一种春雷霉素的纯化方法与流程

本发明涉及微生物源生物杀菌剂领域，特别涉及一种春雷霉素的纯化方法。

背景技术：

春雷霉素是放线菌产生的代谢产物，属内吸抗生素，兼有治疗和预防作用，纯品为白色针状结晶固体，在常温下稳定，在酸性和中性条件下稳定，在碱性条件下易分解。春雷霉素是防治多种细菌和真菌性病害的理想药剂，有预防、治疗、生长调剂功能。它既是防治稻瘟病的专用抗生素外，还对水稻细条病，柑橘流胶病，砂皮病，猕猴桃溃疡病，辣椒细菌性疮痂病，芹菜早疫病，菜豆昏枯病，菱白胡麻斑病，黄瓜炭疽病、细菌性角斑病、西红柿叶霉病、灰霉病，甘蓝黑腐病、黄瓜枯萎病等有好的防治效果。

在cn201410707264.0《一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法》中也公开了一种发酵培养基及发酵方法，从中可以知道，为了达到工业化规模生产，在大的发酵罐中都需要加入不同类型的表面活性剂和消泡剂等，同时培养基中也含有大量营养物如豆饼粉、豆油、玉米淀粉、淀粉酶等，这些经过微生物代谢，会产生复杂的初级代谢产物如核苷酸类、氨基酸等，也产生水溶性的胞外次级代谢产物目标物春雷霉素和他复杂代谢物色素等。在cn201610504642.4《一种利用春雷霉素发酵液提取盐酸春雷霉素的方法》中公开了一种制备方法其是通过：分两阶段调节ph-5及ph2.5-3,然后再加入聚硅氯化铝钙，静置后通过陶瓷膜过滤和大孔吸附树脂脱色以及纳滤浓缩最后结晶得到固体盐酸春雷霉素，大部分链霉菌发酵都有色素等杂质产生，一些产品由于次级代谢产物调控的差异会产生结构类似物的目标产物同系物，造成产品纯度要求高的情况下需要采取不同的纯化工艺获得高纯度目标物。本领域的技术人员知道，一般微生物发酵产物的复杂性，决定下游提取纯化工艺的不同，在cn201610504642.4陶瓷膜过滤获得含有春雷霉素的发酵清液，在cn201110149011.2《一种春雷霉素原药制备方法》中也公开了传统工艺方法步骤如：

发酵液通过盐酸或者草酸调节ph3-3.5，然后板框或者超滤膜在65-70℃下过滤去除菌丝及部分蛋白质，收集滤液，然后用树脂吸附滤液中的有效成分，除去其他可溶杂质，同时后续用氨水作为洗脱液从树脂上提取出有效成分，再用脱盐树脂脱去铵离子得到较纯净的春雷霉素溶液，后续用真空薄膜蒸发器或纳滤膜进行浓缩至含量6％左右，最后用喷雾干燥或者乙醇结晶制得春雷霉素原药，其公开也指出传统生产工艺纯度虽然高，但收率低只有50-60％左右，该发明人认为适于医用但不适于农用，一些工艺改进去除了树脂纯化和浓缩工序，直接在过滤后处理进行喷雾干燥，由于发酵产物复杂，发酵过程中留下的少量可溶性残糖、氨基酸、蛋白质等杂质，因此，喷雾干燥过程中，上述物质遇热融化变粘，紧贴于干燥塔塔壁上无法排出，造成喷雾干燥过程无法顺利收集原药，不能实现工业规模生产。该发明人对该方法进行过多次实验，实际收率不超过50％；其后该发明人进行改进在对除菌体后的过滤液中加入其他辅料辅助喷雾工艺，提高了产品收率最高到75％，春雷霉素的质量百分比在4％-63.5％之间。

由上背景对比，本发明的技术不同于上述的技术操作，得到的有益效果，产品纯度高，可以为其他医药用途提供低廉高品质原料。产品收率提高，这个工序操作虽然会有部分废水产生，但在整体工业生产中可以经过回收套用等步骤节约用水，产生的废水量不高，使用的工艺都是低能耗的绿色生产工艺技术—膜过滤，溶剂选用亲和性的绿色可再生乙醇。本发明的生产收率和纯度优于传统技术工艺。

技术实现要素：

为了解决背景技术中的技术问题，本发明是这样实现的：

一种春雷霉素的纯化方法，所述的方法包括如下步骤:

