具有多糖结合能力的多肽的制作方法

专利名称：：具有多糖结合能力的多肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种具有多糖结合能力的多肽。
背景技术：
：纤维素酶是水解纤维素链的β-1，4糖苷键的酶的总称，根据它们对纤维素水解方式的不同分为三类内切-β-1，4-葡聚糖酶(endo-^-l,4-glucanase,EC3.2.1.4)、外切-β-1,4-葡聚糖酶(exo-β-1，4-glucanase，又叫纤维二糖水解酶cellobiohydrolase，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21)。这三种酶协同作用能将纤维素转化成葡萄糖(LyndLR,WeimerPJ,vanZylWH,andPretoriusIS.2002.Microbialcelluloseutilization!fundamentalsandbiotechnology.Microbiol.Mol.Biol.Rev.66:506_577.)。大部分纤维素酶由一个或几个催化功能域和一个或更多个其它的功能域如碳水化合物结合组件(carbohydrate-bindingmodules,CBMs)组成，两者间由连接月太连接(Shoseyov0，ShaniZ,andLevyI.2006.Carbohydratebindingmodulesbiochemicalpropertiesandnovelapplications.Microbiol.Mol.Biol.Rev.70283-295.)。第一个碳水化合物结合组件是1986年在瑞氏木霉(Trichodermareesei)的纤维二糖水解酶I中发现的，最初该结构域被命名为纤维素结合功能域(cellulose-bindingdomain,CBD)，以它能识别和吸附纤维素而命名的(VanTilbeurghH，TommeP，ClaeyssensM,BhikhabhaiR.andPetterssonG.1986.LimitedproteolysisofthecellobiohydrolaseIfromTrichodermareesei.raBSLett.204:223_227)。后来发现该结构域不仅能吸附纤维素，还能识别和吸附植物细胞壁其他的多糖成分，包括几丁质、β-1，3-葡聚糖、β-1，3-1，4-葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖等，还有些碳水化合结合组件可以结合不可溶的储存多糖，例如淀粉，所以现在将具有这样性质的结构域命名为碳水化合物结合组件。碳水化合物结合组件不仅在纤维素酶中被发现，在其他的酶类或蛋白中也有发现，如糖基水解酶、酯酶、果胶酶等。碳水化合物结合组件一般位于酶的氨基端或羧基端，其大小通常大于30个氨基酸及小于250个氨基酸，所以其分子量一般大于4k道尔顿和小于40k道尔顿。根据氨基酸序列相似性，碳水化合物结合组件被划分成不同的家族(families)。根据Cazy服务器(server)(http//afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)上所列碳水化合物结合组件的最新清单，目前碳水化合物结合组件被分为59个家族。随着新的酶的发现，同时伴随着新的家族的碳水化合物结合组件的被发现。一系列未知功能的结构域已经被鉴定为新的碳7K化合物结合组件(BolamDN,XieH,PellG,HoggD,GalbraithG,HenrissatB,andGilbertHJ.2004.X4modulesrepresentanewfamilyofcarbohydrate-bindingmodulesthatdisplaynovelproperties.J.Biol.Chem.27922953-22963；DvortsovI.A,LuninaNA,ChekanovskayaLA,SchwarzWH,ZverlovVV,andVelikodvorskayaGA.2009.Carbohydrate-bindingpropertiesofaseparatelyfoldingproteinmodulefrombeta-1,3-glucanaseLicl6AofClostridiumthermocellum.Microbiology1552442-2449.)。碳水化合物结合组件的主要功能是识别和吸附多糖，它通过增加底物表面酶的浓度提高酶对可溶或不可溶底物的活性(BeguinP,andAubertJP.1994.Thebiologicaldegradationofcellulose.FEMSMicrobiol.Rev.1325~58；ShoseyovO,ShaniΖ,andLevyI.2006.Carbohydratebindingmodules:biochemicalpropertiesandnovelapplications.Microbiol.Mol.Biol.Rev.70:283_295)。