hIL-12p35-Fc融合蛋白、编码基因、重组载体、宿主细胞及应用的制作方法

本发明属于基因工程及生物医药技术领域，具体涉及hil-12p35-fc融合蛋白及其编码基因、重组载体、宿主细胞及其在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。

背景技术：

自身免疫性疾病(autoimmunediseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病如器官特异性自身免疫病。自身免疫性疾病涉及疾病之广，主要有器官特异性的自身免疫性疾病，如多发性脑脊髓硬化症(ms)、慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天皰疮、类天皰疮、原发性胆汁性肝硬变、急性特发性多神经炎等；还包括系统性的身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(sle)、类风湿性关节炎、系统性脉管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎等。随着我国社会经济的发展，自身免疫病的发病率日益上升，而且自身免疫病后期对人们生产、生活乃至生命健康造成的危害是非常严重的。加强该领域的基础性研究将会进一步了解自身免疫性疾病的发生、发展、转归，进而提高对它的诊断、治疗和预防。这对保障人类健康生活，促进经济社会的发展均有着重要的理论及现实意义。

il-12家族成员不仅在感染及炎症过程中起着重要的调节作用，而且与脑脊髓炎、多发性硬化症、克罗恩病、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病的发病和治疗密切相关。il-12和il-23分别是th1和th17诱导产生的关键分子，而th1和th17是两类自身免疫病中重要的致病因子，因此il-12和il-23已被用于自身免疫病的的治疗靶点。而il-27和il-35能分别有效地抑制th17细胞产生和诱导调节性t和b细胞产生，而用于抑制自身免疫疾病如葡萄膜炎和多发性硬化症，目前研究il-27和il-35的生物制剂正成为研究热点。然而，目前人们仍然不能有效的获得具有良好生物活性的可溶性hil-35。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种生理活性良好的可溶性hil-12p35-fc融合蛋白及其编码基因、重组载体、宿主细胞及其在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。

本发明提供了一种hil-12p35-fc融合蛋白，所述hil-12p35-fc融合蛋白包括人成熟hil-12p35肽片段和fc片段；所述fc片段为人免疫球蛋白链恒定区；所述fc片段包括重链ch1、ch2、ch3、ch4中的两个以上的多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合；所述免疫球蛋白包括iga、igd、ige、igg和igm。

优选的，所述人成熟hil-12p35肽片段的氨基酸序列如seqidno.5所示。

优选的，所述fc片段为igg4fc，所述igg4fc包括igg4铰链区、ch2和ch3；所述igg4fc的氨基酸序列如seqidno.7所示。

优选的，所述hil-12p35-fc融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.10所示。

本发明提供了编码hil-12p35-fc融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seqidno.8所示。

本发明提供了包含上述基因的重组载体。

优选的，所述重组载体的基础载体为昆虫表达载体pmib。

优选的，所述昆虫表达载体pmib包含seqidno.3所示核苷酸序列的信号肽编码序列。

本发明提供了包含上述重组载体的重组宿主细胞。

本发明还提供了上述hil-12p35-fc融合蛋白、基因、重组载体或重组宿主细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。

优选的，所述自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、多发性硬化、葡萄膜炎和牛皮癣中的一种或多种。

本发明提供了一种治疗自身免疫性疾病的药物，所述药物包括上述hil-12p35-fc融合蛋白。

优选的，所述药物还包括赋性剂、乳化剂、增溶剂、抗氧化剂、控释剂中的一种或多种。

本发明还提供了上述hil-12p35-fc融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养上述重组宿主细胞，得到培养物；

(2)从所述培养物中分离得到hil-12p35-fc融合蛋白。

有益效果：本发明提供了一种hil-12p35-fc融合蛋白及其编码基因、重组载体、宿主细胞及其在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。本发明所述编码hil-12p35-fc融合蛋白包括人成熟hil-12p35肽片段和fc片段。该融合蛋白由人成熟hil-12p35肽片段与fc片段顺序连接获得，能表达得到可溶性的hil-12p35-fc融合蛋白，且该可溶性融合蛋白具有良好的治疗自身免疫性疾病的生物活性。

