产酸克雷伯杆菌的恒温扩增检测方法及其专用引物与试剂盒与流程

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种产酸克雷伯杆菌的恒温扩增检测方法及其专用引物与试剂盒。

背景技术：

克雷伯杆菌是社区感染和医院感染重要的病原菌，尤其在免疫缺陷患者和icu重症患者可以引起严重的肺部感染和血流感染，具有很高的发病率和死亡率。克雷伯杆菌属主要包括肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯杆菌、解鸟氨酸克雷伯杆菌、植生克雷伯杆菌和土生克雷伯杆菌5个菌种，其中肺炎克雷伯杆菌和产酸克雷伯杆菌是引起人肺部感染和血流感染的重要病原体。除了引起肺部感染和血流感染，产酸克雷伯杆菌也是食物中毒和抗生素相关出血性结肠炎的重要病原体。新英格兰杂志有研究证明产酸克雷伯杆菌是非难辨梭菌导致的抗生素相关出血性结肠炎的主要病原菌。产酸克雷伯杆菌可以分泌细胞毒素，具有很强的毒力和很高的致病性，有研究证实在小鼠腹腔注射产酸克雷伯杆菌后，实验小鼠在24h全部因感染死亡。传统的产酸克雷伯杆菌的检测方法，包括乳酸菌降解分析实验、松三糖利用实验、api鉴定法以及vitek2细菌自动鉴定法等，通常基于表型检测，因此很难将产酸克雷伯杆菌同肺炎克雷伯杆菌等其他克雷伯杆菌属的细菌相鉴别。目前常用的分子基因分型方法,如脉冲场凝胶电泳、随机扩增多态性dna分析和扩增片段长度多态性分析等，对实验设备及操作人员具有很高的要求，不适于基层医疗机构推广。因此,目前亟需建立一种快速、简便、经济、高效、特异的产酸克雷伯杆菌检测方法。

环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种新型恒温dna快速扩增技术，在bstdna聚合酶作用下，65℃恒温实现对靶基因序列的高效、快速、特异性特的扩增。较于传统的pcr技术，lamp对实验设备要求低，只需要一个普通水浴锅即能满足要求，而且加入显色剂后，反应结果肉眼可见，可以用于感染性疾病的快速诊断以及细菌、病毒和寄生虫等感染病原体的流行病学监测。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供用于检测产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增的成套反应引物。

本发明提供的成套引物，由引物f3、引物b3、引物fip、引物bip、引物loopf和引物loopb组成；

所述引物f3为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；

所述引物b3为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；

所述引物fip为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的单链dna分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子；

所述引物bip为如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表的序列4所示的单链dna分子；

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的dna分子；

所述引物loopf如下(a9)或(a10)：

(a9)序列表的序列5所示的单链dna分子；

(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的dna分子；

所述引物loopb如下(a11)或(a12)：

(a11)序列表的序列6所示的单链dna分子；

(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的dna分子。

上述引物中，所述引物f3、所述引物b3、所述引物fip、所述引物bip、所述引物loopf和所述引物loopb的摩尔比为1:1:8:8:4:4。

本发明另一个目的是提供用于检测产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增反应试剂。

本发明提供的反应试剂，包括上述成套引物。

上述试剂还包括dna聚合酶、dntp、tris-hcl、mgso4、kcl、(nh4)2so4、甜菜碱和tween-20。

上述环介导等温扩增反应试剂由dna聚合酶、dntp、tris-hcl、mgso4、kcl、(nh4)2so4、甜菜碱、tween-20和上述的引物和水组成。

所述引物f3、所述引物b3、所述引物fip、所述引物bip、所述引物loopf和所述引物loopb的浓度分别为0.2μm、0.2μm、1.6μm、1.6μm、0.8μm和0.8μm。

本发明第三个目的是提供用于检测产酸克雷伯杆菌的环介导等温扩增试剂盒。

本发明提供的试剂盒，其包括上述的引物或上述的环介等温扩增试剂。

为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为产酸克雷伯杆菌标准菌株k.oxytocaatcc700324的dna，所述阴性对照为不含dna的lamp扩增体系(如双蒸水)。