另外CBM还有其他的一些功能，如有些CBM可以破坏底物的结构，使晶体结构变得松散，有利于酶更好的作用底物(LevyI，ShaniZ，andShoseyov0.2002.Modificationofpolysaccharidesandplantcellwallbyendo_l，4-beta-glucanaseandcellulose—bindingdomains.Biomol.Eng.1917-30；GiardinaT，GunningAP，JugeN，FauldsCB，FurnissCS，SvenssonB，MorrisVJ，andWilliamsonG.2001.Bothbindingsitesofthestarch-bindingdomainofAspergillusnigerglucoamylaseareessentialforinducingaconformationalchangeinamylose.J.Mol.Biol.313:1149_1159·)。有些碳水化合物结合组件可以增强酶对温度和pH的稳定性(SurmaA,GibbsMD，mdBergquistPL2000.Anovelthermostablemultidomain1，4-beta-xylanasefromCaldibacilluscellulovoransandeffectofitsxylan-bindingdomainonenzymeactivity.Microbiology146:2947-2955.)。近来还发现家族35和37的碳水化合物结合组件还能结合到细菌细胞的表面，介导携带该组件的酶结合到宿主的表面(MontenierC，vanBuerenAL，DumonC，FlintJE，CorreiaMA，PratesJA，FirbankSJ，LewisRJ，GrondinGG，GhinetMG，GlosterTM，HerveC，KnoxJP，TalbotBG，TurkenburgJP，KerovuoJ，BrzezinskiR，FontesCM，DaviesGJ，BorastonAB，andGilbertHJ.2009.Evidencethatfamily35carbohydratebindingmodulesdisplayconservedspecificitybutdivergentfunction.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1063065-3070；EzerA，MatalonE,JindouS,BorovokI，AtamnaN，YuZ，MorrisonM，BayerEA,andLamedR.2008.Cellsurfaceenzymeattachmentismediatedbyfamily37carbohydrate—bindingmodules，uniquetoRuminococcusalbus.J.Bacteriol.1908220-8222.)。自然界大部分的微生物在实验室的条件下是不容易被分离和培养的，一般认为可培养的微生物种类只占自然界中微生物种类的约(AmannRLLudwigW，mdSchleiferKH.1995.Phylogeneticidentificationandinsitudetectionofindividualmicrobialcellswithoutcultivation.Microbiol.Rev.59143-169；CardenasE，andTiedjeJM.2008.Newtoolsfordiscoveringandcharacteriζingmicrobialdiversity.Curr.Opin.Biotech.19:544_549)，剩余的约99%的不可培养的微生物中蕴藏着大量的基因资源。近年来从环境样品未培养微生物中提取基因组DNA然后构建混合基因组DNA文库以分离基因已是成熟技术(LorenzP，andEckJ.2005.Metagenomicsandindustrialapplications.Nat.Rev.Microbiol.3:510_516·)。宏基因组学方法已经被广泛地应用到从各种环境样品的未培养微生物中挖掘新的具有生物催化活性的酶的基因，现在已经从未培养微生物中鉴定了很多新酶的基因，包括编码一些新家族的水解酶类的基因，说明宏基因组学方法是得到新基因的好方法。反刍动物的瘤胃是自然界中纤维素降解最剧烈的主要场所之一，植物的纤维素类物质是被瘤胃中共生的纤维素降解微生物降解的。瘤胃微生物包括有真菌、细菌、原生动物和古细菌。目前研究认为瘤胃中有85%的微生物是未培养的(KrauseD0，DenmanSE，MackieRI,MorrisonΜ,RaeAL,AttwoodGΤ,andMcSweeneyCS.2003.Opportunitiestoimprovefiberdegradationintherumen:microbiology，ecology,andgenomics.FEMSMicrobiolRev27:663_693)，可以推测这些未培养微生物中一定含有大量的新基因资源。专利“内切葡聚糖酶及其编码基因与应用”(专利申请号“200810056691.1)中提到了umcel5B基因和Umcel5B蛋白，Umcel5B蛋白如序列表的序列3所示，umcel5B基因的开放阅读框如序列表的序列4自5’末端第91至1704位核苷酸所示。
