno:35nsrev引物(aggtaatggtgagatttctc)seqidno:36nsrev引物(aggtaagggtgaaatttctc)seqidno:37nsfor引物(gataataggctctctttgtgtgc)seqidno:38nsrev引物(gagaaggtaatggtgaaatttctc)seqidno:39cmos硫醇探针agtagatcttgattaattaagagggagcaatcgseqidno:40cgattgctccctcttaattaatcaagatctact：seqidno:39的反向互补序列发明详述在本文中描述以下条款：1、一种用于检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的诊断试剂盒，其包括针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸。2、一种用于区分接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物的诊断试剂盒，其包括：a.针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；b.针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针，其用于检测猪流感病毒感染。3、一种用于在生物样品中检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的生物样品；b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对与所述生物样品接触；d.使用针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及e.检测所述信号，其中检测出所述信号指示在生物样品中接种了猪流感病毒特异性疫苗。4、一种用于在生物样品中检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的生物样品；b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述生物样品接触；d.产生扩增产物以及寡核苷酸探针信号；以及e.检测所述寡核苷酸探针信号，其中检测出寡核苷酸探针信号指示在生物样品中接种了猪流感病毒特异性疫苗。5、一种区分接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物的方法，其包括：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的生物样品；b.提供i)至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对，以及ii)用于检测猪流感病毒特异性疫苗接种的针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸，以及提供iii)用于检测猪流感病毒感染的针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对与所述生物样品接触；d.使用针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针及/或针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及e.检测所述信号，其中i)使用针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针检测出信号指示生物样品中接种了猪流感特异性疫苗，并且ii)使用针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针检测出信号指示生物样品中感染了猪流感病毒。6、一种区分接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物的方法，其包括：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的生物样品；b.提供i)至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对，以及ii)用于检测猪流感病毒特异性疫苗接种的针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸，以及提供iii)用于检测猪流感病毒感染的针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述生物样品接触；d.产生扩增产物以及寡核苷酸探针信号；以及e.检测所述寡核苷酸探针信号，其中i)检测出来自针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号指示生物样品中接种了猪流感特异性疫苗，并且ii)检测出来自针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号指示生物样品中感染了猪流感病毒。7、一种用于在动物组内检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的环境样品；b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述环境样品接触；d.使用针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及e.检测寡核苷酸探针信号，其中寡核苷酸探针信号的存在指示在所述动物组内接种了猪流感病毒特异性疫苗。8、一种用于在动物组内检测接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的环境样品；b.提供正向及反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述环境样品接触；d.产生扩增产物以及寡核苷酸探针信号；以及e.检测寡核苷酸探针信号，其中寡核苷酸探针信号的存在指示在所述动物组内接种了猪流感病毒特异性疫苗。9、一种用于确定在动物组内接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物之间的比率的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的环境样品；b.提供i)至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对，以及ii)用于检测猪流感病毒特异性疫苗接种的针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸，以及iii)用于检测猪流感病毒感染的针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述环境样品接触；d.