具体的，该产酸克雷伯杆菌的lamp检测试剂盒分为实时浊度法检测试剂盒和calcein/mn²⁺荧光显色法检测试剂盒2种。实时浊度法lamp检测试剂盒检测试剂体积为25μl，由1.4mmdntp，20mmtris-hcl(ph8.8)，8mmmgso4，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，0.8m甜菜碱,0.1％tween-20，8ubstdna聚合酶，0.2μm正向外引物ko-16f3，0.2μm反向外引物ko-16b3，1.6μm正向内引物ko-16fip，1.6μm反向内引物ko-16bip,0.8μm正向环引物ko-16loopf，0.8μm反向环引物ko-16loopb和水组成。

calcein/mn²⁺荧光显色法试剂盒在实时浊度法试剂盒的反应体系基础上加入1μl的calcein/mn²⁺荧光指示剂,calcein/mn²⁺荧光指示剂由1.3mmcalcein和26mmmncl2溶于70％(体积百分含量)二甲亚砜配制而成。calcein/mn2⁺荧光显色法lamp检测试剂盒检测试剂体积为26μl，由1.4mmdntp，20mmtris-hcl(ph8.8)，8mmmgso4，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，0.8m甜菜碱,0.1％tween-20，8ubstdna聚合酶，0.2μm正向外引物ko-16f3，0.2μm反向外引物ko-16b3，1.6μm正向内引物ko-16fip，1.6μm反向内引物ko-16bip,0.8μm正向环引物ko-16loopf，0.8μm反向环引物ko-16loopb，1μl的calcein/mn²⁺荧光指示剂和水组成。

上述成套引物或上述pcr试剂在如下1)或2)或3)中的应用也是本发明保护的范围：

1)制备鉴定或辅助鉴定产酸克雷伯杆菌的产品；

2)制备检测待测样本中是否含有产酸克雷伯杆菌的产品。

3)制备检测或辅助检测待测菌是否为产酸克雷伯杆菌的产品。

上述应用中，所述产品为试剂盒。

本发明第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定产酸克雷伯杆菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总dna；

(2)以步骤(1)提取的总dna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增；

用如下a或b判断：

a、用浊度仪检测扩增产物，若扩增产物浊度呈s曲线变化，则所述待测微生物为或候选为产酸克雷伯杆菌；若扩增产物浊度未发生变化，则所述待测微生物不为或候选不为产酸克雷伯杆菌；

b、在环介导等温扩增前向反应体系中加入所述荧光指示剂，反应结束后观察，

若扩增产物颜色发生变化，则所述待测微生物为或候选为产酸克雷伯杆菌；

若扩增产物颜色未发生变化，则所述待测微生物不为或候选不为产酸克雷伯杆菌。

本发明第五个目的是提供一种检测或辅助检测待样本中是否含有产酸克雷伯杆菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总dna；

(2)以步骤(1)提取的总dna为模板，采用上述引物组进行环介导等温扩增；

用如下a或b判断：

a、用浊度仪检测扩增产物，若扩增产物出现s曲线或环介导等温扩增前后反应液的浊度上升，则待检测样本中含有产酸克雷伯杆菌；若扩增产物未出现s曲线或环介导等温扩增前后反应液的浊度未发生变化，则所述待检测样本中不含有产酸克雷伯杆菌；

b、在环介导等温扩增前向反应体系中加入所述荧光指示剂，反应结束后观察，

若扩增产物颜色发生变化，则所述待检测样本中含有产酸克雷伯杆菌；

若扩增产物颜色未发生变化，则所述待检测样本中不含有产酸克雷伯杆菌。

上述扩增产物颜色发生变化为扩增产物与扩增前反应液相比颜色发生变化，在本发明的实施例中，扩增产物颜色发生变化为扩增产物颜色变为绿色；

上述扩增产物颜色未发生变化为扩增产物与扩增前反应液相比颜色未发生变化，在本发明的实施例中，扩增产物颜色未发生变化为扩增产物颜色仍为橙色；

上述方法中，所述lamp反应的温度为65℃。

上述方法中，所述lamp反应的模板为待检测样本的基因组dna。

采用以上方案，本发明具有以下优点:

1)高特异性：6条特异性引物对产酸克雷伯杆菌靶序列的8个特异区域进行识别，保证了lamp扩增的高度特异性。

2)高灵敏度：灵敏度比普通pcr方法高10倍；

3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(calcein/mn²⁺荧光显色法)，也可以直接用浊度仪判断结果；