发明内容本发明的目的是提供一种具有多种多糖结合能力的多肽。本发明所提供的多肽，名称为CBMUmrel5B，来源于水牛瘤胃未培养细菌，是内切葡聚糖酶(GenBank索引号ACA61140)的羧基末端的未知功能域。多肽CBMUm。el5B是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多糖结合能力的的由序列1衍生的多肽。为了使(a)中的CBMudito15b便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列上述(b)中的081^。6_可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的CBMUm。el5B的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。5序列表中的序列1由189个氨基酸残基组成。编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。所述基因具体可为是如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中的序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有多糖结合能力的多肽的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码具有多糖结合能力的多肽的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC,0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。序列表中的序列2由567个脱氧核苷酸组成。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。所述重组表达载体具体可为在pET_30a(+)的多克隆位点之间插入所述基因得到的重组质粒。所述重组菌具体可为将将所述重组表达载体导入E.coliRosetta(DE3)得到的重组菌。本发明还保护所述多肽在结合多糖中的应用。所述多糖可为可溶性多糖或不溶性多糖。所述不溶性多糖具体可为结晶纤维素、酸膨胀的纤维素、几丁质、地衣多糖、来源于甘蔗渣的木聚糖、甘蔗渣粉末、木薯生淀粉、琼脂糖或S印hadex-G100。所述可溶性多糖具体可为甲基纤维素、羟乙基纤维素、大麦葡聚糖、桦树木聚糖或羧甲基纤维素。所述多肽或所述基因可用于提高序列3自氨基末端第19至348位氨基酸残基所示的多肽的PH稳定性和温度稳定性。所述多肽或所述基因可用于提高序列3自氨基末端第19至348位氨基酸残基所示的多肽对不溶性多糖的降解能力。所述不溶性多糖具体可为地衣多糖、桦树木聚糖或酸膨胀的纤维素。所述多肽可用作多肽的吸附剂。本发明在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达CBMUm。el5BDNA序列、纯化表达产物CBMUmrel5B多肽并检测该多肽对多糖的结合，发现该多肽可以结合广泛的底物，包括人工底物结晶纤维素、非结晶纤维素、几丁质、β_1，3-1，4-葡聚糖和木聚糖，对天然底物如甘蔗渣粉末、木薯生淀粉也具有结合功能，证明该多肽是一个新的碳水化合物结合组件。通过对rUmcel5B(含有糖基水解酶家族5的催化结构域rGHF5和碳水化合物结合组件CBMUmrel5B)及其单独的催化结构域rGHF5的研究，发现该碳水化合物结合组件的存在可以提高酶对不可溶颗粒状多糖的水解活性及对PH和温度的稳定性。本发明所提供的碳水化合物结合组件CBMUfflcel5B及其编码DNA序列可广泛应用于多糖的降解及提高酶的稳定性方面。图1为Umce15B蛋白、rUmcel5B、rGHF5与CBMUmcel5B的比较。图2为pET-rUmcel5B、pET_rGHF5和pET-CBM的酶切电泳图谱。图3为rUmce15B酶液、rGHF5酶液和CBMUm。el5B酶液的电泳图。图4为不同pH值条件下酶液的相对酶活力。图5为不同温度条件下酶液的相对酶活力。图6为pH耐受性测定结果。图7为温度耐受性测定结果。图8为CBMUmrel5B对不可溶多糖的结合能力的电泳检测结果。图9为CBMUmrel5B对可溶多糖的结合能力的电泳检测结果。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。限制性内切酶购自TAKARA公司。羧甲基纤维素(Carboxymethylcellulose,CMC)、结晶纤维素(Avicel)、几丁质(Chitin)、地衣多糖(Lichenan)、大麦葡聚糖(barley-glucan)、甲基纤维素(methylcellulose)、羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose)、桦树木聚糖(birchwoodxylan),SephadexG-100、昆布多糖(Iaminarin)等试剂购自SIGMA公司。琼脂糖购自Ameresco公司。酸膨胀的纤维素(Acid-swollencellulose)按照以下方法制备而成①将10克Avicel悬浮在85%的H3PO4水溶液中，1°C搅拌1小时。