本发明分析编码hil-12p35碱基表达偏性，结果显示：hil-12p35碱基本身的信号肽不利于表达。因此，本发明使用honeybeemelittinsecretion信号肽(seqidno.3)来表达hil-12p35。本发明还将hil-12p35与higg4fc段连接构成融合蛋白。higg4fc可减少融合蛋白诱导机体的免疫刺激，higg4fc段的加入不仅有利于蛋白的表达、纯化；还能有效提高蛋白在体内应用时的半衰期。另外，本发明在优选的方案中使用无血清培养的工程化highfive^tm细胞株，无血清表达有利于融合蛋白表达、纯化。

附图说明

图1为本发明实施例1所述计算机分析il-12a(hil-12p35)的密码子偏好性结果图；

图2为本发明实施例1所述纯化的p35-fc融合蛋白与对照fc蛋白的电泳结果图；

图3为本发明实施例1所述应用抗p35抗体对纯化的蛋白进行westernblot鉴定的结果图；

图4为本发明实施例1所述应用抗iggfc抗体对纯化的蛋白进行westernblot鉴定的结果图；

图5为本发明实施例2所述hil-12p35-fc抑制mrl/lpr小鼠b细胞增殖的实验结果图；

图6为本发明实施例2所述hil-12p35-fc诱导mrl/lpr小鼠产生调节性b细胞而抑制浆细胞产生的实验结果图；

图7为本发明实施例2所述hil-12p35-fc抑制mrl/lpr小鼠自身抗体产生的实验结果图；

图8为本发明实施例2所述hil-12p35-fc抑制eae小鼠t细胞对自身抗原肽mog33-55反应的实验结果图；

图9为本发明实施例2所述hil-12p35-fc诱导eae小鼠产生调节性t细胞而抑制th17产生的实验结果图；

图10为本发明实施例2所述hil-12p35-fc抑制eae小鼠疾病发生、发展的实验结果图；

图11为本发明实施例2所述hil-12p35-fc抑制eau小鼠t细胞对自身抗原反应的实验结果图；

图12为本发明实施例2所述hil-12p35-fc诱导eau产生调节性t细胞而抑制th17产生的实验结果图；

图13为本发明实施例2所述hil-12p35-fc抑制eau小鼠临床症状的实验结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种hil-12p35-fc融合蛋白，所述hil-12p35-fc融合蛋白包括人成熟hil-12p35肽片段和fc片段。该融合蛋白由人成熟hil-12p35肽片段与fc片段顺序连接获得，能表达得到可溶性的hil-12p35-fc融合蛋白，且该可溶性融合蛋白具有良好的治疗自身免疫性疾病的生物活性。

在本发明中，所述人成熟hil-12p35肽片段为hil-12p35亚基中去除信号肽的部分，其氨基酸序列优选如seqidno.5所示。在本发明中，所述fc片段为人免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子和细胞相互作用的部位。例如，免疫球蛋白fc区可包括重链ch1、ch2、ch3、ch4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm。其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如igg-1、igg-2、igg-3、igg-4；iga-1和iga-2以及不同的基因型。在本发明中，所述fc片段优选包括至少一个免疫球蛋白绞链区，以及igg的ch2和ch3区；更优选包括higg4fc，即igg4铰链区，恒定区2(ch2)和恒定区3(ch3)组成。在本发明中，所述igg4fc的氨基酸序列优选如seqidno.7所示。所述hil-12p35-fc融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.10所示。

本发明提供了编码hil-12p35-fc融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.8所示。在本发明中，所述编码hil-12p35-fc融合蛋白的基因由人成熟hil-12p35肽的碱基序列与编码人igg4fc铰链区(j)，恒定区2(ch2)和恒定区3(ch3)的碱基序列连接获得，能表达得到可溶性hil-12p35-fc融合蛋白，且该可溶性融合蛋白具有良好的治疗自身免疫性疾病的生物活性。fc可减少融合蛋白诱导机体的免疫刺激，higg4fc段的加入不仅有利于蛋白的表达、纯化；还能有效提高蛋白在体内应用时的半衰期。

本发明提供了包含上述基因的重组载体。在本发明中，所述重组载体的基础载体优选为昆虫表达载体pmib。所述昆虫表达载体pmib优选包含seqidno.3所示核苷酸序列的信号肽编码序列。本发明通过分析编码hil-12p35碱基的表达偏性，结果显示：hil-12p35碱基本身的信号肽不利于表达。因此，本发明优选使用包含honeybeemelittinsecretion信号肽(seqidno.3)的昆虫表达载体pmib来表达hil-12p35，有利于hil-12p35-fc融合蛋白的表达。本发明对上述重组载体的具体构建方法不作特别限定，本领域常规方法即可。

