一种优化柴胡皂苷a待测品超声提取工艺的方法与流程

本发明涉及中药药材及样品的超声提取工艺的优化方法，尤其涉及一种优化柴胡皂苷a待测品超声提取工艺的方法。

背景技术：

柴胡是我国的传统中药，原名茈胡、地黛，始载于《神农本草经》，列为上品，至宋代《图经本草》始易名为柴胡。柴胡为伞形科植物柴胡bupleurumchinensedc.或狭叶柴胡bupleurumscorzonerifoliumwilld.的干燥根。按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”，主产于内蒙古、河南、华北、东北、陕西及甘肃等地。柴胡药性辛、苦，微寒，归肝、胆、肺经，具有疏散退热，疏肝解郁，升举阳气等功效。

柴胡皂苷是柴胡的主要化学指标和生物活性成分，柴胡皂苷具有a、b、c、d结构成分，现代研究表明柴胡皂苷中柴胡皂苷a、d的含量与柴胡的解热抗炎功效密切相关，因此所含柴胡皂苷a、d含量的多少常作为柴胡药材质量控制的重要指标。其中以柴胡皂苷a(c42h68o13)是活性最强的柴胡皂苷类成分之一，它除了具有抗炎、抗病毒、保肝的作用，还有降血脂。

为有效控制药材质量，2015版中国药典中也对柴胡中柴胡皂苷的含量做具体的限定，即柴胡药材中含柴胡皂苷a(c42h68o13)和柴胡皂苷d(c42h68o13)的总量不得少于0.30％。柴胡药材的供试样品溶液制备方法为：取精密称定本品粉末(过四号筛)约0.5g，并置具塞锥形瓶中，加入含5％浓氨试液的甲醇溶液25ml，密塞，在30℃水温超声处理(功率200w，频率40khz)30分钟，滤过，用甲醇20ml分2次洗涤容器及药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干。残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

一般，企业或者研究院校对中药材的质量检测要求较高，中药材中有效成分的准确测量，对于科研研发方面的工艺、技术等研究具有很重要的意义；对于企业的中药材的成本及产品的稳定性也有很重要；对于市场上药品的稳定性也有很重要。因此，企业或者研究院校均会在中国药典中柴胡质量检测的基础上做进一步的工艺优化，前有一般通过单因素试验或者正交试验设计对中药材的提取工艺做研究，而使用根据单因素或者正交试验设计优化的提取工艺的进行实验或者生产时，对实验结果或者生产数据的分析是，仍然存在分析结果不准确的问题。

有鉴于此，有必要对现有技术中的柴胡药材中柴胡皂苷a的提取工艺予以改进，以解决上述问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种优化柴胡皂苷a待测品超声提取工艺的方法，本发明通过单因素试验结合box-behnken响应面法对待测样品中的柴胡皂苷a的提取方法进行优化，通过优化后的方法对待测样品中柴胡皂苷a进行提取，经多试样的多次重复提取测定，其测定结果稳定。

实现发明目的的技术方案如下：一种优化柴胡皂苷a待测品超声提取工艺的方法，包括以下步骤：

步骤一：将柴胡药材或供试样品烘干并粗粉，过65目筛，摇匀，得待测样品；

步骤二：对待测样品中柴胡皂苷a的提取进行预试验，得出影响柴胡皂苷a提取率的因素为提取时间、超声功率、料液比；并根据单因素多水平试验，筛选提取时间、超声功率、料液比的参数范围；

步骤三：根据步骤二中各参数的筛选范围，结合响应面法，以提取时间、超声功率、料液比三个因素为考察对象，以柴胡皂苷a提取率为评价指标，设计三因素三水平试验表；

步骤四：根据步骤三中实验设计表设计实验方案，并进行重复实验，得到柴胡皂苷a的响应值；

步骤五：对步骤四中的实验数据进行多元线性回归和二次多元方程拟合并建立回归方程，得到以柴胡皂苷a提取率为响应值的相应曲面图，通过对试验结果分析，得到柴胡中柴胡皂苷a的最佳提取工艺参数。