4)操作简单：只要将检测样品提取的dna和检测试剂一起放入65℃恒温水浴锅中60分钟后就可以判断结果；

5)快速、高效扩增：整个lamp扩增反应一小时内即可完成，且检测极限可达到4.8pg/μl。

综上所述，本发明的lamp引物可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测产酸克雷伯杆菌，不需要复杂仪器，为产酸克雷伯杆菌的检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和疾病预防控制中心筛查和检测产酸克雷伯杆菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明产酸克雷伯杆菌lamp检测法最佳引物的浊度仪结果。

图2为本发明产酸克雷伯杆菌实时浊度lamp检测法的特异性检测结果。

图3为本发明产酸克雷伯杆菌calcein/mn²⁺荧光显色lamp检测法的特异性检测结果。

图4为本发明产酸克雷伯杆菌实时浊度lamp检测法的灵敏度检测结果。

图5为本发明产酸克雷伯杆菌calcein/mn²⁺荧光显色lamp检测法的灵敏度检测结果。

图6为产酸克雷伯杆菌常规pcr检测法灵敏度检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于对产酸克雷伯杆菌进行lamp检测的引物设计

一、用于对产酸克雷伯杆菌进行lamp检测的引物设计

从美国基因数据库genbank检索获得产酸克雷伯杆菌序列(genbank号:ay065648.1)，用软件primerexplorerver.5设计用于对产酸克雷伯杆菌进行lamp检测的5套引物组合，分别为ko-l，ko-5，ko-9，ko-13与ko-16，各引物序列如下表1：

表1为lamp检测备选引物

二、本发明产酸克雷伯杆菌的lamp检测方法的建立及最佳引物的筛选

用上述一获得的用于对产酸克雷伯杆菌进行lamp检测的5套引物对产酸克雷伯杆菌标准菌株k.oxytocaatcc700324进行lamp检测，在相同反应条件(置65℃恒温60min)下，在反应体系中添加不同引物组合ko-l,ko-5,ko-9,ko-13,ko-16，以确定最佳反应引物。

具体方法如下：

模板制备:用promega的wizardgenomicdnapurificationkit商品化dna提取试剂盒提取产酸克雷伯杆菌的基因组dna；

实时浊度法lamp反应体系：总体积为25μl，其中含有1.4mmdntps、20mmtris-hcl(ph8.8)、8mmmgso4、10mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.8m甜菜碱、0.1％(体积百分含量)吐温-20，8ubstdna聚合酶、0.2μmf3、0.2μmb3、1.6μmfip、1.6μm、1.6μmbip、0.8μmloopf、0.8μmloopb、2μ1基因组dna，用水补足体积。

上述lamp反应条件:置65℃恒温水浴锅中60min。

实时浊度法lamp反应体系进行lamp反应，反应结束后直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果(原理为：lamp反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据实时的浊度变化来判断lamp反应)，浊度变化呈s曲线，则为阳性，表示待测样品中含有产酸克雷伯杆菌(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在产酸克雷伯杆菌(阴性)。

结果如图1所示，ko-l，ko-5，ko-9，ko-13，ko-16为表1不同的引物组合，其中ko-16出峰时间最早，故选择产酸克雷伯杆菌lamp检测的最佳引物。

因此，表1中ko-16组引物(序列表中序列1-6)为最佳lamp检测引物。

三、本发明产酸克雷伯杆菌的lamp检测试剂盒

产酸克雷伯杆菌的lamp检测试剂盒包括序列表中序列1-6所示的引物。或，产酸克雷伯杆菌的lamp检测试剂盒包括下述lamp试剂a或lamp试剂b：

lamp试剂a由1.4mmdntps、20mmtris-hcl(ph8.8)、8mmmgso4、10mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.8m甜菜碱、0.1％(体积百分含量)吐温-20，8ubstdna聚合酶、0.2μmko-16f3、0.2μmko-16b3、1.6μmko-16fip、1.6μmko-16bip、0.8μmko-16loopf和0.8μmko-16loopb和水组成；

或，lamp试剂b包括上述lamp试剂a和1μl的calcein/mn²⁺荧光指示剂；calcein/mn²⁺荧光指示剂由1.3mmcalcein和26mmmncl2溶于70％二甲亚砜配制而成。