使用针对经修饰的活猪流感特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针及/或针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针产生信号；以及e.检测i)来自针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号，以及ii)来自针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号；f.产生步骤e的i)与ii)或ii)与i)的比率。10、一种用于确定在动物组内接种了经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的动物与感染了猪流感病毒的动物之间的比率的方法，其包括以下步骤：a.获得包含来自动物的至少一种核酸的环境样品；b.提供i)至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对，以及ii)用于检测猪流感病毒特异性疫苗接种的针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括seqidno:3(tagatcttgattaattaa)所示序列或其反向互补序列(seqidno:4ttaattaatcaagatcta)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸，以及iii)用于检测猪流感病毒感染的针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针；c.在允许多核苷酸扩增的条件下使所述寡核苷酸引物对以及所述寡核苷酸探针与所述环境样品接触；d.产生扩增产物以及寡核苷酸探针信号；以及e.检测i)来自针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号，以及ii)来自针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针的寡核苷酸探针信号；f.产生步骤e的i)与ii)或ii)与i)的比率。11、根据条款3至10中任一项所述的方法，其中步骤a或c包括从所述生物样品或所述环境样品提取所述核酸。12、根据条款3至11中任一项所述的方法，其中步骤a或c包括rna的逆转录。13、根据条款1或2所述的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一个正向及反向寡核苷酸引物对。14、根据条款1至13中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:3所示序列或其反向互补序列(seqidno:4)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十四个连续核苷酸。15、根据条款1至14中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:3所示序列或其反向互补序列(seqidno:4)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十五个连续核苷酸。16、根据条款1至15中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:3所示序列或其反向互补序列(seqidno:4)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十六个连续核苷酸。17、根据条款1至16中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:3所示序列或其反向互补序列(seqidno:4)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十七个连续核苷酸。18、根据条款1至17中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:3所示序列或其反向互补序列(seqidno:4)或与其具有至少70％序列一致性的序列。19、根据条款1至18中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5(agtagatcttgattaattaagagggagc)或seqidno7:(atggaaaagtagatcttgattaattaagagg)、seqidno9:(agtagatcttgattaattaagagggagcaatcg)或seqidno:39(agtagatcttgattaattaagagggagcaatcg)所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸。20、根据条款1至19中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十四个连续核苷酸。21、根据条款1至20中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十六个连续核苷酸。22、根据条款1至21中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十八个连续核苷酸。23、根据条款1至22中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十个连续核苷酸。24、根据条款1至23中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十二个连续核苷酸。25、根据条款1至24中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十四个连续核苷酸。26、根据条款1至25中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十六个连续核苷酸。27、根据条款1至26中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9或seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:6；seqidno:8；seqidno:10；seqidno:40)或与其具有至少70％序列一致性的序列。28、根据条款1至27中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少80％。29、根据条款1至28中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少90％。30、根据条款1至29中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少95％。31、根据条款1至30中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少97.5％。