②将混合物倒入4L冰冷的水中，放置30min。③先用预冷的水洗涤步骤③处理后的Avicel几次，然后用1%的NaHCO3洗涤，再用预冷的水洗涤至酸碱平衡，得到酸膨胀的纤维素。④酸膨胀的纤维素储存在5mMNaN3水溶液中，1°C保存。来源于甘蔗渣的木聚糖按照以下方法制备而成①取IOg甘蔗渣，装入250ml锥形瓶中，加入65ml蒸馏水，0.5ml冰醋酸，0.6g亚氯酸钠，摇勻，封口，置于75°C恒温水浴中加热，经常旋转并摇动锥形瓶。②Ih后加入0.5mL冰醋酸及0.6g亚氯酸钠，继续放回水浴锅加热lh，重复三次。③离心弃上清，用蒸馏水将沉淀(甘蔗渣)洗至中性，60°C真空干燥至恒重。④处理后的甘蔗渣置于10%KOH水溶液中，45°C下振荡抽提20h，离心取上清，加入乙酸将上清PH调至5.0，再离心分离得到沉淀(木聚糖)；⑤将步骤④离心所得的上清液用四倍体积的95%乙醇沉淀，离心分离后得到沉淀(残留的木聚糖)。⑥将步骤④和步骤⑤所得的木聚糖在真空干燥箱中60°C真空干燥72h，得到干燥的木聚糖。实施例1、重组质粒的构建和各个重组蛋白的表达一、各个DNA片段的制备l、rUmcel5B的制备人工合成序列表的序列4自5'末端第145位至1701位核苷酸所示的DNA，命名为rUmcel5B(长度为1557bp)。rUmcel5B编码序列3自氨基末端第19至537位氨基酸残基所示的多肽(由519个氨基酸残基组成)，命名为rUmcel5B。rUmcel5B的预计分子量为58.39332KDa，等电点pi为4.98。2、rGHF5的制备人工合成序列表的序列4自5'末端第145位至1134位核苷酸所示的DNA，命名为rGHF5(长度为990bp)。rGHF5编码序列3自氨基末端第19至348位氨基酸残基所示的多肽(由330个氨基酸残基组成)，命名为rGHF5。rGHF5的预计分子量为37.69215KDa，等电点Pl为5.00。3、CBMUm。el5B的制备人工合成序列表中序列2所示的DNA(序列2所示DNA即为序列4所示DNA自5，末端第1135位至1701位核苷酸所示DNA)，命名为CBMUm。el5B(长度为567bp)。CBMUmcel5B编码序列表中序列1所示的多肽(序列1所示多肽由189个氨基酸残基组成，即为序列3所示多肽自氨基末端第349至537位氨基酸残基)，命名为CBMUmrel5B。CBMUfflcel5B的预计分子量为20.71817KDa，等电点pi为4.95。4、Umcel5B蛋白、rUmcel5B、rGHF5与CBMUmcel5B的比较Umce15B蛋白、rUmcel5B、rGHF5与CBMUm。。15B的比较见图1。Umcel5B包括一个氨基端的信号肽(signalρ印tide，SP)、一个属于糖基水解酶家族5的催化结构域(GHF5)和一个羧基末端未知的功能域⑴；rUmcel5B包括催化结构域GHF5和未知功能域X，rGHF5只含有催化功能域GHF5，CBMUfflcel5B只含有未知功能域X。二、重组质粒的构建和鉴定l、pET_rUmcel5B的构建①以rUmce15B为模板，用引物1和引物2组成的引物对进行PCR扩增，在rUmce15B的上游和下游分别引入NcoI和XhoI酶切位点，得到PCR产物甲。引物1:5，-CAGCCATGGCTAAGGCACAAGATTTTGAGACTGCTACCGAA-3'；引物2:5，-GACCTCGAGTTGTGCTATGTATTTTTTGCCGTTCTGG-3’；引物序列中带下划线的序列为酶切位点。②用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切PCR产物甲，回收酶切产物。③用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切质粒pET_30a(+)(购自Novagen公司)，回收载体骨架。④将步骤②的酶切产物和步骤③的载体骨架连接，得到重组质粒；将重组质粒进行测序验证，结果表明得到了pET-rUmcel5B(骨架为pET_30a(+)，在NcoI和XhoI酶切位点之间插入了rUmcel5B序列)。2、pET_rGHF5的构建①以rGHF5为模板，用引物3和引物4组成的引物对进行PCR扩增，在rGHF5的上游和下游分别引入NcoI和XhoI酶切位点，得到PCR产物乙。引物3:5，-CAGCCATGGCTAAGGCACAAGATTTTGAGACTGCTACCGAA-3'；引物4:5，-GGGCTCGAGGGTTAATGTCTCAGCCAGGTCAGGCTG-3’；弓I物序列中带下划线的序列为酶切位点。②用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切PCR产物乙，回收酶切产物。③用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切质粒pET_30a(+)(购自Novagen公司)，回收载体骨架。④将步骤②的酶切产物和步骤③的载体骨架连接，得到重组质粒；将重组质粒进行测序验证，结果表明得到了pET-rGHF5(骨架为pET_30a(+)，在NcoI和XhoI酶切位点之间插入了rGHF5序列)。3、pET_CBM的构建①以CBMm5b为模板，用引物5和引物6组成的引物对进行PCR扩增，在CBMUm。