上述试剂盒，还可以包括作为阳性对照的产酸克雷伯杆菌k.oxytocaatcc700324的基因组dna和作为阴性对照的不含dna的lamp扩增体系(双蒸水)。

实施例2、本发明产酸克雷伯杆菌的lamp检测法的特异性、灵敏性检测

一、本发明产酸克雷伯杆菌的lamp检测法的特异性检测

1、lamp反应

分别提取如下菌株的基因组dna：

1,k.oxytocaatcc700324；2,klebsiellapneumoniaeatcc2146；3,klebsiellapneumoniaeatcc7105；4,klebsiellarhinoscleromatiscmcc46111；5,haemophilusinfluenzaatcc49247；6,salmonellatyphi9275；7,streptococcuspneumoniae112-07；8,escherichiacoli44825；9,pseudomonasaeruginosaatcc15442；10,shigellaflexneri4536；11,legionellapneumophila9135；12,proteusvulgariscmcc49027；13,mycobacteriumtuberculosis005；14,acinetobacterbaumannii12101；15,stenotrophomonasmaltophiliak279a；16,negativecontrol(double-distilledwater).

1)实时浊度lamp法

实时浊度lamp法反应体系：总体积为25μl，其中含有1.4mmdntps、20mmtris-hcl(ph8.8)、8mmmgso4、10mmkcl、10mm(nh4)2so4、0.8m甜菜碱、0.1％(体积百分含量)吐温-20，8ubstdna聚合酶、0.2μmko-16f3、0.2μmko-16b3、1.6μmko-16fip、1.6μmko-16bip、0.8μmko-16loopf、0.8μmko-16loopb、2μ1基因组dna，用水补足体积。

lamp反应条件为：65℃，恒温60min。

实时浊度法lamp反应体系进行lamp反应，反应结束后直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果(原理为：lamp反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据实时的浊度变化来判断lamp反应)，浊度变化呈s曲线，则为阳性，表示待测样品中含有产酸克雷伯杆菌(阳性)，反应前后浊度无变化表示待测样品中不存在产酸克雷伯杆菌(阴性)。

结果如图2所示，1,k.oxytocaatcc700324；2,klebsiellapneumoniaeatcc2146；3,klebsiellapneumoniaeatcc7105；4,klebsiellarhinoscleromatiscmcc46111；5,haemophilusinfluenzaatcc49247；6,salmonellatyphi9275；7,streptococcuspneumoniae112-07；8,escherichiacoli44825；9,pseudomonasaeruginosaatcc15442；10,shigellaflexneri4536；11,legionellapneumophila9135；12,proteusvulgariscmcc49027；13,mycobacteriumtuberculosis005；14,acinetobacterbaumannii12101；15,stenotrophomonasmaltophiliak279a；16,negativecontrol(double-distilledwater)，可以看出，该lamp检测方法只在产酸克雷伯杆菌阳性标本k.oxytocaatcc700324中生成代表阳性反应的s形曲线，说明该检测方法具有高特异性。

2)calcein/mn²⁺荧光显色lamp法

在lamp反应前于实时浊度lamp法反应体系中加入1μl的calcein/mn²⁺荧光指示剂。calcein/mn²⁺荧光指示剂由1.3mmcalcein和26mmmncl2溶于70％二甲亚砜配制而成。

calcein/mn²⁺荧光显色法lamp反应的总体积为26μl，其中含有1.4mm四种dntp，20mmtris-hcl(ph8.8)，8mmmgso4，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，0.8m甜菜碱，0.1％吐温-20，8ubstdna聚合酶，0.2μmko-16f3和ko-16b3,1.6μmko-16fip和ko-16bip,0.8μmko-16loopf和ko-16loopb，1μl的calcein/mn²⁺荧光指示剂和2μ1待检测样本dna，用水补足体积。