本发明提供了包含上述重组载体的重组宿主细胞。在本发明中，所述重组细胞优选为无血清培养的工程化highfive^tm细胞株；所述highfive^tm细胞株优选购买自invitrogen公司，货号：b855-02。本发明对上述宿主细胞的具体转染方法不作特别限定，本领域常规方法即可。利用无血清表达有利于融合蛋白表达、纯化。

本发明还提供上述hil-12p35-fc融合蛋白、基因、重组载体或重组宿主细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。在本发明中，所述自身免疫性疾病优选包括系统性红斑狼疮、多发性硬化、葡萄膜炎和牛皮癣中的一种或多种。本发明实验结果表明：hil-12p35-fc融合蛋白能抑制小鼠mrl/lpr小鼠狼疮疾病的发生和发展；能抑制多发性硬化(ms)小鼠模型实验性自身免疫性脑膜炎(eae)小鼠疾病的发生和发展；能抑制葡萄膜炎小鼠模型实验性自身免疫性葡萄膜炎(eau)小鼠疾病的发生和发展。

本发明提供了一种治疗自身免疫性疾病的药物，所述药物包括上述hil-12p35-fc融合蛋白。所述hil-12p35-fc融合蛋白在所述药物中的质量百分比为0.01～99.99％。优选的，所述药物还包括赋性剂、乳化剂、增溶剂、抗氧化剂、控释剂中的一种或多种。本发明对上述药物的制备方法不作特别限定，本领域常规方法即可。

本发明还提供了上述hil-12p35-fc融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养上述重组宿主细胞，得到培养物；

(2)从所述培养物中分离得到hil-12p35-fc融合蛋白。

本发明对具体的重组宿主细胞培养方法不作特别限定，本领域常规培养方式均可。在本发明的实施例中，所述培养前优选利用选择性培养基筛选表达量高的重组宿主细胞；所述选择性培养基优选为含有80μg/ml杀稻瘟素的无血清培养基。

培养重组宿主细胞后，得到培养物。本发明从所述培养物中分离得到hil-12p35-fc融合蛋白。在本发明中，所述分离方法优选采用如下步骤进行：

①收集样品：收集无血清培养60～85h的培养液上清；

②平衡：用5～10cv的平衡缓冲液平衡层析柱至流出液电导和ph不变；

③进料：样品缓冲液与平衡液一致；固体样品用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液用平衡液透析；高浓度样品溶液用平衡液稀释。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算；

④淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线；

⑤洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集流出液；然后用碱性缓冲液将收集到的蛋白溶液中和至中性。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(一)：hp35-fc昆虫表达载体构建

表达载体构建过程：

(1)通过pubmed数据库查询人il-12a即hil-12p35亚基含有信号肽的碱基序列(seqidno.1)和氨基酸序列(seqidno.2)；

seqidno.1(hil-12p35cdna)：

atgtggccccctgggtcagcctcccagccaccgccctcacctgccgcggccacaggtctgcatccagcggctcgccctgtgtccctgcagtgccggctcagcatgtgtccagcgcgcagcctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggccagaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcctaa；

其中，5’端的碱基序列

“atgtggccccctgggtcagcctcccagccaccgccctcacctgccgcggccacaggtctgcatccagcggctcgccctgtgtccctgcagtgccggctcagcatgtgtccagcgcgcagcctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggcc”为信号肽编码序列；

3’端的碱基“taa”为终止密码子。

seqidno.2(hil-12p35氨基酸序列)：

mwppgsasqpppspaaatglhpaarpvslqcrlsmcparslllvatlvlldhlslarnlpvatpdpgmfpclhhsqnllravsnmlqkarqtlefypctseeidheditkdktstveaclpleltknesclnsretsfitngsclasrktsfmmalclssiyedlkmyqvefktmnakllmdpkrqifldqnmlavidelmqalnfnsetvpqkssleepdfyktkiklcillhafriravtidrvmsylnas；