32、根据条款1至31中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的序列包括seqidno:5所示序列或其互补反向序列(seqidno:6)。33、根据条款1至31中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的序列包括seqidno:7所示序列或其反向互补序列(seqidno:8)。34、根据条款1至31中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的序列包括seqidno:9所示序列或其互补反向序列(seqidno:10)，或其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针的序列包括seqidno:39所示序列或其互补反向序列(seqidno:40)。35、根据条款1至34中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针与经修饰的活猪流感特异性疫苗内的非天然存在的序列结合。36、根据条款1至35中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针与经修饰的活猪流感特异性疫苗内在ns(非结构蛋白)基因节段内的非天然存在的序列结合。37、根据条款1至36中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针与经修饰的活猪流感特异性疫苗内在ns-1(非结构蛋白)与ns-2orf之间的非天然存在的序列结合。38、根据条款2、5、6以及9至37中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针与猪流感病毒内的天然存在的序列结合。39、根据条款2、5、6以及9至38中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针是针对猪流感病毒的ha、na、pb1、pb2、pa、np、m或ns基因节段具有特异性。40、根据条款2、5、6以及9至39中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针是针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性。41、根据条款2、5、6以及9至40中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针是针对ns-1(非结构蛋白-1)orf具有特异性。42、根据条款2、5、6以及9至41中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11(gtgtgatctttaaccgattagagactttgt)或seqidno:13(tgatactactaagggctttcactga)或seqidno:15(tgatactactaagagctttcactga)或seqidno:17(taatactactaagggctttcactga)或seqidno:19(tgatactactgagagctttcactga)或seqidno:21(tggtactactaagggctttcactg)或seqidno:23(tgatactactaagggctttcaccg)或seqidno:25(tgatactactgagggctttcactg)所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸。43、根据条款2、5、6以及9至42中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十四个连续核苷酸。44、根据条款2、5、6以及9至43中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或其互补反向序列或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十六个连续核苷酸。45、根据条款2、5、6以及9至44中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十八个连续核苷酸。46、根据条款2、5、6以及9至45中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十个连续核苷酸。47、根据条款2、5、6以及9至46中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十二个连续核苷酸。48、根据条款2、5、6以及9至47中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十四个连续核苷酸。49、根据条款2、5、6以及9至48中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十六个连续核苷酸。50、根据条款2、5、6以及9至49中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少二十八个连续核苷酸。51、根据条款2、5、6以及9至50中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)或与其具有至少70％序列一致性的序列。52、根据条款42至51中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少80％。53、根据条款42至52中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少90％。54、根据条款42至53中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少95％。55、根据条款42至54中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针的所述序列一致性为至少97.5％。56、根据条款38至55中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对猪流感病毒的特异性寡核苷酸探针的序列包括seqidno:11；seqidno:13；seqidno:15；seqidno:17；seqidno:19；seqidno:21；seqidno:23或seqidno:25中所示序列或其互补反向序列(seqidno:12；seqidno:14；seqidno:16；seqidno:18；seqidno:20；seqidno:22；seqidno:24；seqidno:26)。57、根据条款3至12以及14至56中任一项所述的检测方法或区分方法，其中信号是酶信号、荧光信号或电化学信号。58、根据条款1至57中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针或引物与可检测标记偶连，该可检测标记选自由放射性元素以及荧光化学物质组成的组。