el5B的上游和下游分别引入NcoI和XhoI酶切位点，得到PCR产物丙。引物5:5，-GGGCCATGGCCAAAGCCTATCATGGCAGCGCGTTC-3'；引物6:5，-GACCTCGAGTTGTGCTATGTATTTTTTGCCGTTCTGG-3’；弓I物序列中带下划线的序列为酶切位点。②用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切PCR产物丙，回收酶切产物。③用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切质粒pET_30a(+)(购自Novagen公司)，回收载体骨架。④将步骤②的酶切产物和步骤③的载体骨架连接，得到重组质粒；将重组质粒进行测序验证，结果表明得到了pET-CBM(骨架为pET-30a(+)，在NcoI和XhoI酶切位点之间插入了CBMUm。el5B序列)。4、重组质粒的鉴定pET-rUmcel5B、pET_rGHF5和pET-CBM的酶切电泳图谱如图2所示。图2中，泳道1为Ikbladder(片段大小从大到小依次为10.Okb,8.Okb,6.Okb,5.Okb,4.Okb，3.5kb,3.Okb,2.5kb,2.Okb,1.5kb,lkb，0.75kb,0.5kb)；泳道2-4依次为pET_rUmcel5B、pET-rGHF5和pET_CBM用NcoI和XhoI双酶切后的酶切产物。三个质粒均具有5.3kb的载体骨架条带。pET-rUmcel5B具有约1.5kb的rUmcel5B条带。pET_rGHF5具有约Ikb的rGHF5条带。pET-CBM具有约600bp的CBMUm。el5B条带。pET-rUmcel5B、pET_rGHF5和pET-CBM中，起始密码子和终止密码子由pET30a(+)提供。表达产物的N端和C端分别有一个由表达载体提供的His标签(6XHisTag)。三、重组蛋白的表达和纯化1、制备重组菌用PET-rUmcel5B转化E.coliRosetta(DE3)(购自Novagen公司)，得到重组菌Rosetta(DE3)/pET-rUmcel5B。用pET_rGHF5转化E.coliRosetta(DE3)，得到重组菌Rosetta(DE3)/pET-rGHF5。用pET-CBM转化E.coliRosetta(DE3)，得到重组菌Rosetta(DE3)/pET-CBM。2、重组蛋白的表达分别培养三种重组菌并诱导重组蛋白表达，得到rUmCel5B粗酶液、rGHF5粗酶液和CBMudito15b粗酶液。具体步骤如下①培养和诱导表达将重组菌接种到IOml含有34μg/ml氯霉素与25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，37°C、200rpm培养过夜；取5ml过夜培养物到IOOml含有34μg/ml氯霉素与25μg/ml卡那霉素的LB培养液中，37°C、200rpm培养至OD6tltl为0.6时，加入IPTG至终浓度为ImM，28°C继续培养5个小时，5000g离心收集菌体。②制备粗酶液将收集的菌体加入平衡/洗涤缓冲液(50mMNaH2PO4,300mMNaCl，pH7.0)，悬浮菌体，置冰上30分钟。用超声波破碎细胞，400w作用40次，每次作用时间10s，每次作用间隔12s。12000g离心20分钟，收集上清(粗酶液)。3、重组蛋白的纯化分别将rUmcel5B粗酶液、rGHF5粗酶液和CBMUm。el5B粗酶液用Clotech公司的TALONMetalAffinityResins试剂盒(方法参照试剂盒说明书)进行纯化，得到rUmcel5B酶液、rGHF5酶液和CBMUm。el5B酶液。纯化步骤如下①将试剂盒中TALON树脂完全悬浮，快速吸取Iml的树脂到一个灭菌的50ml的离心管中，离心(700g，2分钟)沉淀树脂，小心取出上清丢弃。②在树脂中加IOml的平衡/洗涤缓冲液，轻轻混勻，平衡树脂，离心(700g，2分钟)沉淀树脂，取出上清丢弃。③重复步骤②。④将粗酶液加入树脂中，在室温轻轻摇动20分钟，使带有多组氨酸标签的目标蛋白和树脂结合，然后离心(700g，5分钟)。⑤仔细取出上清，尽可能不搅动树脂，再加入20ml平衡/洗涤缓冲液于树脂中，轻轻搅动混勻，在室温摇动10分钟后，离心(700g，5分钟)，取出上清丢弃。⑥重复步骤⑤。⑦加Iml的平衡/洗涤缓冲液于树脂中，悬浮树脂，将树脂混合液转移到2ml的柱子中(加底盖)，静置让树脂沉淀下来。去掉底盖，让缓冲液流出来，确定在树脂中没有气泡。⑧用2ml的平衡/洗涤缓冲液洗3次。⑨力卩5ml的洗脱液(50mMNaH2PO4,300mMNaCl，150mM咪唑，ρΗ7·0)到柱子中，分管(500μ1/管)收集洗脱液(酶液)。rUmcel5B酶液、rGHF5酶液和CBMUmcel5B酶液的电泳图见图3。图3中1为蛋白质分子量标准(marker)；2为TALON树脂纯化的rUmcel5B；3为TALON树脂纯化的rGHF5；4为TALON树脂纯化的CBMUm。el5B。经TALON树脂纯化后重组蛋白均已达到SDS-PAGE单条带纯。