进一步的，在步骤二中，待测样品的提取时间参数范围为80～120min；超声功率参数范围为175～225w；料液比参数范围为20:1～40:1(ml：g)。

进一步的，在步骤五中，回归方程如下：

其中，其中y表示柴胡皂苷a的含量，x1为提取时间(min)，x2为提取功率(w)，x3为料液比(ml/g)。

进一步的，在步骤五中，对待测样品中柴胡皂苷a提取率影响影响顺序为：料液比＞提取时间＞提取功率。

进一步的，在步骤五中，待测样品的提取时间为114min；超声功率为225w；料液比为40：1。

进一步的，在步骤二中，待测样品中柴胡皂苷a的提取溶剂为5％氨水-甲醇溶液。

与现有技术相比，本发明型的有益效果是：

1.通过单因素多水平结合响应面法确定的柴胡皂苷a的提取工艺参数，经多样品重复试验，柴胡皂苷a的提取率稳定性很好。

2.采用单因素多水平结合响应面法优化柴胡中柴胡皂苷a的超声提取工艺，旨在为进一步开发利用柴胡资源提供一定的理论依据。

3.采用单因素多水结合平响应面法优化柴胡中柴胡皂苷a的超声提取工艺，也为其他中药材中有效成分的提取提供了参考价值。

附图说明

图1为本发明中料液比对柴胡皂苷a提取率的影响；

图2为本发明中提取时间对柴胡皂苷a提取率的影响；

图3为本发明中超声功率对柴胡皂苷a提取率的影响；

图4为本发明中提取时间a和超声功率b对柴胡中柴胡皂苷a提取的3d响应面图；

图5为本发明中提取时间a和料液比c对柴胡中柴胡皂苷a提取的3d响应面图；

图6为本发明中超声功率b和料液比c对柴胡中柴胡皂苷a提取的3d响应面图。

具体实施方式

下面结合附图所示的各实施方式对发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。

在本实施例的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明创造和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明创造的限制。

此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明创造的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明创造中的具体含义。

一、柴胡皂苷a提取工艺优化原理及柴胡皂苷a检测方法

1.1柴胡皂苷a提取工艺优化原理

通过hplc法检测柴胡药材或供试样品中柴胡皂苷a的含量，首先需要将柴胡皂苷a进行提取，即，通过提取溶解通过超声、微波、回流等方法提取。本发明是首先通过预试验确定影响柴胡皂苷a提取率的因素；再通过单因素多水平筛选各因素的参数范围；最后，通过响应面法结合多元线性回归和二次多元方程拟合并建立回归方程确定柴胡皂苷a的最佳提取参数。具体包括以下步骤：

步骤一：取柴胡药材或供试样品烘干并粗粉，过65目筛，摇匀，得待测样品；

步骤二：对待测样品中柴胡皂苷a的提取进行预试验，得出影响柴胡皂苷a提取率的因素为提取时间、超声功率、料液比；并根据单因素多水平试验，筛选提取时间、超声功率、料液比的参数范围；

步骤三：根据步骤二中各参数的筛选范围，结合响应面法，以提取时间、超声功率、料液比三个因素为考察对象，以柴胡皂苷a提取率为评价指标，设计三因素三水平试验表；

步骤四：根据步骤三中实验设计表设计实验方案，并进行重复实验，得到柴胡皂苷a的响应值；

步骤五：对步骤四中的实验数据进行多元线性回归和二次多元方程拟合并建立回归方程，得到以柴胡皂苷a提取率为响应值的相应曲面图，再通过对试验结果分析，得到柴胡中柴胡皂苷a的最佳提取工艺参数。

1.2.柴胡皂苷a检测方法：

1.2.1柴胡皂苷a含量检测的色谱条件为：参照高效液相色谱法(《中国药典》2015版，四部，通则0512项))测定，采用betasilc18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按照下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长：208nm；进样量:10μl；流速：0.8ml/min；柱温：25℃。

1.2.2对照品溶液的制备：

精密称取柴胡皂苷a对照品4.86mg，置10ml容量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为0.486mg/ml的对照品溶液，置于4℃冰箱内保存。

1.2.3柴胡药材或供试样品的制备：

根据本发明优化的柴胡药材或供试样品中柴胡皂苷a的提取参数，精密称定约0.5g的待测样品，置于具塞锥形瓶中，加入提取溶剂进行提取；将提取液放冷并过滤，用分析甲醇洗涤具塞锥形瓶及药渣2～3次；将洗涤液及滤液合并后，回收蒸干得柴胡皂苷a提取物；加适量色谱甲醇溶解并定容至10ml的容量瓶中，摇匀待测。

1.2.4测定：

将对照品及待测样品，经0.22μm有机微孔滤膜过滤后进入高效液色谱相仪进行检测。

二、以下通过实施例1具体阐述柴胡药材或供试样品中柴胡皂苷a提取参数优化方法：

2.1实施例1，如图1～6所示，一种优化柴胡皂苷a待测品超声提取工艺的方法，包括以下步骤：

步骤1.取500g柴胡药材或供试样品烘干并粗粉，过65目筛，摇匀，得待测样品；

步骤2.对待测样品中柴胡皂苷a的提取进行预试验，得出影响柴胡皂苷a提取率的因素为提取时间、超声功率、料液比；进行单因素多水平试验，筛选提取时间、超声功率、料液比的参数范围；

步骤2.1料液比参数范围选择

以6个水平(即10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1)进行料液比单因素试验。称取6份待测样品各0.5g，分别用5、10、15、20、25、30ml的5％氨水-甲醇溶液作为提取溶剂，超声功率250w，提取温度50℃，超声提取时间20min。按“1.2”项下方法测定，计算柴胡皂苷a的提取率，测定结果如表1及图1所示：

