一种用于同时检测两型包虫病的引物及试剂盒的制作方法

本发明涉及一种引物和试剂盒，具体涉及一种用于同时检测两型包虫病的引物及试剂盒。

背景技术：

包虫病是由棘球属内多个虫种感染引起的，严重危害人体健康、造成巨大社会经济负担的重大人兽共患传染病。包虫病主要分为囊型和泡型两种，前者分布范围极广，全球患者疾病负担达到1,009,662万个dalys(伤残调整寿命年)，每年造成我国直接经济损失逾30亿元；后者又被称作“虫癌”，可导致肝癌样病变，致死率极高，十年不治疗死亡率达到94％。中国是全世界包虫病流行最严重的国家之一，现有患病推算人数达到11.5万，每年患病家畜超过5000万头，造成的人畜经济损失约占全球的40％，位居全球首位。包虫病广泛分布于我国西北部少数民族地区，涉及除西藏外9省350个流行县，受威胁人口超过5000万人，是流行区人民因病致贫、因病返贫的重要原因。

包虫病等重点寄生虫病的防治是保障人民群众身体健康、全面推进健康中国建设的重要环节之一。棘球绦虫是人畜包虫病的病原体，由9个虫种组成，其中4个虫种在我国存在不同程度的流行，但只有其中3种——引起囊型包虫病的狭义细粒棘球绦虫(echinococcusgranulosussensustrict)和加拿大棘球绦虫(echinococcuscanadensis)，以及导致泡型包虫病的多房棘球绦虫(echinococcusmultilocularis)对人体具有致病性，是当前我国包虫病防治和研究的主要对象。由于两型包虫病治疗原则、药物疗效显著不同，三个虫种生活史、传播特征具有明显差异，因此，两型包虫病的准确诊断和鉴别作为包虫病有效治疗、科学防控的基础，显得极为重要。

目前，包虫病的诊断主要依靠于b超、ct等影像技术和病理检查，因方法自身限制，易造成小病灶、非典型病灶的误诊、漏诊和分型困难，尤其是对于包虫病主要流行的民族偏远地区，由于以上诊断技术水平的普遍偏低，更易出现误诊等问题；对于包虫病低流行区或非流行区，由于接触病例较少，缺乏相关经验，即便在一些三甲医院，同样存在错误诊断或分型的情况。血清学检测是另一项目前采用较多的包虫病诊断方法，但现有的检测试剂盒假阳性高、交叉污染严重，其检测结果仅能作为辅助依据供以参考。目前，针对包虫病的诊断方法，除了准确性不足，难以保证治疗的及时性和效果以外，更重要的是，现有用于包虫病的检查手段均不能实现虫种水平的鉴别，换言之，无法根据患者感染虫种的变化判断环境中虫种传播的消长情况，从而及时调整防控策略。鉴于以上原因，迫切需要研究建立一种准确、可实现结果标准化判断、可进行种间鉴别的检测方法，以满足包虫病防治的工作需求。

pcr技术因其快速、准确、灵敏等特点，目前越来越多地被运用于各类寄生虫疾病的诊断、检测中，并取得了较好的应用效果，如疟疾、弓形虫等均已建立了pcr检测方法，并于防治工作中广泛推广应用，表明了pcr技术在寄生虫疾病的诊断领域中发挥着越来越重要的作用。作为目前唯一能进行包虫病感染虫种鉴别的方法，pcr技术可实现对人体和各种中间、终末动物宿主的感染检测，是目前包虫病诊断、鉴别的发展方向和研究热点。然而，现有的针对棘球绦虫的pcr检测方法以单管扩增为主，一对引物通过单次反应只能检测对应的一种棘球绦虫，或采用测序鉴别，对于存在多个虫种混合流行的地区，方法过程繁琐、耗时耗材，不能满足快速诊断和大规模调查的需求。根据公开报道和数据资料显示，目前尚无可用于同时检测细粒、多房和加拿大棘球绦虫的多重pcr引物对，而仅查见有针对其它虫种的多重pcr扩增方法，不适用于我国当前棘球绦虫流行现状下的防治工作。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供一种用于同时检测两型包虫病的引物以及包含该引物的试剂盒，以达到快速、准确诊断和鉴别包虫病的目的。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种用于同时检测两型包虫病的引物，引物包括三对特异性引物对，其中：