1)含有春雷霉素的清液制备：用盐酸将链霉菌发酵液的ph调至3.0～4.0；然后向发酵液中加入高岭土助滤剂搅拌并静置，固液分离过滤得清液；

高岭土助滤剂是一种抗生素发酵领域常规过滤加的助滤剂。菌体有时会粘稠不利于过滤分离，在板框过滤等固液分离时，菌体压缩会挤压在滤布上导致流出液体不通畅。加入高岭土助滤剂可以隔开菌体，有利于固液分离。

本发明与现有技术cn201510196286.x、cn201610504642.4、cn201110149011.2不一样，本发明步骤1)是为了后续操作步骤而选择的前处理方式。高岭土是常规抗生素工业选用的一种无害的天然助滤剂，本方案在调酸后就直接加入高岭土搅拌后静置，所选用的高岭土助滤剂对春雷霉素的吸附性不强，没有特异性，春雷霉素损失少。本操作还具有快速、连续的特点，不同于现有技术中其他操作方案。相比有些工艺中采用加热灭菌除杂质，本发明中的技术方案不消耗热能。现有技术采用加热灭菌除杂质，不仅会导致春雷霉素被破坏，还会导致发酵清液杂质变多，不便于后续工序处理以及产品纯度提升。

2)层析介质预处理：将酸液浸泡活化的阳离子交换树脂装柱，用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性，然后再用ph为11的氨水洗涤直至流出液的ph为10～11，再用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性备用；

春雷霉素的菌种效价一般在5000ug/ml～10000ug/ml之间，由于发酵液调节后的酸会与菌体代谢物发生作用，初始调节的ph与最后清液的ph不会是同一个值的，一般固液分离后ph大约在5左右。因此上柱不会导致目标产物被酸性直接洗脱下来，而在这个范围，却可以达到较好的杂质去除及产物纯化的目的。

常规的阳离子交换树脂操作工艺是酸处理后，洗涤成中性，然后上样，进行交换吸附，然后用酸解析或者铵或者盐解析。本案的技术特征在于使用的是氨水处理后的阳离子交换树脂，铵根与阳离子交换树脂结合后，当春雷霉素通过树脂与铵进行置换，杂蛋白、色素等杂质交换的少，能达到较好的纯化目的。

此步骤操作有区分于常规阳离子交换树脂的离交操作步骤，是本方案的关键操作步骤，经过此步骤才能得到色价低纯度高的春雷霉素，然后后续膜过滤脱盐以及结晶，得到的白色结晶原料可以作为原药配置，也可以作为制备高纯度d手性肌醇的原料。

3)上样：将步骤1)中的清液通过步骤2)预处理后的层析介质，再用0.01mol/l盐酸洗脱3～5个柱体积；

春雷霉素的基团以及杂质与树脂的结合能力(范德华力)差异较小，需用盐酸水冲洗3～5个柱体积才可以把杂质、色素等去除的较干净。而宁南霉素的基团以及杂质与树脂的结合能力(范德华力)差异较大，直接用水冲洗冲洗2～5个柱体积就可以把杂质、色素等去除的较干净。

4)洗脱：将步骤3)上完样的层析柱用0.01mol/l～0.1mol/l氨水洗脱，收集颜色较浅的解析液，再用盐酸将解析液的ph调至3.5～4.5；

先用氨水洗脱2～3个柱体积，颜色较深(含有杂质与色素)排到废液处理系统，然后继续解析。当用氨水洗脱至4～8个柱体积，解析液中春雷霉素含量迅速升高；收集第4～8个柱体积(第4～8个柱体积中有高浓度的春雷霉素)的解析液。这就是为什么用氨水解析的目的，操作快；相比用酸解析，虽然酸解析对春雷霉素稳定性好，但洗脱时间长，解析出来的浓度不高，色素和杂质较多，颜色淡黄。

用盐酸将解析液的ph调至3.5～4.5是为了稳使春雷霉素更加稳定。若不用盐酸调节，在碱性环境下会被降解破坏，所以操作要及时，用氨水解析会比氯化铵或者盐酸样品出来较快，浓度较集中。

5)浓缩结晶：将步骤4)制备的解析液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，待浓缩至原体积十分一后按一比一体积加入ph为4的盐酸水洗2～3次以除去多余的铵盐，继续浓缩并降温或者加入有机溶剂直至春雷霉素完全结晶析出，固液分离得到白色结晶物即为春雷霉素。