59、根据条款1至57中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针与可检测标记偶连，该可检测标记选自由放射性元素以及荧光化学物质组成的组。60、根据条款58或59所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中荧光化学物质标记选自荧光素、花青染料、香豆素、藻红蛋白、藻胆蛋白、丹酰氯、镧系络合物或荧光染料。61、根据条款60所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中所述荧光染料是r-藻红蛋白、cy3、cy5、quasar670、罗丹明、alexa或texasred。62、根据条款60所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中所述荧光素是6-fam(6-羧基荧光素)、tet(6-羧基-4,7,2′,7′-四氯荧光素)、joe(2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基荧光素)或hex(6-羧基-2′,4′,7′,4,7-六氯荧光素)。63、根据条款1至62中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针进一步用猝灭剂标记，该猝灭剂选自6-羧基四甲基罗丹明(tamra)、黑洞猝灭剂(bhq)bhq-1及2或6-羧基-x-罗丹明(rox)。64、根据条款1至63中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针或引物与荧光标记偶连。65、根据条款1至64中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针或引物与第一偶连基偶连。66、根据条款3至64中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中引物与第一偶连基偶连。67、根据条款65或66所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中信号的产生包括提供第二偶连基。68、根据条款65至67中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中所述第一及第二偶连基选自由抗体-抗原、受体-配体、生物素-链霉亲和素、糖-外源凝集素以及互补寡核苷酸组成的组。69、根据条款65至68中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中对第二偶连基进行标记。70、根据条款69所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中标记选自由放射性元素、荧光化学物质或酶组成的组。71、根据条款70所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中所述荧光化学物质标记是根据条款60至62的荧光。72、根据条款70所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中所述酶标记选自辣根过氧化物酶(hrp)、酯酶、碱性磷酸酶(ap)、葡萄糖氧化酶、β半乳糖苷酶或荧光素酶。73、根据条款3至12、14至57、65至70以及72中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针或引物信号是酶信号。74、根据条款70或72所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中所述酶将基质转化成可逆氧化还原偶。75、根据条款3至12、14至57、65至70以及72至74中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸探针或引物信号是电化学信号。76、根据条款3至12以及14至75中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中多核苷酸的所述扩增是pcr(聚合酶链反应)或实时pcr(聚合酶链反应)。77、根据条款3至76中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中所述正向及所述反向寡核苷酸引物针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性。78、根据条款3至77中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中所述正向寡核苷酸引物针对ns-1(非结构蛋白-1)orf具有特异性。79、根据条款3至78中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中所述反向寡核苷酸引物针对ns-2(非结构蛋白-2)orf具有特异性。80、根据条款3至79中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1(gataataggctctctttgtg)或seqidno:2(aggtaatggtgaaatttctc)或seqidno:27至seqidno:38所示序列或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十二个连续核苷酸。81、根据条款3至80中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1、seqidno:2或seqidno:27至seqidno:38所示序列或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十四个连续核苷酸。82、根据条款3至81中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1、seqidno:2或seqidno:27至seqidno:38所示序列或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十六个连续核苷酸。83、根据条款3至82中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1、seqidno:2或seqidno:27至seqidno:38所示序列或与其具有至少70％序列一致性的序列中的至少十八个连续核苷酸。84、根据条款3至83中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1、seqidno:2或seqidno:27至seqidno:38所示序列或与其具有至少70％序列一致性的序列。85、根据条款80至84中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸引物的所述序列一致性为至少80％。86、根据条款80至85中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸引物的所述序列一致性为至少90％。