引物对1：序列见seqidno.1和seqidno.2；

引物对2：序列见seqidno.3和seqidno.4；

引物对3：序列见seqidno.5和seqidno.6。

本发明还基于该引物构建了一种试剂盒，得到的引物以冻干粉或溶于缓冲溶液中的形式存在于试剂盒中。

本发明的试剂盒中除了引物外，试剂盒内还包括含有taqdna聚合酶、dntps、mgcl2、反应缓冲液、凝胶上样燃料的2×taqpcr扩增试剂和无核酸酶水。

本发明的有益效果是：

1.通过使用本发明提供的引物及试剂盒，可对我国现有流行的所有三种对人体具有感染性的棘球绦虫种进行检测鉴别，同时不会对其它非目标生物或区域进行扩增，方法特异性佳、灵敏度高，且结果判断准确、易于标准化，有效克服了现有包虫病诊断方法准确性不足、无法实现种水平鉴别的缺陷，避免了当前包虫病诊断方法因人员专业水平差异而导致的误诊、漏诊和难以分型。

2.使用本发明提供的引物及试剂盒可通过单管多重pcr反应，检测我国目前已发现流行的所有3种对人体具有致病性的细粒、多房和加拿大棘球绦虫，对单重和混合感染进行同时鉴别，有效缩短了实验时间，方法操作高效、简便、经济、快捷，适用于我国棘球绦虫流行现状下包虫病的快速诊断和精准防控。

附图说明

图1为3对特异性检测引物对分别对三种目的棘球绦虫单独或混合dna模板进行特异性扩增的pcr结果电泳图；

图2为3对特异性检测引物对分别对三种目的棘球绦虫和七种亲缘性较近的非目的虫种dna模板进行特异性检测的pcr结果电泳图；

图3为3对引物分别对不同浓度的三种棘球绦虫dna模板进行灵敏度检测的pcr结果电泳图；

图4为3对引物对以人体、牲畜、小型哺乳动物病灶样本作为dna模板分别在不同时间进行三次重复实验的pcr结果电泳图。

具体实施方式

本发明为实现通过单管pcr扩增即可对三个棘球绦虫种单独或混合感染引起的两型包虫病进行诊断鉴别的目的，开发出一种试剂盒，试剂盒中包含三种特异性引物，可通过单管一次扩增同时对狭义细粒棘球绦虫、加拿大棘球绦虫和多房棘球绦虫进行检测，能显著提升包虫病的诊断准确性和效率。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例一引物的设计

检索下载genbank上已公布的狭义细粒棘球绦虫(nc_008075.1)、加拿大棘球绦虫(nc_011121.1、ab235848.1、mg597240.1)和多房棘球绦虫(nc_000928.2)线粒体基因参考序列，采用primerpremier6.0、oligo7软件与人工相结合的方式，设计针对以上3个虫种基因的特异性引物，并对引物质量进行评估。经过多轮筛选，最终确定3对引物能够快速、准确、同时对3种棘球绦虫进行检测鉴别，引物序列为：

(1)狭义细粒棘球绦虫

上游引物f1：5’-gtctgtgtttcttaccattg-3’(seqidno.1)

下游引物r1：5’-gacccgtacaaacatatatcaac-3’(seqidno.2)

(2)加拿大棘球绦虫

上游引物f2：5’-gtaagtctaagttggttattattcac-3’(seqidno.3)

下游引物r2：5’-cttattaaacaacacaaaaatactaaatg-3’(seqidno.4)

(3)多房棘球绦虫

上游引物f3：5’-ttgttctttgtgttactgtagga-3’(seqidno.5)

下游引物r3：5’-ctatacagacattgattaccata-3’(seqidno.6)

实施例二多重prc扩增方法的建立

1.待测样本基因组dna的提取

取15～25mg虫体组织或人体、动物感染病灶，根据组织dna提取试剂盒说明书提取样本全基因组dna。

2.扩增体系

采用25μl反应体系，加入2×taqpcr扩增试剂12.5μl，10umf1/r1和f2/r2引物对上下游引物各0.5μl，10umf3/r3引物对上下游引物各1.5μl,无核酸酶水6.5μl，样本模板dna1μl。以无核酸酶水为模板，按照上述方法进行体系配制，作为阴性对照。