优选地，步骤1)静置时间为20min。

优选地，步骤1)中高岭土助滤剂的加入量占链霉菌发酵液重量比的0.1％。

优选地，步骤1)搅拌时间为10min。

优选地，步骤2)浸泡阳离子交换树脂的酸液ph为1.0。

优选地，步骤2)所述的阳离子交换树脂为磺酸根强阳离子交换树脂或者上海华震树脂科技有限公司生产的hz008型号阳离子交换树脂。

优选地，步骤3)协调控制以下三个参数：清液通过层析介质的流速、阳离子交换树脂的使用量、层析柱的连接方式，避免清液因接近吸附或操作不当饱和时流出层析柱。

试验中，可以协调控制使得清液通过层析介质的流速2bv/h～5bv/h、阳离子交换树脂的使用量为10ml～20ml树脂/1g春雷霉素、层析柱为串联连接方式。

优选地，步骤4)先用氨水洗脱2～3个柱体积，然后继续解析，收集含有春雷霉素的第4～8个柱体积的解析液。

优选地，步骤5)中当春雷霉素浓缩60mg/ml～100mg/ml时采取降温的方式结晶析出春雷霉素。

优选地，步骤5)中当春雷霉素浓缩40mg/ml～100mg/ml时采取加入乙醇或丙酮有机溶剂结晶析出春雷霉素。

试验中，浓度可以通过液相色谱跟踪检测。有机溶剂与浓缩液的体积比为1：2～3时，萃取效果最好。

本发明有益效果在于：制备的春雷霉素纯度较高、收率较高，且整个纯化过程绿色环保。

附图说明

图1为春雷霉素二极管阵列检测器扫描紫外波长图谱；

图2为春雷霉素发酵液经过处理后离子交换层析之后hplc；

图3为春雷霉素发酵液经过纯化后结晶的产品hplc；

图4为春雷霉素产品主峰的二极管阵列峰纯度图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

实施例1

一种春雷霉素的纯化方法，所述的方法包括如下步骤:

1)含有春雷霉素的清液制备：用盐酸将链霉菌发酵液的ph调至4.0；然后向发酵液中加入高岭土助滤剂搅拌并静置，固液分离过滤得清液；

2)层析介质预处理：将酸液浸泡活化的阳离子交换树脂装柱，用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性，然后再用ph为11的氨水洗涤直至流出液的ph为11，再用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性备用；

3)上样：将步骤1)中的清液通过步骤2)预处理后的层析介质，再用0.01mol/l盐酸洗脱5个柱体积；

4)洗脱：将步骤3)上完样的层析柱用0.1mol/l氨水洗脱，收集颜色较浅的解析液，再用盐酸将解析液的ph调至4.5；

5)浓缩结晶：将步骤4)制备的解析液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，待浓缩至原体积十分一后按一比一体积加入ph为4的盐酸水洗3次以除去多余的铵盐，继续浓缩并降温或者加入有机溶剂直至春雷霉素完全结晶析出，固液分离得到白色结晶物即为春雷霉素。

实施例2

一种春雷霉素的纯化方法，所述的方法包括如下步骤:

1)含有春雷霉素的清液制备：用盐酸将链霉菌发酵液的ph调至3.0；然后向发酵液中加入高岭土助滤剂搅拌并静置，固液分离过滤得清液；

2)层析介质预处理：将酸液浸泡活化的阳离子交换树脂装柱，用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性，然后再用ph为11的氨水洗涤直至流出液的ph为10，再用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性备用；

3)上样：将步骤1)中的清液通过步骤2)预处理后的层析介质，再用0.01mol/l盐酸洗脱3个柱体积；

4)洗脱：将步骤3)上完样的层析柱用0.01氨水洗脱，收集颜色较浅的解析液，再用盐酸将解析液的ph调至3.5；

5)浓缩结晶：将步骤4)制备的解析液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，待浓缩至原体积十分一后按一比一体积加入ph为4的盐酸水洗2～3次以除去多余的铵盐，继续浓缩并降温或者加入有机溶剂直至春雷霉素完全结晶析出，固液分离得到白色结晶物即为春雷霉素。

实施例3

实施例3与在实施例1的基础上进一步限定步骤1)静置时间为20min。

实施例4

实施例4与在实施例2的基础上进一步限定步骤1)中高岭土助滤剂的加入量占链霉菌发酵液重量比的0.1％。

实施例5

实施例5与在实施例1的基础上进一步限定步骤1)搅拌时间为10min。

实施例6

实施例6与在实施例2的基础上进一步限定步骤2)浸泡阳离子交换树脂的酸液ph为1.0。

实施例7

实施例7与在实施例1的基础上进一步限定步骤2)所述的阳离子交换树脂为磺酸根强阳离子交换树脂或者上海华震树脂科技有限公司生产的hz008型号阳离子交换树脂。

实施例8

实施例8与在实施例2的基础上进一步限定步骤3)协调控制以下三个参数：清液通过层析介质的流速、阳离子交换树脂的使用量、层析柱的连接方式，避免清液因接近吸附或操作不当饱和时流出层析柱。