表1液料比对柴胡皂苷a提取率的影响

分析：由表1及图1可以看出，在一定范围内，随着液料比增加，提取率增大，当液料比为30:1(ml/g)时最大。当液料比继续增大，提取率反而出现下降。因此柴胡皂苷a提取的液料比参数范围为20:1～40:1(ml：g)。

步骤2.2提取时间参数范围选择

以7个水平(即20min、40min、60min、80min、100min、120min)进行提取时间单因素试验，取7份柴胡粉末各0.5g，用15ml的5％氨水-甲醇溶液作为提取溶剂，分别超声提取20min、40min、60min、80min、100min、120min，超声功率为250w，提取温度为50℃。按“1.2”项下方法测定，计算柴胡皂苷a的提取率，测定结果如表2及图2所示：

表2提取时间对柴胡皂苷a提取率的影响

分析：由表2及图2可以看出，在20～120min内，随着提取时间的延长，柴胡皂苷a的提取率逐渐增大，在100min时达到最大，随着时间的进一步延长，提取率降低。因此，柴胡皂苷a提取的提取时间范围为80～120min。

步骤2.3超声功率参数范围选择

以7个水平(即100w、125w、150w、175w、200w、225w、250w)进行超声功率单因素试验，称取7份柴胡粉末各0.5g，用15ml的5％氨水-甲醇溶液作为提取溶剂，超声功率分别为40％(100w)、50％(125w)、60％(150w)、70％(175w)、80％(200w)、90％(225w)、100％(250w)，超声提取温度50℃，超声提取20min。按“1.2”项下方法测定，计算柴胡皂苷a的提取率，测定结果如表3及图3所示：

表3超声功率对柴胡皂苷a提取率的影响

分析：由表3及图3可以看出，超声功率在200w时达到最大，当超过200w时提取率会有所下降，因此柴胡皂苷a提取的超声功率范围微微175～225w。

步骤3：在单因素多水平试验选择的参数范围的基础上，采用box-behnken响应面法进行再次优化。其中以提取时间(x1)、超声功率(x2)和液料比(x3)为考察对象，以柴胡皂苷a提取量(y，mg/g)为评价指标。响应面试验设计因素水平见表4：

表4响应面法试验设计中的因素水平

步骤4根据表4试验因素水平表，采用designexpert8.0.6软件进行优化，设计实验方案并进行重复实验，结果见下表5：

表5bbd响应面法试验设计方案及响应值

步骤5进行多元线性回归和二次多元方程拟合并建立回归方程，方差分析和显著性检验。

采用designexpert8.0.6软件对表5中的实验数据进行处理，进行多元线性回归和二次多元方程拟合，得到二次回归方程如下：

其中y表示柴胡皂苷a的含量。此回归方程的f值为7.50，平方和为2.02，自由度为9，均方为0.22，其显著水平p<0.01，表明该模型非常显著，不同处理间的差异高度显著。模型确定系数r²＝0.9060，说明此模型与实际试验拟合较良好。失拟项p＝0.6693，p>0.05，表明失拟项相对于净误差是不显著的，说明模型拟合度良好，可用此模型和方程来分析和预测柴胡皂苷a的提取率，方差分析结果如下表6：

表6方差分析结果

注：^*p<0.05，^**p<0.01

由表6方差分析结果可知，回归方程一次项中3个因素对柴胡皂苷a提取率影响的顺序为x3>x1>x2。其中x1、x3影响非常显著，x2影响显著；交互项x2x3对提取率有显著影响；二次项及交互项x1x2、x1x3对提取率均无显著影响。以上分析表明，此实验中各因素对结果的影响大小由高到低分别为液料比、提取时间和超声功率，根据响应方程所绘制的响应曲面图见图4。

从图4可以看出，液料比是影响提取率的最主要的因素。由回归方程可知，一次项x3的系数为0.32，其绝对值也是该方程所有系数中的最大值，说明在3个考察因素中，液料比是影响柴胡皂苷a提取率最大的因素。由时间液固比图可以看出，随着时间的增加，要想增加提取率，就需要减小液料比；随着液料比的增加，要想使提取率提高，就要减少提取时间，由此可以看出这两项间存在抑制作用，与回归方程中x1x3项的系数为负号相符。

通过计算，待测样品中柴胡皂苷a的最佳超声提取工艺条件：提取时间为114min，超声功率为225w，液料比为40:1(ml/g)，柴胡皂苷a的含量为11.33mg/g。

2.2优化条件的模型验证

精密称取柴胡3份，每份约10g，以优化后的工艺参数提取，按“1.2”项下方法测定，柴胡皂苷a的平均提取量为(11.19±0.5)mg/g(n＝3),与预测值11.33mg/g相比，rsd<5％。表明模型预测值与实际值较接近，模型预测良好。

表7验证试验结果(n＝3)

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。