本发明属于食品及其相关物品的微生物检测领域，涉及pcr技术，尤其是涉及不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量pcr检测技术。
背景技术：
：致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenicescherichiacoli)是一类能引起腹泻为主的大肠埃希氏菌，可以经过污染的食物导致人体发病。常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenicescherichiacoli，epec)、肠道侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasiveescherichiacoli，eiec)、产肠毒素大肠埃希氏菌(enterotoxigenicescherichiacoli，etec)、产志贺毒素大肠埃希氏菌(shigatoxin-producingescherichiacoli，stec)、及肠道集聚性大肠埃希氏菌(enteroaggregativeescherichiacoli，eaec)等，其中stec包括肠道出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagicescherichiacoli，ehec)。不同种的致泻大肠埃希氏菌具有不同的特征基因，如表1所示：表1五种致泻大肠埃希氏菌特征基因目前大肠埃希氏菌的pcr确定试验，主要是取生化反应符合大肠埃希氏菌特征的菌落进行多次的pcr确认试验，每个样品的初筛需要配置十余个pcr扩增反应体系，对应检测不同目标基因，同时该方法需凝胶电泳后通过查找不同目标条带种类及组合，确定大肠埃希氏菌种类，耗费人力并容易导致污染，因而有必要发展新的检测方法，实现对大肠埃希氏菌的快速诊断鉴定。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量pcr检测技术，同时在相同的热循环条件下快速的检测多个基因。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：1)制备致泻大肠埃希氏菌，作为待检测样品模板；具体方式为使用1μl接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h～24h的菌落，悬浮在200μl0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于13000r/min离心3min，弃掉上清液；加入1ml灭菌去离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min，冰浴冷却后，13000r/min离心3min，收集上清液；按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μl作为荧光定量pcr检测的模板；所有处理后的dna模板直接用于荧光定量pcr反应或暂存于4℃并当天进行荧光定量pcr反应；否则，应在-20℃以下保存备用(1周内)；2)在包含上下游扩增引物、探针等的反应体系中进行多重荧光定量pcr扩增；每个样品2个荧光定量pcr反应体系，对应检测8个目标基因，2个反应体系的引物如下表：3)扩增过程中，配置好的反应体系置于荧光定量pcr仪器中，按照反应程序，荧光定量pcr仪自动采集扩增产物的荧光信号；反应体系25μl，配置方式如下：taqmanpcrmastermix12.5μl上下游扩增引物各10pmol探针2pmol模板2.5μlddh2o补足至25μl将配置好的反应体系置于荧光定量pcr仪器中，扩增条件：第一阶段：95℃下预变性30s；第二阶段：40次循环：95℃变性5s，55℃退火20s，72℃收集荧光15s。在第二阶段的退火步骤结束时，收集记录发光信号。5)结果分析，测定样品基因检测有对应荧光增幅现象，且ct值小于或等于36，则判定样品含有此荧光信号，根据体系1和体系2中的荧光信号判定致泻大肠埃希氏菌种类。产肠毒素大肠埃希氏菌：体系1中存在fam、cy5荧光信号一种或两种；肠道集聚性大肠埃希氏菌：体系1中存在rox荧光信号；肠道侵袭性大肠埃希氏菌：体系2中存在fam荧光信号；肠道致病性大肠埃希氏菌：体系2中存在rox荧光信号；产志贺毒素大肠埃希氏菌/肠道出血性大肠埃希氏菌：体系2中存在cy5荧光信号。具体实施方式：本发明提供的不同致泻大肠埃希氏菌多通道荧光定量pcr检测技术，其确定过程如下：1.细菌株：肠道致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenicescherichiacoli，epec)、肠道侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasiveescherichiacoli，eiec)、产肠毒素大肠埃希氏菌(enterotoxigenicescherichiacoli，etec)、产志贺毒素大肠埃希氏菌(shigatoxin-producingescherichiacoli，stec)、及肠道集聚性大肠埃希氏菌(enteroaggregativeescherichiacoli，eaec)，其中stec包括肠道出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagicescherichiacoli，ehec)。2.主要试剂与设备：2×hotstarttaqpcrmastermix；lightcycle480荧光定量pcr仪等3.菌群的扩增方法如下：使用1μl接种环刮取营养琼脂平板或斜面上培养18h～24h的菌落，悬浮在200μl0.85％灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，于13000r/min离心3min，弃掉上清液。加入1ml灭菌去离子水充分混匀菌体，于100℃水浴或者金属浴维持10min，冰浴冷却后，13000r/min离心3min，收集上清液；按1∶10的比例用灭菌去离子水稀释上清液，取2μl作为荧光定量pcr检测的模板；所有处理后的dna模板直接用于荧光定量pcr反应或暂存于4℃并当天进行荧光定量pcr反应。4.阴性对照、空白对照的设计：以非致泻性大肠埃希氏菌为阴性对照，以ddh2o为空白对照。5.实时荧光定量pcr反应体系如下，每个样品做2个平行对照，加样时应使dna溶液完全加入体系中，不要黏附于管壁：taqmanpcrmastermix12.5μl上下游扩增引物各10pmol探针2pmol模板2.5μl水补足至25μl6.仪器设置：设定样品名称、对应的荧光基团和淬灭基团的种类、荧光信号收集等，设置pcr反应参数。7.pcr反应运行：按照预先设置的样品摆放顺序，将pcr反应管依次摆放，并运行反应程序。当前第1页12