实施例2、rUmcel5B和rGHF5的酶学特性的研究一、内切葡聚糖酶的酶活测定方法(DNS法)1、配制DNS试剂①称取10克NaOH用400mlddH20溶解；②称取10克二硝基水杨酸、2克苯酚、0.5克无水亚硫酸钠、200克四水酒石酸钾钠，将其溶解于300mlddH20中；③两种溶液混合，定容到1升，避光保存。2、葡萄糖标准曲线的绘制取9只薄壁试管，按表2配制标准品。混勻后在沸水中反应5分钟，室温冷却，用酶标仪测A5300表2葡萄糖标准品的配方3、酶活测定酶活(IU)定义为1U为每分钟催化产生相当于Ιμπιο葡萄糖还原糖所需的酶So比活力的定义每mg蛋白质所含的酶活力(IU/mg)。取10μ1待测样品液，加入200μ1含1%CMC(羧甲基纤维素)的0.IM柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，反应10分钟，反应结束后加入ImlDNS试剂和290μ1双蒸水，置于沸水中水浴5分钟，室温冷却，用酶标仪测A5300对照标准曲线得到待测样品液的酶活力，根据样品样的酶活力和样品液的蛋白含量，计算得到蛋白的比活力。二、最适ρΗ值的测定分别测定实施例1中得到的rUmcel5B酶液(浓度为0.125mg/ml)和rGHF5酶液(0.145mg/ml)在不同ρΗ的缓冲液(ρΗ范围为37.5；梯度为0.5)中，39°C反应温度下的酶活(采用步骤一的方法)。在39°C的反应条件下，rUmcel5B酶液和rGHF5酶液都在ρΗ5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中的比活力最高。以最高比活力为100%，分别换算两种酶液各PH值下的相对酶活力。结果见图4。rUmcel5B酶液和rGHF5酶液的最适ρΗ都为5.0。三、最适温度的测定分别测定实施例1中得到的rUmcel5B酶液(浓度为0.125mg/ml)和rGHF5酶液(0.145mg/ml)在ρΗ5·0缓冲液中，不同反应温度(15°C70°C；梯度为5°C)下的酶活(采用步骤一的方法)。在ρΗ值为5.0的缓冲液中，rUmcel5B酶液在50°C时比活力最高，rGHF5酶液在35°C时比活力最高。以最高比活力为100%，分别换算两种酶液各温度下的相对酶活力，结果见图5。rUmcel5B酶液和rGHF5酶液的最适温度分别为50°C和35°C。四、ρΗ耐受性测定将实施例1中得到的rUmcel5B酶液保存于不同ρΗ值(ρΗ2·5-12.0，梯度为0.5；ρΗ2.5-7.0为0.IM柠檬酸-0.2Μ磷酸氢二钠缓冲液；ρΗ7.5-8.5为Tris-Cl缓冲液；PH9.0-12.0为甘氨酸-NaOH缓冲液)，4°C放置24小时，然后测定在pH5.0缓冲液中50°C反应条件下的酶活(采用步骤一的方法)。将实施例1中得到的rGHF5酶液保存于不同pH值(pH2.5-12.0，梯度为0.5；PH2.5-7.0为0.IM柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液；pH7.5-8.5为Tris-Cl缓冲液；PH9.0-12.0为甘氨酸-NaOH缓冲液)，4°C放置24小时，然后测定在pH5.0缓冲液中35°C反应条件下的酶活(采用步骤一的方法)。以最高比活力为100%，分别换算各酶液在各pH值保存后的相对酶活力，结果见图6。rUmcel5B酶液在pH4.010.5之间保持24小时后仍具有80%以上的活力，这说明该酶具有好的PH耐受性，rGHF5酶液在pH5.09.5之间保持24小时后仍具有80%以上活力。说明缺失了未知功能域X(CBMUmrel5B)的单独催化功能域对pH的稳定性下降。五、酶的温度耐受性测定将实施例1中得到的rUmcel5B酶液保存于pH5.0的0.IM柠檬酸_0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，不同温度下(15°C70°C，梯度为5°C)放置1小时，然后测定在pH5.0缓冲液中50°C反应条件下的酶活(采用步骤一的方法)。将实施例1中纯化得到的rGHF5酶液保存于pH5.0的0.IM柠檬酸_0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，不同温度下(15°C70°C，梯度为5°C)放置1小时，然后测定在pH5.0缓冲液中35°C反应条件下的酶活(采用步骤一的方法)。以步骤三中的最高比活力为100%，分别换算各酶液在各温度保存后的相对酶活力，结果见图7。55°C以下，rUmcel5B酶液都能保持80%以上的相对活方，rGHF5酶液只能在45°C以下保持80%以上的相对活力。说明缺失了未知功能域X(CBMUm。el5B)的单独的催化功能域对温度的稳定性下降。六、底物特异性采用步骤一的方法检测实施例1中得到的rUmcel5B酶液在pH值5.0缓冲液中50°C反应条件下的酶活；检测实施例1中得到的rUmcel5B酶液在pH值5.0缓冲液中50°C反应条件下对于不用底物的酶活分别用等质量的其它多糖(结晶纤维素、桦树木聚糖、地衣多糖、酸膨胀的纤维素、甲基纤维素或羟乙基纤维素)替换CMC(羧甲基纤维素)，反应时间及酶量根据酶对不同底物的活性高低而改变，对桦树木聚糖和酸膨胀的纤维素的作用时间为30分钟，对地衣多糖、羟乙基纤维素和羧甲基纤维素的作用时间为5分钟，对甲基纤维素的作用时间为10分钟，对结晶纤维素的作用时间为2小时。