其中，5’端的氨基酸序列

“mwppgsasqpppspaaatglhpaarpvslqcrlsmcparslllvatlvlldhlsla”为信号肽；

其余部分为成熟hil-12p35。

(2)通过计算机分析il-12a(hil-12p35)的密码子偏好性，结果如图1所示。结果显示，信号肽编码区中存在不利于哺乳动物表达的编码(深灰色和浅灰色)。

(3)由于人hil-12p35自身信号肽不利于哺乳系统表达，本发明使用带有honeybeemelittinsecretionsignal信号肽的昆虫表达载体pmib(pmib/v5-hisa,b,andcvectorkit，catalogno.v8030-01，购自invitrogen公司，碱基序列如seqidno.3所示)；

seqidno.3(honeybeemelittinsecretionsignal信号肽碱基序列)：

atgaaattcttagtcaacgttgcccttgtttttatggtcgtatacatttcttacatctatgcc△(melittincleavagesite)。

(4)在hil-12p35亚基中去除信号肽和终止密码子的碱基序列后余下的即是编码成熟氨基酸的碱基序列(seqidno.4)和氨基酸序列(seqidno.5)。

seqidno.4(人成熟hil-12p35碱基编码序列)：

agaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcc；

seqidno.5(人hil-12p35碱基编码成熟氨基酸序列)：

rnlpvatpdpgmfpclhhsqnllravsnmlqkarqtlefypctseeidheditkdktstveaclpleltknesclnsretsfitngsclasrktsfmmalclssiyedlkmyqvefktmnakllmdpkrqifldqnmlavidelmqalnfnsetvpqkssleepdfyktkiklcillhafriravtidrvmsylnas。

(5)通过pubmed数据库查询人igg4fc去除恒定区1(ch1)的碱基序列(seqidno.6)和氨基酸序列(seqidno.7)，即包括铰链区(j)，恒定区2(ch2)和恒定区3(ch3)。

seqidno.6(包括铰链区(j)，恒定区2(ch2)和恒定区3(ch3)，简写：人igg4fc碱基序列)：

cccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagggtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaggacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa；

其中，3’端的六个碱基“tgataa”为两个终止密码子。

seqidno.7(人igg4fc氨基酸序列)：

ppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvrvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpednykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

把编码人成熟hil-12p35肽的碱基序列与编码人igg4fc铰链区(j)，恒定区2(ch2)和恒定区3(ch3)的碱基序列连接，简写p35-fc(seqidno.8)。

seqidno.8(hil-12p35-iggfc，简写：p35-fc碱基序列)：

gcatgctaagaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcccccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagggtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaggacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataatctaga

其中，

“agaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcc”为编码人成熟hil-12p35碱基序列；

“cccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagggtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaggacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa”为编码人igg4fc铰链区(j)，恒定区2(ch2)和恒定区3(ch3)的碱基序列；

3’端的“tgataa”为两个终止密码子；

5’端的“gcatgc”和3’端的“tctaga”分别为sphi和xbai限制性内切酶位点；

5’端的“ta”是为了确保正确编码p35-fc氨基酸，防止移码。

编码人igg4fc铰链区(j)，恒定区2(ch2)和恒定区3(ch3)的碱基序列(seqidno.9)。

seqidno.9(higgfc，简写：fc碱基序列)：

gcatgctacccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagggtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaggacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataatctaga

其中，

“cccccatgcccatcatgcccagcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagggtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggtaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaggacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctccgggtaaa”为编码人igg4fc铰链区(j)，恒定区2(ch2)和恒定区3(ch3)的碱基序列；

3’端的“tgataa”为两个终止密码子；

5’端的“gcatgc”和3’端的“tctaga”分别为sphi和xbai限制性内切酶位点；

5’端的“ta”是为了确保正确编码fc氨基酸，防止移码。

(7)由通用生物系统(安徽)有限公司，通过基因(即p35-fc碱基序列即seqidno.8，和fc碱基序列即seqidno.9)合成和利用sphi(gcatgc)和xbai(tctaga)位点同源重组的方法将seqidno.8或seqidno.9分别重组到pmib载体。