lamp反应条件为：65℃，恒温60min。

若lamp反应产物变为绿色，则表示待测样品中含有产酸克雷伯杆菌(阳性)，若lamp反应产物仍为橙色，则表示待测样品中不存在产酸克雷伯杆菌(阴性)。

结果如图3所示，1,k.oxytocaatcc700324；2,klebsiellapneumoniaeatcc2146；3,klebsiellapneumoniaeatcc7105；4,klebsiellarhinoscleromatiscmcc46111；5,haemophilusinfluenzaatcc49247；6,salmonellatyphi9275；7,streptococcuspneumoniae112-07；8,escherichiacoli44825；9,pseudomonasaeruginosaatcc15442；10,shigellaflexneri4536；11,legionellapneumophila9135；12,proteusvulgariscmcc49027；13,mycobacteriumtuberculosis005；14,acinetobacterbaumannii12101；15,stenotrophomonasmaltophiliak279a；16,negativecontrol(double-distilledwater)；可以看出，只有1发生了lamp反应(1号管显示出绿色，表明检测到产酸克雷伯杆菌)，其余均颜色均未发生变化(仍为橙色)，说明具有该检测方法具有高特异性。

从上述可以看出，calcein/mn²⁺荧光显色法与实时浊度法的结果一致，表明本发明的产酸克雷伯杆菌的lamp检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到产酸克雷伯杆菌。

二、本发明产酸克雷伯杆菌的lamp检测法的灵敏度

本发明lamp检测方法与普通pcr方法检测产酸克雷伯杆菌的灵敏度。

1、lamp检测方法：

提取产酸克雷伯杆菌k.oxytocaatcc700324总dna，然后以10倍梯度(1倍、10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍)稀释成浓度分别为48.0ng/μl，4.8ng/μl，480pg/μl，48.0pg/μl，4.8pg/μl，0.48pg/μl，0.048pg/μl，再以经梯度稀释的dna为模板，分别用上述一的实时浊度法和calcein/mn²⁺荧光显色法进行lamp反应。

产酸克雷伯杆菌实时浊度法lamp检测结果如图4所示，代号1-8模板对应浓度分别为：48.0ng/μl，4.8ng/μl，480pg/μl，48.0pg/μl，4.8pg/μl，0.48pg/μl，0.048pg/μl，双蒸馏水，可以看出，代号1-5浊度变化生成代表阳性反应的s形曲线，表示检测到产酸克雷伯杆菌，表明本发明引物组合对产酸克雷伯杆菌的最低检测灵敏度为4.8pg/μl。

产酸克雷伯杆菌calcein/mn²⁺荧光显色法lamp检测结果如图5所示，代号1-8模板对应浓度分别为：48.0ng/μl，4.8ng/μl，480pg/μl，48.0pg/μl，4.8pg/μl，0.48pg/μl，0.048pg/μl，双蒸馏水；可以看出，其中1-5号管显示出绿色，检测到产酸克雷伯杆菌，表明本发明引物组合对产酸克雷伯杆菌的最低检测灵敏度也为4.8pg/μl。

2、普通pcr方法

提取产酸克雷伯杆菌k.oxytocaatcc700324总dna，然后以10倍梯度(1倍、10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍)稀释成浓度分别为48.0ng/μlto0.048pg/μl，再以经梯度稀释的dna为模板，分别用pehx的特异性pcr引物进行pcr扩增。pcr引物为pcr-f(5′-ggatacggagtatgcctttacg-3′)和pcr-b

(5′-gcaccttgcagccctga-3′)，扩增片段为大小为218bp。

pcr扩增产物电泳检测结果如图6所示，代号1-8模板对应浓度分别为：48.0ng/μl,4.8ng/μl,480pg/μl,48.0pg/μl,4.8pg/μl,0.48pg/μl,0.048pg/μl，双蒸馏水,m为dnamarkerd2000；可以看出，代号1-4出现目标条带，表明pcr方法的检测灵敏度为48.0pg/μl。

比较可知，本发明产酸克雷伯杆菌的lamp检测方法，包括实时浊度法和calcein/mn2+荧光显色法均可检测到dna浓度为4.8pg/μl的样本，而普通pcr方法仅能检测到dna浓度为48.0pg/μl的样本，而且calcein/mn²⁺荧光显色lamp法及实时浊度lamp法的结果一致，表明本发明产酸克雷伯杆菌的lamp检测法比普通pcr检测方法的灵敏度高10倍。

sequencelisting

<110>中国人民解放军空军特色医学中心中国人民解放军疾病预防控制中心中国人民解放军总医院

<120>产酸克雷伯杆菌的恒温扩增检测方法及其专用引物与试剂盒

<160>6

<170>patentinversion3.5

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