采用步骤一的方法检测实施例1中得到的rGHF5酶液在pH值5.0缓冲液中35°C反应条件下的酶活；检测实施例1中得到的rGHF5酶液在pH值5.0缓冲液中35°C反应条件下对于不用底物的酶活反应体系中，分别用等质量的其它多糖(结晶纤维素、桦树木聚糖、地衣多糖、酸膨胀的纤维素、甲基纤维素或羟乙基纤维素)替换CMC(羧甲基纤维素)，反应时间及酶量根据酶对不同底物的活性高低而改变，对桦树木聚糖和酸膨胀的纤维素的作用时间为30分钟，对地衣多糖、羟乙基纤维素和羧甲基纤维素的作用时间为5分钟，对甲基纤维素的作用时间为10分钟，对结晶纤维素的作用时间为2小时。结果见表3。表3rUmcel5B和rGHF5对不同底物的比活力rUmcel5B对不可溶的颗粒底物如地衣多糖、桦树木聚糖和酸膨胀的纤维素的活性是rGHF5的3倍，而对可溶底物的活性基本一致。说明缺失未知功能域X(CBMUmrel5B)的rGHF5对不可溶多糖的活性下降，所以该未知功能域X(CBMUmrel5B)具有提高酶对不可溶底物的活性的应用潜力。实施例3、rUmcel5B、rGHF5和CBMUm。el5B对多糖的吸附用实施例1制备的rUmcel5B酶液、rGHF5酶液和CBMUm。el5B酶液或各个酶液冻干得到的蛋白进行实验。一、rUmcel5B和rGHF5对结晶纤维素的结合1、结晶纤维素浓度和混合时间对结合的影响①分别取20μgrUmcel5B(或rGHF5)加入200μ1含不同浓度的结晶纤维素的ΡΗ5.0的0.IM柠檬酸-0.2Μ磷酸氢二钠缓冲液中(结晶纤维素质量百分含量为0%，1%、2%、4%或8%)，置于冰上1小时或5小时(每隔15分钟轻轻震荡混勻)；②IOOOOg离心10分钟，小心将上清液移取到一个新的EP管；③每个处理分别取10μ1上清液在pH5.0缓冲液中最适反应温度(rUmcel5B为500C；rGHF5为35°C)下测定酶活(方法同实施例2的步骤一)。结晶纤维素质量百分含量为0%为对照，目的是防止酶在测试条件下的沉淀反应。对照的酶活代表多肽(rUmcel5B或rGHF5)总量，上清液的酶活力代表未结合到结晶纤维素的多肽，对照的酶活减去上清液的酶活代表结合到结晶纤维素的多肽。根据上清的酶活和对照的酶活可以确定在各个浓度的结晶纤维素条件下，与结晶纤维素结合的多肽占总多肽的比例。结果见表4。表4不同结晶纤维素浓度条件下结合多肽占总多肽的比例(rUmcel5B)rUmcel5B能够与结晶纤维素结合，它的结合能力与结晶纤维素的浓度和混合的时间成正比，结晶纤维素浓度越高及混合时间越长，结晶纤维素结合的越多；在结晶纤维素浓度4%以上、混合时间为5小时时，90%以上的多肽都已结合到结晶纤维素上。相反rGHF5在所有条件下都不能结合到Avicel上。这说明rUmcel5B含有一个碳水化合物结合组件，而且该碳水化合物结合组件位于rUmcel5B的羧基末端。2、pH对rUmcel5B与结晶纤维素结合的影响①取20μgrUmcel5B加入200μ1含4%结晶纤维素的不同pH值(4.0、5.0、6.0或7.0)的0.IM柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，置于冰上5小时(每隔15分钟轻轻震荡混勻)；②10000g离心10分钟，小心将上清液移取到一个新的EP管；③每个处理分别取10μ1上清液在pH5.0缓冲液中50°C反应温度下测定酶活(方法同实施例2的步骤一)。结果见表5。表5不同pH条件下结合多肽占总多肽的比例(rUmcel5B)rUmcel5B在pH5.0的时候与结晶纤维素结合达到90%以上，而反应pH的降低和升高都会影响到rUmcel5B与结晶纤维素的结合。3、小牛血清蛋白(BSA)对rUmcel5B与结晶纤维素结合的影响①取20ygrUmcel5B加入200μ1含4%结晶纤维素和小牛血清蛋白(0.08%或0.01%)的ΡΗ5.0的0.IM柠檬酸-0.2Μ磷酸氢二钠缓冲液中，置于冰上5小时(每隔15分钟轻轻震荡混勻)；②IOOOOg离心10分钟，小心将上清液移取到一个新的EP管；③每个处理分别取10μ1上清液在ρΗ5.0缓冲液中50°C反应温度下测定酶活(方法同实施例2的步骤一)。结果见表6。表6不同浓度BSA条件下结合多肽占总多肽的比例(rUmcel5B)0.08%和0.01%的小牛血清蛋白只能较轻微的影响到rUmcel5B与结晶纤维素结合；即使溶液中含有0.08%小牛血清蛋白(小牛血清蛋白与rUmCel5B的分子比为131)，还有大概80%的rUmcel5B与结晶纤维素结合，这说明rUmcel5B与结晶纤维素的结合是特异性的结合，而不是随机的结合。二、CBMUmcel5B对多糖的结合1、CBMUm。el5B对不可溶多糖的结合分别检测CBMUmrel5B对如下几种不溶性多糖的结合能力结晶纤维素、酸膨胀的纤维素、几丁质、地衣多糖、琼脂糖、SephadexG-100、来源于甘蔗渣的木聚糖、甘蔗渣粉末和木薯生淀粉。①取30μgCBMUm。