87、根据条款80至86中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸引物的所述序列一致性为至少95％。88、根据条款80至87中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中寡核苷酸引物的所述序列一致性为至少97.5％。89、根据条款80至88中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中针对ns(非结构蛋白)基因节段具有特异性的所述正向及所述反向寡核苷酸引物包括seqidno:1、seqidno:2或seqidno:27至seqidno:38所示序列。90、根据条款1至89中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中所述动物是猪。91、根据条款3至6、11至12以及14至90中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中生物样品是鼻样品、口腔液样品、呼吸组织样品或肺样品。92、根据条款7至12以及14至90中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中环境样品是空气过滤器样品或用于收集口腔液的绳样品。93、根据条款3至12以及14至92中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗或猪流感病毒的浓度在2至12logeid50之间。94、根据条款3至12以及14至93中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗或猪流感病毒的浓度在4至10logeid50之间。95、根据条款3至12以及14至94中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗或猪流感病毒的浓度在6至8logeid50之间。96、根据条款1至95中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗包括与根据条款14至34中任一项所述的针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性寡核苷酸探针相同或互补的序列。97、根据条款1至96中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中根据条款96的所述相同或互补序列是经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗内的非天然存在的序列。98、根据条款1至97中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中根据条款96或97的所述相同或互补序列位于经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的ns(非结构蛋白)基因节段内。99、根据条款1至98中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中根据条款96至98的所述相同或互补序列位于经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的ns-1(非结构蛋白)与ns-2orf之间。100、根据条款1至99中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗是减毒的。101、根据条款1至100中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗是二价的。102、根据条款1至101中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗包括经修饰的活h3n2及h1n1猪流感病毒。103、根据条款1至102中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中猪流感病毒的经修饰的活h3n2及h1n1病毒具有在ns1基因内的缺失。104、根据条款1至103中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中猪流感病毒的经修饰的活h3n2及h1n1病毒编码羧基末端截短的ns1蛋白。105、根据条款1至104中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中猪流感病毒的经修饰的活h3n2及h1n1病毒编码包括ns1氨基酸1至124、1至125、1至126、1至127或1至128的羧基末端截短的ns1蛋白，其中氨基末端氨基酸为1号。106、根据条款1至105中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中猪流感病毒的经修饰的活h3n2及h1n1病毒编码包括ns1氨基酸1至126的羧基末端截短的ns1蛋白，其中氨基末端氨基酸为1号。107、根据条款1至106中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中猪流感病毒的经修饰的活h3n2及h1n1病毒具有羧基末端截短的ns1蛋白，从而导致91、92、93或94氨基酸残基从ns1的羧基末端缺失。108、根据条款1至107中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中猪流感病毒的经修饰的活h3n2及h1n1病毒具有来自a/swine/texas/4199-2/98的ns1基因或蛋白。109、根据条款1至108中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中猪流感的经修饰的活h3n2病毒是包含来自a/swine/texas/4199-2/98的ha、na、pb2、pb1、pa、np以及m的tx/98/del126，并且ns1-126基因来自a/swine/texas/4199-2/98，并且其中猪流感的经修饰的活h1n1病毒包含来自a/swine/minnesota/37866/1999(h1n1)的ha及na以及来自a/swine/texas/4199-2/98(h3n2)的pb2、pb1、pa、np、m，并且ns1-126基因来自a/swine/texas/4199-2/98(h3n2)。110、根据条款13至109中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针位于一个容器中。111、根据条款13至109中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对以及针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针位于两个或更多个单独的容器中。