实施例9

实施例9与在实施例1的基础上进一步限定步骤4)先用氨水洗脱2个柱体积，然后继续解析，收集含有春雷霉素的第8个柱体积的解析液。

实施例10

实施例10与在实施例2的基础上进一步限定步骤4)先用氨水洗脱3个柱体积，然后继续解析，收集含有春雷霉素的第4个柱体积的解析液。

实施例11

实施例11与在实施例2的基础上进一步限定步骤4)先用氨水洗脱3个柱体积，然后继续解析，收集含有春雷霉素的第6个柱体积的解析液。

实施例12

实施例12与在实施例1的基础上进一步限定步骤5)中当春雷霉素浓缩60mg/ml时采取降温的方式结晶析出春雷霉素。

实施例13

实施例13与在实施例2的基础上进一步限定步骤5)中当春雷霉素浓缩80mg/ml时采取降温的方式结晶析出春雷霉素。

实施例14

实施例14与在实施例1的基础上进一步限定步骤5)中当春雷霉素浓缩100mg/ml时采取降温的方式结晶析出春雷霉素。

实施例15

实施例15与在实施例1的基础上进一步限定步骤5)中当春雷霉素浓缩40mg/ml时采取加入乙醇有机溶剂结晶析出春雷霉素。

实施例16

实施例16与在实施例2的基础上进一步限定步骤5)中当春雷霉素浓缩65mg/ml时采取加入丙酮有机溶剂结晶析出春雷霉素。

实施例17

实施例17与在实施例2的基础上进一步限定步骤5)中当春雷霉素浓缩100mg/ml时采取加入乙醇有机溶剂结晶析出春雷霉素。

实施例18

一种春雷霉素的纯化方法，所述的方法包括如下步骤:

1)含有春雷霉素的清液制备：用盐酸将链霉菌发酵液的ph调至3.0～4.0；然后向发酵液中加入高岭土助滤剂搅拌并静置，固液分离过滤得清液；步骤1)静置时间为20min，步骤1)中高岭土助滤剂的加入量占链霉菌发酵液重量比的0.1％，步骤1)搅拌时间为10min。

2)层析介质预处理：将酸液浸泡活化的阳离子交换树脂装柱，用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性，然后再用ph为11的氨水洗涤直至流出液的ph为10，再用去离子水将阳离子交换树脂洗涤至中性备用；步骤2)浸泡阳离子交换树脂的酸液ph为1.0，步骤2)所述的阳离子交换树脂为磺酸根强阳离子交换树脂或者上海华震树脂科技有限公司生产的hz008型号阳离子交换树脂。

3)上样：将步骤1)中的清液通过步骤2)预处理后的层析介质，再用0.01mol/l盐酸洗脱4个柱体积；步骤3)协调控制以下三个参数：清液通过层析介质的流速、阳离子交换树脂的使用量、层析柱的连接方式，避免清液因接近吸附或操作不当饱和时流出层析柱。

4)洗脱：将步骤3)上完样的层析柱用0.03mol/l氨水洗脱，收集颜色较浅的解析液，再用盐酸将解析液的ph调至4.0；步骤4)先用氨水洗脱2个柱体积，然后继续解析，收集含有春雷霉素的第4个柱体积的解析液。

5)浓缩结晶：将步骤4)制备的解析液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，待浓缩至原体积十分一后按一比一体积加入ph为4的盐酸水洗3次以除去多余的铵盐，继续浓缩并降温或者加入有机溶剂直至春雷霉素完全结晶析出，固液分离得到白色结晶物即为春雷霉素。步骤5)中当春雷霉素浓缩80mg/ml时采取降温的方式结晶析出春雷霉素。或步骤5)中当春雷霉素浓缩70mg/ml时采取加入乙醇或丙酮有机溶剂结晶析出春雷霉素。

取实施例18中的春雷霉素，作如下检测，检测结果详见附图1、附图2、附图3、附图4。由附图对比可知，本发明纯化的春雷霉素具有较高的纯度。

春雷霉素高效液相色谱检测方法：参考文献《春雷霉素高效液相色谱分析方法》改进，色谱条件：十八烷基键合硅胶(ods-c18)4.6*250mm，5um，流动相：体积比乙腈：25mm庚烷磺酸钠(0.1％磷酸)水溶液＝20：80，流速：1.0ml/min，波长210nm。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。