el5B加入200μ1含4%不溶性多糖的pH5.0的0.IM柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中，置于冰上5小时(每隔15分钟轻轻震荡混勻)；②IOOOOg离心10分钟；③小心将步骤②离心得到的上清液移取到一个新的EP管(此部分为未与底物结合部分)；④将步骤②离心得到的沉淀加入ImlpH5.0的0.IM柠檬酸_0.2M磷酸氢二钠缓冲液，混勻，IOOOOg离心10分钟，弃上清；⑤重复步骤④一次；⑥向步骤⑤得到的沉淀中加入100μ1含2%SDS水溶液，混勻后37°C水浴30分钟，IOOOOg离心10分钟，取上清液到一个新的EP管(此部分为与底物结合的蛋白部分)。分别将步骤③得到的上清液和步骤⑥得到的上清液进行SDS-PAGE，结果见图8。在图8中，M为标准分子量的蛋白质；A组为结晶纤维素；B组为酸膨胀的纤维素；C组为几丁质；D组为地衣多糖；E组为琼脂糖；F组为S印hadexG-100；G组为来源于甘蔗渣的木聚糖；H组为甘蔗渣粉末；I组为木薯生淀粉；1为结合部分蛋白；2为不结合部分的蛋白；CK为未加入多糖的对照的总蛋白。CBMUmrel5B对广泛的不可溶多糖都具有结合能力，其中对结晶纤维素、酸膨胀的纤维素、几丁质、地衣多糖、来源于甘蔗渣的木聚糖、甘蔗渣粉末和木薯生淀粉都有较强的结合能力，对琼脂糖和S^hadex-GlOO也有比较微弱的结合能力。2、CBMUfflcel5B对可溶多糖的结合分别检测CBMUm。el5B对如下几种可溶多糖的结合能力羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、大麦葡聚糖、甲基纤维素、桦树木聚糖、昆布多糖(Iaminarin)和可溶的淀粉。通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)测试CBMUm。el5B对7种可溶多糖的结合能力。所有溶液中不加入SDS，浓缩胶和分离胶分别含5%和10%的丙烯酰胺，分离胶和浓缩胶中都加入终浓度为0.的可溶多糖，其它同普通电泳；同时做另一块未添加多糖的胶作为对照。取7.5μg的CBMUfflcel5B(或小牛血清蛋白，阴性对照)，4°C电泳3小时。电泳结果见图9。图9，M为对照小牛血清蛋白(BSA)；CBM为CBMUm。el5B;a为不含有任何多糖的天然胶；b为天然胶中添加了甲基纤维素；c为天然胶中加入了羟乙基纤维素；d为天然胶中加入了大麦葡聚糖；e为天然胶中加入了桦树木聚糖；f为天然胶中加入了羧甲基纤维素；g为天然胶中加入了昆布多糖；h为在天然胶中加入了可溶性淀粉。对照小牛血清蛋白在含多糖和未含多糖的胶中电泳距离没有什么变化，而CBMUm。el5B在含有甲基纤维素、羟乙基纤维素和大麦葡聚糖的自然胶中电泳距离相比于未添加多糖的对照胶中明显滞后很多，说明CBMUmrel5B对该三种可溶多糖具有强的吸附作用，同时也可以看到CBMudito15b对桦树木聚糖和羧甲基纤维素有较弱的结合，然而对昆布多糖和可溶的淀粉无吸附功能。权利要求一种多肽，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多糖结合能力的的由序列1衍生的多肽。2.编码权利要求1所述多肽的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中的序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有多糖结合能力的多肽的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码具有多糖结合能力的多肽的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为在pET-30a(+)的多克隆位点之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为将权利要求5所述重组表达载体导入E.coliRosetta(DE3)得到的重组菌。7.权利要求1所述多肽在结合多糖中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述多糖为可溶性多糖或不溶性多糖；所述不溶性多糖为结晶纤维素、酸膨胀的纤维素、几丁质、地衣多糖、来源于甘蔗渣的木聚糖、甘蔗渣粉末、木薯生淀粉、琼脂糖或S印hadex-GlOO;所述可溶性多糖为甲基纤维素、羟乙基纤维素、大麦葡聚糖、桦树木聚糖或羧甲基纤维素。9.权利要求1所述多肽或权利要求2或3所述基因在提高序列3自氨基末端第19至348位氨基酸残基所示的多肽的PH稳定性和温度稳定性中的应用。10.权利要求1所述多肽或权利要求2或3所述基因在提高序列3自氨基末端第19至348位氨基酸残基所示的多肽对不溶性多糖的降解能力中的应用；所述不溶性多糖为地衣多糖、桦树木聚糖或酸膨胀的纤维素。全文摘要本发明公开了一种具有多糖结合能力的多肽。本发明提供的多肽(CBMUmcel5B)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有多糖结合能力的由序列1衍生的多肽。本发明所提供的CBMUmcel5B及其编码DNA序列可广泛应用于多糖的降解及提高酶的稳定性方面。文档编号C12N9/42GK101892209SQ20101020652公开日2010年11月24日申请日期2010年6月12日优先权日2010年6月12日发明者冯家勋,刘君梁,吴茜,唐纪良,段承杰申请人:广西大学