112、根据条款13至109中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对、针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针以及针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针位于一个容器中。113、根据条款13至109中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述至少一个正向及一个反向寡核苷酸引物对、针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针以及针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针位于两个或更多个单独的容器中。114、根据条款2以及13至109中任一项所述的诊断试剂盒，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针以及针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针位于一个容器中。115、根据条款2以及13至109中任一项所述的诊断试剂盒，其中针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的所述特异性寡核苷酸探针以及针对猪流感病毒的所述特异性寡核苷酸探针位于两个或更多个单独的容器中。116、根据条款1或2以及13至115中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包括一个或多个对照样品。117、根据条款116所述的诊断试剂盒，其中所述对照样品是rna、cdna或dna样品。118、根据条款116或117所述的诊断试剂盒，其中对照是阳性对照，其包括针对经修饰的活猪流感病毒特异性疫苗的特异性rna、cdna或dna。119、根据条款116或117所述的诊断试剂盒，其中对照是阳性对照，其包括针对猪流感病毒的特异性rna、cdna或dna。120、根据条款1或2以及13至119中任一项所述的诊断试剂盒，其中所述试剂盒包括说明书，其提供试剂盒使用的信息。121、根据条款1至118中任一项所述的诊断试剂盒、检测方法或区分方法，其中所述猪流感病毒是猪流感a病毒。实施例以下实施例仅旨在例示本发明。这些实施例不应以任何方式限制权利要求的范围。材料及方法1.引物/探针混合物的制备表1：引物/探针序列：表2：引物/探针浓度引物/探针混合物最终浓度：nsforgataataggctctctttgtg(seqidno:1)0.5μmnsrevaggtaatggtgaaatttctc(seqidno:2)0.4μmwtfluprobegtgtgatctttaaccgattagagactttg(seqidno:11)0.25μmmlvfluprobe1atggaaaagtagatcttgattaattaagagg(seqidno:7)0.25μmmlvfluprobe2agtagatcttgattaattaagagggagc(seqidno:5)0.25μm引物及探针购自biosearchtechnologies。ns(非结构蛋白)；for(正向)；rev(反向)；wt(野生型)；mlv(经修饰的活病毒)2.主混合物的制备表3：主混合物的制备5.5μl混合物+5.5μlrna3.循环方案表4：循环方案4.提取信息使用lifetech核心试剂盒(thermofisherscientific)提取样品。表5：提取口腔液步骤核心口腔液程序1将450μl溶解溶液添加到96深孔板2装载300μl样品3摇晃3分钟，旋转3分钟4在新的96深孔板中，装载30μl小珠5将600μl来自步骤3的澄清溶解产物添加到小珠6将350μliso添加到样品7装载到kf上表6：提取鼻拭子步骤核心(血清)拭子程序1将30μl小珠混合物装载到深孔板中2将100μl样品装载到小珠3将700μl溶解/结合溶液添加到样品4装载到kf上5.使用的设备使用kingfisherflex96机器人(thermofisherscientific)提取样品。使用lightcycler480系统2(rocheappliedscience)进行实时pcr。6.检测原理将两个水解探针设计为在pcr反应期间在引物下游结合。使用荧光报告分子标记每一探针的5’末端(参见表1)。在3’末端上，探针已经标记有限制荧光输出的猝灭剂。在pcr反应期间，通过聚合酶切除报告因子及猝灭剂。wt探针标记有fam报告因子，该fam报告因子具有波长为495纳米(nm)的峰值激励以及520nm的峰值发射。mlv探针标记有quasar670报告因子，该quasar670报告因子具有波长为647nm的峰值激励以及670nm的峰值发射。推荐将这些报告染料及淬灭剂用于lightcycler480ii(roche)上，但是也可以使用其他常用染料。表7：关于测试样品的信息病毒信息浓度代码provenza疫苗6-8logeid50aa/swine/indiana/1726/1988(h1n1)6-8logeid50ba/swine/texas/4199-2/1998(h3n2)6-8logeid50ca/swine/nebraska/97901-10/2008(h3n2)6-8logeid50da/swine/northcarolina/001169/2006(h1n2)6-8logeid50e表7中所提到的对于所有病毒的整个病毒测序是在newportlabs处进行以确定与wt探针的探针匹配。provenza疫苗是二价siav疫苗，其已经在wo2016/137929a1中进行了描述。研究设计—实验#1创建加料研究，其中将每一上述病毒加入阴性鼻拭子介质或阴性口腔液样品中。在合适的样品内创建每一加料样品的1:10稀释系列。例如，a是未稀释(provenza疫苗)样品，a1是1:10稀释物，a2是1:100稀释物，以此类推。每种样品提取一次，并且使用如上所述的主混合物(wt及provenza探针)以及循环方案通过qpcr(定量pcr)对每种样品测试三次。报告这3次重复测试的平均ct值(循环阈值)。研究设计–实验#2混合并测试来自实验#1的样品以评估交叉反应性及检测以模仿在接种时的流感病毒的野生感染。通过qpcr对样品测试三次，并且报告平均循环阈值(ct值)。研究设计—实验#3进行实验#3以评估可选探针设计(被称作mlv探针1(atggaaaagtagatcttgattaattaagagg))的潜在应用。使用ingelvacprovenza疫苗创建1:10稀释系列(provenza1至provenza5).进行pcr，其比较mlv1与mlv2探针设计的结果。对样品测试两次，并且报告平均循环阈值(ct)以进行比较。