鉴别菲牛蛭的特异性引物对和方法、应用与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴别菲牛蛭的方法和特异性引物对。

背景技术：

水蛭(hirudo)别名马蛭、麻黄蜞、马蟥，属环节动物门蛭纲医蛭形亚目医蛭科。《神农本草经》记载：“水蛭主逐恶血、瘀血，月闭、破血瘕积聚……”，作为中药,迄今已有3000多年的历史。现代中医学认为水蛭属活血化瘀药下属分类的活血调经药，可以抑制血小板的释放、降低血脂、抑制成纤维细胞增殖；用于防治血栓疾病、控制癌症细胞转移与增值等。水蛭的功效与其抗凝血作用密切相关，其中最重要的、疗效最好的抗凝血活性物质是水蛭素(hirudin)，它是迄今为止世界上最有效和最安全的天然凝血酶抑制剂，与胰岛素、青蒿素被称为拯救人类疾病的“世界三素”，具有极高的药用价值。

2015版《药典》规定用于药用的水蛭为水蛭科动物蚂蟥whitmaniapigrawhitman(即宽体金线蛭)、水蛭hirudonippponicawhitman(即日本医蛭)或柳叶蚂蟥whitmaniaacranulatawhitman(即尖细金线蛭)。值得注意的是，世界上的水蛭有500多种，我国有97种，它们分属于不同的目、科和属，在形态结构、取食习性、生活环境以及体内所含生物活性物质的结构和功能方面都是十分不相同的。发明人对我国安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蕲春几个主要中药材市场销售的水蛭以及近十种水蛭中成药的原料作了调查发现，中药水蛭的资源极度紧缺；同时，水蛭的生产和贸易缺乏行业规范，来源混乱，存在着严重的相似品种水蛭品种混淆用药问题。不同品种、疗效有差异的水蛭品种混用影响水蛭中药材质量，也给临床用药带来极大的安全隐患。为了临床用药安全、准确和有效，针对外形相近的不同中药材品种建立一种有效准确的鉴定方法成为已经成为迫在眉睫的需求。

水蛭的传统鉴定方法是通过性状鉴别、显微鉴别等方法，这些鉴别方法容易受到鉴定人员、药材生长环境、生长年限以及产地加工等诸多影响；并且，目前尚没有一种成熟的理化鉴定方法用于水蛭品种鉴别。而随着分子生物学迅速发展，dna水平上的多样性研究取得突破性进展，以dna条形码技术与基于特异性引物的聚合酶链式反应方法为代表的，用于药用的动植物的分子鉴定技术也日渐完善。肖凌等(水蛭dna鉴定、活性多肽分离及其作用机制的研究，湖北中医药大学，2015年)扩增得到宽体金线蛭、菲牛蛭、日本医蛭、尖细金线蛭、光润金线蛭、棒纹牛蛭、日本山蛭及八目石蛭等8个物种的its2、coⅰ、12srrna、16srrna等基因片断的序列，比较此4个基因片断候选序列种内种间差异；得到12srrna为医用蛭类较为合适的dna条形码序列。cn2014101625452以dna条形码技术鉴定宽体金线蛭，通过对标准目的基因的dna序列测定与比对分析，根据与理论序列的相似性进行判定的物种鉴定技术。但这种方法在检测过程中迟迟没有推广起来，该方法存在着判定标准不严格、实际应用性不强等限制。具体原因主要有以下三个方面：一是过程复杂，耗时费力。dna条形码实验需要经过提取dna、聚合酶链式反应(pcr)，pcr产物电泳验证、委托测序以及测序结果的手工校对、序列拼接、与公开序列进行比对等诸多步骤，不适用于快速、高通量的应用检测。二是，结果稳定性较差，序列测定步骤复杂，测序反应的结果收到样品前处理与反应条件的影响而质量不一，影响物种判定结论。三是，.缺乏明确的判定标准，通常如果目标基因与所述理论基因序列seqidno.1的同源性在99％以上，即可判断待测样品的物种。但是，根据基因不同，待测物种不同，序列在物种间的变异程度是不相同的。因此，缺乏一个稳定、准确、清晰的同源性标准进行判定。