(8)由通用生物系统(安徽)有限公司通过基因测序鉴定pmib/p35-fc和pmib/fc两个表达质粒是正确的。

(二)：利用无血清培养的工程化highfivetm细胞株表达p35-fc融合蛋白。

(1)准备pmib/p35-fc和pmib/fc两个表达质粒

本发明使用purelink^tmhqminiplasmid分离质粒dna纯化试剂盒(invitrogen公司，目录号k2100-01)，从10-15ml培养细菌中分离10～15μg质粒dna。

(2)准备highfive^tm昆虫细胞

对于每次转染，使用活力大于95％的对数期细胞。

①用无血清培养基expressfivesfm(invitrogen公司，货号：10486-025)在60mm培养皿中接种2×10⁶个highfive^tm细胞(invitrogen公司，货号：b855-02)；

②将细胞孵育至少15min而不摇动以允许细胞完全附着在培养皿的底部，形成单层细胞。

③通过倒置检查细胞，确认细胞已附着。

(3)质粒转染到highfive^tm细胞中

将质粒pmib/p35-fc或pmib/fc和试剂(invitrogen公司，货号：10362-010)以适当的方式混合在一起，并与新接种的昆虫细胞一起培养。

a.准备每种转染混合物，使用1.5ml微量离心管。添加以下试剂：1ml无血清培养基，1-10μlpmib/p35-fc或pmib/fc(te中约1μg/μl，ph＝8)，20μl试剂；

b.轻轻混合转染混合物10s。

c.将转染混合物在室温下孵育15min。当转染混合物孵育时，进行步骤d。

d.小心地从细胞中取出培养基，不要破坏细胞单层。

e.将整个转染混合物逐滴加入60mm培养皿中。

(4)获得稳定细胞株

a.转染后48h，取出转染液，加入新鲜培养基。

b.将细胞1：5(20％汇合)稀释后，在选择性培养基即含有80ug/ml杀稻瘟素blasticidins(invitrogen公司，货号：r210-01)无血清培养基expressfivesfm中培养。

c.每隔3～4d更换一次选择性培养基，直至观察到焦点形成。

d.采用稀释的方法分离克隆细胞。

f.应用elisa方法检测表达量高的细胞株。

(5)蛋白纯化

收集样品：收集无血清培养72h的pmib/p35-fc或pmib/fc稳定表达细胞的培养上清。

平衡：用5～10cv的平衡缓冲液(20mmpb+0.15mnacl，ph7.0，添加适当浓度的nacl抑制非特异性吸附)平衡层析柱，至流出液电导和ph不变(与平衡液一致)。

进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤(0.45μm)处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。

淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。

洗脱：用洗脱缓冲液(20mm乙酸钠，ph3.0-4.0或0.1m甘氨酸，ph3.0)洗脱，收集流出液。洗脱后，立刻用碱性缓冲液(如1mtris/hcl,ph9.0)将收集到的蛋白溶液中和到中性。

纯化的p35-fc融合蛋白与对照fc蛋白的电泳结果如图2所示。其中，1表示p35-fc；2为marker；3表示fc。图2结果表明：本发明获得了高纯化的p35-fc融合蛋白与对照fc蛋白。

(6)对蛋白进行westernblot鉴定。

a，应用抗p35抗体(santacruzbiotech公司,货号：sc-9350)进行westernblot鉴定，鉴定结果如图3所示。其中，1表示fc；2表示p35-fc。图3结果表明：抗p35抗体能鉴定出p35-fc。

b，应用辣根过氧化物酶(hrp)标记的小鼠抗人igg4fc抗体(southernbiotech公司，货号9190-05)进行westernblot鉴定，鉴定结果如图4所示。其中，1表示fc；2表示p35-fc。图4结果表明：抗iggfc抗体能鉴定出p35-fc。

(7)蛋白定量

本发明对纯化后的蛋白进行定量，结果表明：本发明获得了0.9mg/ml的p35-fc蛋白。

实施例2

对实施例1纯化获得的蛋白进行体外功能实验。

(一)hil-12p35-fc抑制系统性红斑狼疮小鼠模型mrl/lpr小鼠狼疮疾病发生、发展。

系统性红斑狼疮是一种以自身免疫性浆细胞产生自身抗体介导的自身免疫性疾病，而调节性b细胞降低是系统性红斑狼疮产生的重要决定性因素，而hil-12p35-fc能有效地诱导调节性b细胞产生，并抑制浆细胞产生，从而可能抑制系统性红斑狼疮发生、发展。

mrl/lpr小鼠模型与系统性红斑狼疮发病机制十分相似，是研究系统性红斑狼疮的极好动物模型，它能自发性地产生狼疮疾病。

mrl/lpr小鼠大约6个月时产生明显的狼疮疾病，此时每隔2天注射1次，连续注射两周。每只小鼠200ng对照fc或hil-12p35-fc治疗mrl/lpr小鼠，每组有6只小鼠，在注射后第28d进行下面的实验：