3.反应条件

将上述配制好的pcr反应管放入pcr仪中，按以下条件设置反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，40个循环；72℃加长延伸5min。

实施例三pcr反应产物的鉴定

取10μlpcr扩增产物在2％(w/v)的琼脂糖凝胶中以3～5v/cm恒压电泳30～60min，在凝胶成像分析系统中观察结果，以dna分子量标准为参照，根据目的条带的有无和大小，判定是否有感染和感染的棘球绦虫种类。

若扩增产物条带长度为811bp，则判定为狭义细粒棘球绦虫感染阳性，若扩增产物条带长度为315bp，则判定为加拿大棘球绦虫感染阳性，若扩增产物条带长度为457bp，则判定为多房棘球绦虫感染阳性；若扩增产物同时出现以上两种或三种长度条带，则判定为相应两种或三种棘球绦虫混合感染阳性；若扩增产物无条带，则判定为阴性。若阴性对照出现扩增条带，则实验无效。

实施例四特异度的确定

采用本发明中提供的三对引物对和多重pcr扩增方法，采用下列三种方式并按照实施例二～三中的操作，进行多重pcr扩增，检测方法特异度：

(1)分别以细粒、加拿大、多房棘球绦虫的dna为模板进行pcr扩增；

(2)选择细粒、加拿大、多房棘球绦虫中的至少两种，以它们的dna为模板进行pcr扩增；

(3)选择七种我国常见流行的，与细粒、加拿大、多房棘球绦虫亲缘关系较近的其它寄生虫，包括石渠棘球绦虫、牛带绦虫、猪带绦虫、亚洲带绦虫、锯齿状绦虫、巨颈绦虫和长膜壳绦虫，以它们的dna为模板进行pcr扩增。

扩增结果如图1和图2所示。图1为本发明提供的3对特异性检测引物分别对三种目的棘球绦虫单独或混合dna模板进行特异性扩增的pcr结果电泳图，其中：1～3泳道分别为细粒、多房和加拿大棘球绦虫dna模板的pcr扩增结果，4～6泳道分别为细粒和多房棘球绦虫、细粒和加拿大棘球绦虫、多房和加拿大棘球绦虫混合dna的pcr扩增结果，7泳道为细粒、加拿大和多房棘球绦虫混合dna的pcr扩增结果，8泳道为阴性对照，m为dna分子量标准markerii。图2为本发明提供的3对特异性检测引物对分别对三种目的棘球绦虫和七种亲缘性较近的非目的虫种dna模板进行特异性检测的pcr结果电泳图，其中，1～3泳道分别为细粒、多房和加拿大棘球绦虫dna模板的pcr扩增结果，4～10泳道分别为石渠棘球绦虫、猪带绦虫、亚洲带绦虫、牛带绦虫、锯齿状绦虫、巨颈绦虫、长膜壳绦虫dna模板的pcr结果，11泳道为阴性对照，m为dna分子量标准markerii。从图中可以看出：本发明试剂盒中的三对特异性引物对能同时特异性地检测出细粒、加拿大和多房棘球绦虫，细粒和加拿大棘球绦虫、细粒和多房棘球绦虫、加拿大和多房棘球绦虫，以及细粒、加拿大和多房棘球绦虫的混合感染，且只扩增出对应虫种的目的条带，另外，三对引物对与其它7种非目标寄生虫不发生反应，无条带产生；表明发明提供的三对引物能够检测出对应的三种目标棘球绦虫，相互之间无交叉反应，且与其它常见的亲缘性较近的寄生虫之间不发生非特异性反应，具有较好的特异性。

实施例五准确性确认

将实例四中细粒、加拿大和多房棘球绦虫的pcr产物送至生物公司进行双向测序。序列结果上传至ncbi进行blast比对，确认为对应虫种。详细序列信息见序列表seqidno.7～9，其中seqidno.7为狭义细粒棘球绦虫测序结果，seqidno.8为多房棘球绦虫测序结果，seqidno.9为加拿大棘球绦虫测序结果。