菲牛蛭是并未列入药典中规定的医用水蛭品种。但由于个体较大、易于饲养而被大量人工养殖，成为主要的医用水蛭混淆品。目前还没有特异性方法鉴别菲牛蛭。因此，需要建立一种快速、准确、分辨率高、易于操作的菲牛蛭鉴定方法以弥补鉴定领域空白与现有技术的复杂费时、准确度不高的不足。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种鉴别菲牛蛭的方法和特异性引物对，有效得将菲牛蛭与其他水蛭样品进行区分，快速、简便。

本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：

本发明首先提供一种用于鉴别菲牛蛭的特异性引物对，可由引物fn-5’和引物fn-3’组成，所述引物fn-5’和所述引物fn-3’均为单链dna分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1(5’-gtaattagaatcgtaatagctc-3’)和序列2(5’-cataattgaatatacatttacagcagaa-3’)。

上述用于鉴定菲牛蛭的特异性引物对中，所述引物fn-5’和所述引物fn-3’的摩尔比可为1:1。

上述用于鉴定菲牛蛭的特异性引物对的应用，为如下a)-f)中任一种：

a)制备用于检测或辅助检测菲牛蛭的试剂盒；

b)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有菲牛蛭；

c)制备用于鉴定或辅助鉴定菲牛蛭的试剂盒；

d)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为菲牛蛭；

e)制备用于鉴定或辅助鉴定市售菲牛蛭的真伪性的试剂盒；

f)鉴定或辅助鉴定市售菲牛蛭的真伪性。

本发明还提供了用于鉴定菲牛蛭的试剂盒。本发明所提供的用于鉴定菲牛蛭的试剂盒含有上述用于鉴定菲牛蛭的引物对。其中，它还包括taqdna聚合酶、dntp和反应缓冲液。

上述用于鉴定菲牛蛭的试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。上述用于鉴定菲牛蛭的试剂盒的应用可为如下b1)或b2)或b3)：

b1)检测或辅助检测待测样品中是否含有或候选含有菲牛蛭；

b2)鉴定或辅助鉴定待测样品是否为或候选为菲牛蛭；

b3)鉴定或辅助鉴定市售菲牛蛭的真伪性。

本发明还提供了一种检测待测样品是否含有或候选含有菲牛蛭的方法，可包括如下步骤：提取待测样品的总dna作为模板，采用上述用于鉴定菲牛蛭的引物对(或试剂盒)进行pcr扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品中含有或候选含有菲牛蛭；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品中不含有或候选不含有菲牛蛭。

本发明还提供了一种鉴定待测样品是否为或候选为菲牛蛭的方法，可包括如下步骤：提取待测样品的基因组dna作为模板，采用上述用于鉴定菲牛蛭的引物对(或试剂盒)进行pcr扩增，如果能够实现有效扩增，则所述待测样品为或候选为菲牛蛭；如果不能实现有效扩增，则所述待测样品不为或候选不为菲牛蛭。

本发明还提供了一种鉴定市售菲牛蛭的真伪性的方法，可包括如下步骤：提取市售菲牛蛭的基因组dna作为模板，采用上述用于鉴定菲牛蛭的引物对(或试剂盒)进行pcr扩增，如果能够实现有效扩增，则所述市售菲牛蛭为或候选为真品；如果不能实现有效扩增，则所述市售菲牛蛭为或候选为伪品。

上述任一所述方法中，所述“能够实现有效扩增”为pcr扩增产物中含有300-400bp的dna片段；所述“不能实现有效扩增”为pcr扩增产物中不含有300-400bp的dna片段。其中，所述300-400bp的dna片段可为333bp的dna片段，如序列表中序列3所示(gtaattagaatcgtaatagctcttttagctatagcattttatactttattagagcgaaaattattgggatatatacaattgcgtaaaggacctaataaagtaatattgctaggtttaccacaacctatagctgatgctataaaattatttttaaaagaacaaccttatttaatttattctaataagatgtattttatttatggtccactattaagacttagattatcattattattatggataatttatccttttaataatcctagatggtgattttcatttagattagtatattttttatgcatttctgctgtaaatgtatattcaattatg)。