实验#1结果—鼻拭子样品：表8：provenza(mlv)wtmlva未检测出22.75a1未检测出22.43a2未检测出26.14a3未检测出26.56a4未检测出31.03表9：h1n1ind88(wt)wtmlvb30.56未检测出b131.73未检测出b235.65未检测出b338.13未检测出b441.02未检测出表10：h3n2tx98(wt)wtmlvc23.01未检测出c125.20未检测出c229.08未检测出c332.35未检测出c435.34未检测出表11：h3n2ne08(wt)wtmlvd18.59未检测出d123.31未检测出d228.11未检测出d332.10未检测出d435.94未检测出表12：h1n2nc06(wt)wtmlve20.51未检测出e122.09未检测出e229.58未检测出e333.45未检测出e435.92未检测出实验#1结果—口腔液样品：表13：provenza(mlv)wtmlva未检测出20.42a1未检测出25.86a2未检测出26.80a3未检测出30.87a4未检测出35.12表14：h1n1ind88(wt)wtmlvb23.68未检测出b129.75未检测出b232.61未检测出b336.01未检测出b439.68未检测出表15：h3n2tx98(wt)wtmlvc17.90未检测出c121.68未检测出c225.87未检测出c329.16未检测出c433.24未检测出表16：h3n2ne08(wt)wtmlvd14.91未检测出d120.45未检测出d225.50未检测出d329.24未检测出d432.43未检测出表17：h1n2nc06(wt)wtmlve16.10未检测出e121.06未检测出e228.32未检测出e331.51未检测出e435.17未检测出实验#2结果—provenza强至弱与wt病毒强至弱混合：表18：provenza(mlv)+h1n1ind88(wt)表19：provenza(mlv)+h3n2tx98(wt)实验#3结果—mlv探针比较：表20讨论及结论实验#1的结果显示，当样品中仅存在provenza(mlv)时，其是用mlv探针检测的仅有的病毒。进一步，当野生型流感病毒株是存在的仅有的病毒时，其仅用wt探针进行检测。因此，这些探针分别针对wt病毒及mlv的检测具有特异性。进一步，该实验证明，wt与mlv病毒可以在诸如鼻拭子样品以及口腔液样品之类的不同样品中进行检测，但是还可以在诸如呼吸组织或环境样品之类的其他样品中进行检测。此外，可以在样品的多个稀释度中检测病毒。因此，实验#1显示，试验可以在各种稀释度的不同样品中使用预期探针来检测正确的病毒。不同探针之间不存在干扰。实验#2的结论是，试验可以在各种稀释度的不同样品中检测并区分流感病毒(ingelvacprovenza疫苗与野生型流感a病毒)。不同探针之间不存在干扰。实验3的结论是，用于检测ingelvacprovenza疫苗的可选探针设计是可能的。表20的结果显示，使用mlv2进行的检测有轻微改善。两种探针设计都不会与wt探针交叉反应以在该检测通道中产生非预期信号。实验#4–现场研究总结研究设计—实验#4现场验证–断奶年龄接种识别农场，其中断奶年龄(3周龄)猪仔在到达肥育单元之后每个标记接种provenzatm。畜棚1及畜棚2中的9个圈中的每一圈的5只动物在接种后的以下日子里均进行鼻拭子采集：0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、17以及21。在第一次收集之前，将动物的耳朵加上标签，因此可以在研究过程中对相同的动物进行取样。另外，在上述收集日子里在每一圈中悬挂1条棉绳以收集圈水平口腔液。通过2种pcr测试对所有样品进行测试：根据制造商操作指南的来自lifetechnologies(基质以及核蛋白目标)的iav-s筛选pcr以及如上所述的provenzatmpcr(ns1目标)。使用鼻拭子，可以在接种后4天检测到pcr阳性(数据未显示)。使用口腔液，可以在接种后10天检测到阳性。数据表明，口腔液及鼻拭子二者均可以用于在现场中进行测试以测定幼小猪仔中畜群的接种状态。现场验证—处理年龄接种识别客户农场，其中幼小猪仔(3-8日龄，平均为4)每个标记接种provenzatm。每一产仔箱的5只动物在接种后的以下日子里均进行鼻拭子采集：0、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、17以及21。在第一次收集之前，将动物的耳朵加上标签，因此可以在研究过程中对相同的动物进行取样。还记录母猪识别号。通过2种pcr测试对所有样品进行测试：根据制造商操作指南的来自lifetechnologies(基质以及核蛋白目标)的iav-s筛选pcr以及如上所述的provenzatmpcr(ns1目标)。使用鼻拭子，可以在接种后14天检测到pcr阳性(数据未显示)。数据表明，在现场中进行测试以测定断奶动物中畜群的接种状态同样适用。实验#5mobinostics方法1.材料及方法引物/探针序列：nsfor:5′gataataggctctctttgtgtgc3′(seqidno:37)nsrev:5′biotin-gagaaggtaatggtgaaatttctc3′(seqidno:38)cmos硫醇探针：5′ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttagtagatcttgattaattaagagggagcaatcg3′(seqidno:39:agtagatcttgattaattaagagggagcaatcg)引物及探针购自metabion。2.试剂、rt-pcr循环所有试剂(引物、探针、主混合物)以及循环条件被整合到mobinostics卡中。在rna基础上分别分析这两种provenza成分(h3n2rna成分以及h1n1rna成分)。首先，基于nprna标准通过参考流感病毒rna来确定rna样品中的rna拷贝。从eurofins订购1535nt长np(核蛋白)rna标准。制备1e08nprna拷贝作为储备，并且以使每一试样一次融化的方式进行等分。制备系列稀释物(1e08–1e02nprna拷贝)以用于定量实时rt-pcr。使用4xtagmanfastvirus1-stepmastermix用np引物以及taqmannp探针来进行一步式实时rt-pcr。基于np标准曲线来计算参考流感病毒rna的rna拷贝。然后，将20个rna拷贝/μl、200个rna拷贝/μl、1000个rna拷贝/μl以及10000个rna拷贝/μl应用到mobinostics卡并在mobinostics装置上以4-10次技术重复进行测定。cmos芯片技术已经在现有技术中充分地描述。例如，wo2018/065104a1，rolandthewes(启用基于cmos的dna阵列芯片)以及frey等人2005(数字cmosdna芯片)描述了cmos技术。一般而言，氧化还原循环技术包括芯片技术，诸如例如cmos芯片技术。一般而言，这背后的电化学原理是基于酶标记的电流产生过程，使得互补dna链的杂交转变成1pa至100na之间的在传感器电极处的传感器电流。将探针分子固定在传感器元件的表面上。将加上生物素标记(通过生物素标记的引物)的扩增产物施加到芯片。在杂交及洗涤阶段之后，将链霉亲和素-ap施加到芯片。在温育及洗涤步骤之后，将化学基质(对氨基苯磷酸盐)施加到芯片。可以在进行杂交的位置获得的酶标记使磷酸基团裂解，并且产生具有电化学活性的对氨基苯酚。同时将氧化及还原电势施加到传感器电极，在一个电极处将对氨基苯酚氧化成醌亚胺，并且在另一个电极处将醌亚胺还原为对氨基苯酚。