实施例六pcr扩增灵敏度的确定

分别以三种目的棘球绦虫dna为模板，用微量紫外分光光度计测定原始模板dna浓度，用dna提取试剂盒洗脱液进行稀释，使pcr体系中模板终浓度分别为0.4ng/μl、0.2ng/μl、0.04ng/μl、0.036ng/μl、0.032ng/μl、0.028ng/μl、0.024ng/μl、0.02ng/μl、0.016ng/μl、0.012ng/μl、0.008ng/μl、0.004ng/μl，按照实施例二～三中的操作，进行多重pcr扩增，检测方法灵敏度。

电泳结果如图3所示，图3为本发明提供的3对引物分别对不同浓度的三种棘球绦虫dna模板进行灵敏度检测的pcr结果电泳图，其中，a为狭义细粒棘球绦虫dna的pcr扩增结果，b为多房棘球绦虫dna的pcr扩增结果，c为加拿大棘球绦虫dna的pcr扩增结果，三种棘球绦虫dna模板的终浓度从泳道1～12分别为0.4ng/μl、0.2ng/μl、0.04ng/μl、0.036ng/μl、0.032ng/μl、0.028ng/μl、0.024ng/μl、0.02ng/μl、0.016ng/μl、0.012ng/μl、0.008ng/μl、0.004ng/μl，13泳道均为阴性对照，m为dna分子量标准markerii。可以看出，本发明所提供的三种目的虫种dna检出限均能达到0.004ng/μl，说明具有较高的灵敏度。

实施例七引物应用和重复性对比

收集4例病人、3份牲畜和3份小型哺乳动物病灶，提取dna，通过测序鉴别感染虫种。以此10份已明确鉴定的dna为模板，按照实施例二～三中的操作，进行多重pcr扩增，并分不同的时间重复三次。

电泳结果如图4所示，其中，图4a-c分别为不同时间采用相同的病人、牲畜和小型哺乳动物共计10份病灶样本作为dna模板的pcr结果电泳图；电泳图中1、2、5、7、8泳道为狭义细粒棘球绦虫dna模板的pcr扩增结果，3、6、9、10泳道为多房棘球绦虫dna模板的pcr扩增结果，4泳道检为加拿大棘球绦虫dna模板的pcr扩增结果，11泳道为阴性对照，m为dna分子量标准markerii。从图中可以看出，本发明所提供引物对的扩增结果与测序结果完全一致，说明该引物对可有效应用于临床和现场样本的检测。不同时间进行的三次重复检测结果均一致，表明有很好的重复性。

实施例八构建试剂盒

本发明中的试剂盒盒体由多个隔断形成，以容纳固定多个如管或小瓶的容器，容器中分别盛装有引物，含有taqdna聚合酶、dntps、mgcl2、反应缓冲液、凝胶上样燃料的2×taqpcr扩增试剂和无核酸酶水等。引物以冻干粉的形式盛装于容器中，或者是将引物对溶于te缓冲液，再盛装于容器中。采用本试剂盒只需加入检测样品，即可进行pcr扩增反应，反应产物可直接上样进行凝胶电泳分析。

虽然结合实施例及附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

<110>四川省疾病预防控制中心

<120>一种用于同时检测两型包虫病的引物及试剂盒

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(狭义细粒棘球绦虫上游引物f1)

<400>1

gtctgtgtttcttaccattg20

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(狭义细粒棘球绦虫下游引物r1)

<400>2

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<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(加拿大棘球绦虫上游引物f2)

<400>3

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<210>4

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(加拿大棘球绦虫下游引物r2)

<400>4

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<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(多房棘球绦虫上游引物f3)

<400>5

ttgttctttgtgttactgtagga23

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<212>dna

<213>人工序列(多房棘球绦虫下游引物r3)

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<210>7

<211>778

<212>dna

<213>细粒棘球绦虫(echinococcusgranulosus)

<400>7

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<213>多房棘球绦虫(echinococcusmultilocularis)

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<213>加拿大棘球绦虫(echinococcosiscanadensis)

<400>10

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