上述方法中，进行所述pcr扩增时，采用的退火温度具体可为55℃。

上述方法中，进行所述pcr扩增时，采用的扩增程序具体可为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；35～38个循环；72℃延伸5min。

上述方法中，进行所述pcr扩增时，所述pcr扩增的体系可为：总体积为20μl时，sybrpremixextaqii10μl，fn-5’上游引物0.8μm，fn-3’下游引物0.8μm，模板10-30ng，灭菌蒸馏水补齐20μl。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

首先，本发明涉及引物对特异性良好，fn-5’(上游引物)与fn-3’(下游引物)均选择了多于两位连续突变的位点作为特异性引物的3’端产生连续两位错配，极大程度的减弱了特异性引物潜在非特异性的可能；另外设计特异性引物时也充分考虑了反应条件、扩增产物大小方面的兼容性，便于后续将多种特异性引物混合使用。最终实验结果表明利用本发明所述菲牛医蛭特异性引物进行pcr，不与目标以外的dna片段产生非特异性反应，并且其反应条件与其它水蛭特异性引物反应条件相同，便于多个实验同步进行或者混合样品多种组分的同时鉴定。另外，菲牛蛭特异性引物扩增得到的pcr产物大小明确，与其它水蛭的特异性条带可以明显区分。因此，本发明的菲牛蛭特异性引物一次性特异反应就可以将样品中的菲牛蛭成分鉴别出来，而不对其它水蛭品种产生非特异性反应，可以用于快速、准确的鉴别菲牛蛭品种真伪。

再者，本发明还涉及一种高分辨的dna检测方法，结合微芯片电泳(岛津公司，multina)进行直接检测，实现了对水蛭药材的快速检测。相比药典中规定的对pcr扩增产物进行检测的琼脂糖凝胶电泳方法，此方灵敏度好、分辨率高、分析成本低、操作简便，可快速实现中药材品种的鉴别。

附图说明

图1特异性引物考察凝胶图；左侧l：dnamarker，从上至下依次为：500bp、450bp、425bp、400bp、375bp、350bp、325bp、300bp、275bp、250bp、225bp、200bp、175bp、150bp、125bp、100bp、75bp、50bp、25bp；模板：1-宽体金线蛭，2-日本医蛭，3-菲牛蛭，4-水，空白对照。箭头为菲牛蛭特异性条带。

图2为图1中模板3-菲牛蛭相对应的电泳图。

图3为利用多种来源的菲牛蛭考察菲牛蛭特异性引物对的适用性与特异性凝胶图；左侧l：dnamarker，从上至下依次为：500bp、450bp、425bp、400bp、375bp、350bp、325bp、300bp、275bp、250bp、225bp、200bp、175bp、150bp、125bp、100bp、75bp、50bp、25bp；模板：1-4：不同来源的菲牛蛭，5：水，空白对照。箭头为菲牛蛭特异性条带。

图4为图3相对应的电泳图。

图5不同批次市场来源的水蛭多重pcr鉴别电泳图；左侧l：dnamarker，从上至下依次为：500bp、450bp、425bp、400bp、375bp、350bp、325bp、300bp、275bp、250bp、225bp、200bp、175bp、150bp、125bp、100bp、75bp、50bp、25bp；模板：1-8为不同批次的水蛭样品，详见表1；箭头为菲牛蛭特异性条带。引物：含日本医蛭特异性引物对的引物混合物，该引物混合物由kt-5’tatgtattgaaagggtattcaatcg，kt-3’ttaagaatgatcatcagtatatagtg，fn-5’gtaattagaatcgtaatagctc，fn-3’cataattgaatatacatttacagcagaa，ry-5’ccagctatatcattaagtcaat，ry-3’cttaatggagtattttgaatt组成。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