表21：h1n1以及h3n2成分的mobinostics结果样品平均mlv-ns标准差阴性对照-0，080，08h1n1mlv20rna拷贝/μl0，170，15h1n1mlv200rna拷贝/μl0，730，05h1n1mlv1000rna拷贝/μl0，780，04h1n1mlv10000rna拷贝/μl0，840，02h3n2mlv20rna拷贝/μl-0，090，06h3n2mlv200rna拷贝/μl0，130，33h3n2mlv1000rna拷贝/μl0，520，09h3n2mlv10000rna拷贝/μl0，790，01如表21中所示的结果显示，dna芯片技术也可以用于检测provenza的rna/dna成分。序列表<110>勃林格殷格翰动物保健有限公司<120>经修饰的活猪流感病毒疫苗的检测<130>01-3290<160>40<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>猪流感病毒<400>1gataataggctctctttgtg20<210>2<211>20<212>dna<213>猪流感病毒<400>2aggtaatggtgaaatttctc20<210>3<211>18<212>dna<213>合成序列<400>3tagatcttgattaattaa18<210>4<211>18<212>dna<213>合成序列<400>4ttaattaatcaagatcta18<210>5<211>28<212>dna<213>合成序列<400>5agtagatcttgattaattaagagggagc28<210>6<211>28<212>dna<213>合成序列<400>6gctccctcttaattaatcaagatctact28<210>7<211>31<212>dna<213>合成序列<400>7atggaaaagtagatcttgattaattaagagg31<210>8<211>31<212>dna<213>合成序列<400>8cctcttaattaatcaagatctacttttccat31<210>9<211>33<212>dna<213>合成序列<400>9agtagatcttgattaattaagagggagcaatcg33<210>10<211>33<212>dna<213>合成序列<400>10cgattgctccctcttaattaatcaagatctact33<210>11<211>29<212>dna<213>猪流感病毒<400>11gtgtgatctttaaccgattagagactttg29<210>12<211>29<212>dna<213>猪流感病毒<400>12caaagtctctaatcggttaaagatcacac29<210>13<211>25<212>dna<213>猪流感病毒<400>13tgatactactaagggctttcactga25<210>14<211>25<212>dna<213>猪流感病毒<400>14tcagtgaaagcccttagtagtatca25<210>15<211>25<212>dna<213>猪流感病毒<400>15tgatactactaagagctttcactga25<210>16<211>25<212>dna<213>猪流感病毒<400>16tcagtgaaagctcttagtagtatca25<210>17<211>25<212>dna<213>猪流感病毒<400>17taatactactaagggctttcactga25<210>18<211>25<212>dna<213>猪流感病毒<400>18tcagtgaaagcccttagtagtatta25<210>19<211>25<212>dna<213>猪流感病毒<400>19tgatactactgagagctttcactga25<210>20<211>25<212>dna<213>猪流感病毒<400>20tcagtgaaagctctcagtagtatca25<210>21<211>24<212>dna<213>猪流感病毒<400>21tggtactactaagggctttcactg24<210>22<211>24<212>dna<213>猪流感病毒<400>22cagtgaaagcccttagtagtacca24<210>23<211>24<212>dna<213>猪流感病毒<400>23tgatactactaagggctttcaccg24<210>24<211>24<212>dna<213>猪流感病毒<400>24cggtgaaagcccttagtagtatca24<210>25<211>24<212>dna<213>猪流感病毒<400>25tgatactactgagggctttcactg24<210>26<211>24<212>dna<213>猪流感病毒<400>26cagtgaaagccctcagtagtatca24<210>27<211>20<212>dna<213>猪流感病毒<400>27gataataggccctctttgtg20<210>28<211>19<212>dna<213>猪流感病毒<400>28gataataggccctctttgc19<210>29<211>20<212>dna<213>猪流感病毒<400>29gataacaggctctctttgtg20<210>30<211>18<212>dna<213>猪流感病毒<400>30caataggccctctttgtg18<210>31<211>22<212>dna<213>猪流感病毒<400>31gataataggctttctttgtgtg22<210>32<211>20<212>dna<213>猪流感病毒<400>32aggcaatggtgaaatttctc20<210>33<211>22<212>dna<213>猪流感病毒<400>33aaggtaatgatgaaatttctcc22<210>34<211>20<212>dna<213>猪流感病毒<400>34aggtaatggtgaaatttcac20<210>35<211>20<212>dna<213>猪流感病毒<400>35aggtaatggtgagatttctc20<210>36<211>20<212>dna<213>猪流感病毒<400>36aggtaagggtgaaatttctc20<210>37<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>37gataataggctctctttgtgtgc23<210>38<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>38gagaaggtaatggtgaaatttctc24<210>39<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>39agtagatcttgattaattaagagggagcaatcg33<210>40<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>探针<400>40cgattgctccctcttaattaatcaagatctact33当前第1页12