下述实施例中，所涉及主要仪器和试剂如下：微芯片电泳(岛津公司multinnamce-202)，pcr仪(岛津公司)，紫外-分光光度仪(岛津公司biospec-nano)，高速离心机(eppendort5418)；dan聚合酶(sybrpremixextaqii，宝生物rr820)，dna染料(goldnucleicacidgelstain，美国英杰生命技术有限公司s-11494)，微芯片电泳试剂盒(dna-500reagentkitformultina，岛津公司292-27910-91)，dna分子量标准(25bpdnaladder，美国英杰生命技术有限公司10597-011)，基因组dna提取试剂盒(dneasyblood&tissuekit，qiagen69504)。

下述实施例中，所涉及药材样品包括日本医蛭、宽体金线蛭、菲牛蛭以及市面上不同批次的水蛭药材。

实施例1

用于鉴别菲牛蛭的特异性引物对，由引物fn-5’和引物fn-3’组成，所述引物fn-5’和所述引物fn-3’均为单链dna分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1(5’-gtaattagaatcgtaatagctc-3’)和序列2(5’-cataattgaatatacatttacagcagaa-3’)。

采用上述引物对鉴别水蛭样品的方法，步骤如下：

(1)基因组dna提取：水蛭待测样品取30mg，用动物dna提取试剂盒提取总dna。按照dna提取试剂盒说明书进行操作，-4℃保存；dna提取物取1μl，采用紫外-分光光度仪验证dna质量，浓度大于10ng/μl,a260/a280比值为1.7-1.9，a260/a230的比值大于2.0；

本步骤中待测样品分别为来源清晰并经过传统方法验证过品种的宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭标准品，已验证本发明所述引物对的特异性；

(2)pcr扩增体系的建立与反应：pcr反应体系总体积20μl，其中包括sybrpremixextaqii10μl，提取的dna模板1μl(30ng)，引物对fn-5’、fn-3’用量均为0.8μm，无菌双蒸水补充体系至20μl；

pcr反应参数：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；35个循环；72℃延伸5min；4℃保存；

(3)结果检测：pcr扩增反应结束后，取pcr反应产物1μl，微芯片电泳检测，试剂盒选用微芯片电泳500bp试剂盒(dna-500reagentkitformultina)，系统自动生成凝胶图与电泳图。

由图1和图2可知：菲牛蛭理论pcr产物为333bp，待测样品为菲牛蛭时，在333bp处有单一条带，微芯片电泳检测出的片段长度和pcr目标产物一致。而以日本医蛭、宽体金线蛭和水为待测样品时，分别作为模板的扩增产物中300-400bp之间没有条带，证明该引物对可以特异性的鉴别菲牛蛭。

实施例2

反应体系与检测方法参照实施例1，其中dna模板为多种来源菲牛水蛭的基因组dna模板，pcr扩增产物以微芯片电泳仪multina检测。结果由图3,4显示，每种菲牛蛭样品都被成功扩增并被微芯片电泳仪multina检测，，阴性对照(水)没有条带。证明该引物对可以广泛适用于特异性地鉴别菲牛蛭成分。

实施例3

采用上述反应体系和反应参数，其中引物对为混合引物对，宽体金线蛭的引物对kt浓度为0.4μm，日本医蛭的引物对ry浓度为0.2μm，菲牛蛭的引物对fn浓度为0.4μm，再次用8种不同批次的水蛭药材对所建立的pcr鉴别体系进行方法适用性验证，样品信息见表1，其中预期结果为经过传统方法验证过的水蛭品种，具体电泳图见图5。

表1不同批次水蛭样品信息

由图5可知，水蛭的菲牛蛭样本可扩增出333bp的特异性片段，而其他水蛭样品则无法扩增出333bp的特异性片段，证明本发明所述引物对特异性好，适用性强，可对菲牛蛭进行直观、快速、准确的鉴别。

综上，本发明提供的方法，只通过一次pcr扩增即可准确、快速、可靠地从几种易混淆的水蛭品种中鉴别菲牛蛭，而且本发明通过微芯片电泳检测，灵敏度好、分辨率高、分析成本低、操作简便，是中药材和食品品种鉴别有力的分析方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

＜110＞岛津企业管理(中国)有限公司

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