(1)hil-12p35-fc抑制mrl/lpr小鼠b细胞增殖

自身抗原刺激淋巴细胞如b细胞增殖是自身免疫病的一个关键事件，为了评价hil-12p35-fc对mrl/lpr小鼠b细胞对自身抗原的反应的影响，使用自身抗原dsdna刺激各种处理的mrl/lpr小鼠b细胞，使用mts法检测细胞增殖，结果如图5所示。图5结果表明：hil-12p35-fc能有效地抑制mrl/lpr小鼠b细胞对自身抗原的反应。

(2)hil-12p35-fc诱导mrl/lpr小鼠产生调节性b细胞而抑制浆细胞的产生

调节性b细胞是免疫应答反应的抑制性细胞，而浆细胞是自身抗体的产生细胞。研究显示在系统性红斑狼疮疾病和它动物模型lupus内，调节性b细胞下降，而浆细胞升高。为了评价hil-12p35-fc对mrl/lpr小鼠体内调节性b细胞和浆细胞的影响，收集小鼠脾细胞，应用细胞流式技术检测脾细胞中il-10⁺调节性b细胞和cd138⁺浆细胞的影响。结果如图6所示。图6结果表明：hil-12p35-fc能有效地诱导mrl/lpr小鼠产生调节性b细胞而抑制浆细胞的产生。

(3)hil-12p35-fc抑制mrl/lpr小鼠自身抗体的产生

自身抗体是系统性红斑狼疮发生、发展的关键致病因子，通过检测针对自身抗原如dsdna的自身抗体水平，评价hil-12p35-fc对mrl/lpr小鼠疾病发生、发展的影响。结果如图7所示。图7结果表明：hil-12p35-fc能有效地抑制mrl/lpr小鼠疾病的发生、发展。

(二)hil-12p35-fc抑制多发性硬化(ms)小鼠模型实验性自身免疫性脑膜炎(eae)小鼠疾病发生、发展。

多发性硬化(ms)是一种以th17介导的自身免疫性疾病，而调节性t细胞降低是eae产生的重要决定性因素，而hil-12p35-fc能有效地诱导调节性t细胞产生，并抑制th17产生，从而可能抑制ms/eae发生、发展。

实验性自身免疫性脑膜炎(eae)小鼠模型与ms发病机制十分相似，是研究ms的极好动物模型。

eae诱导：9周龄的c57bl/6小鼠接受皮下注射。乳化含有4mg/ml结核分枝杆菌h37ra的cfa与125mg髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(mog)35-55肽1：1(v/v)；注射乳化物到小鼠尾巴的底部和两侧。同时腹膜内注射百日咳毒素(pbs中300ng百日咳毒素；listbiological)。

根据以下分级标度对动物进行称重，监测和临床评估：

0＝没有迹象；

1＝远端尾部无力；

1.5＝尾巴虚弱和一些后肢无力；

2＝完全尾巴麻痹；

2.5＝完全尾瘫和部分后肢无力；

3＝后四肢完全无力；

3.5＝前肢无力，不能站立或直立；

4＝安乐死或自发死亡(如果失去了起始体重的20％，就会被安乐死)。

在第0天使用myelinoligodendrocyteglycoprotein(mog)35–55peptide诱导小鼠产生eae，在第7天使用每只小鼠200ng对照fc或hil-12p35-fc治疗eae小鼠，每组有6只小鼠，在第21d进行下面的实验：

(1)hil-12p35-fc抑制eae小鼠t细胞对自身抗原肽mog33-55的反应

自身抗原刺激淋巴细胞如cd4+t细胞增殖是自身免疫病的一个关键事件，为了评价hil-12p35-fc对eae小鼠t细胞对自身抗原的反应的影响，使用mog33-55刺激各种处理的eae小鼠cd4+t细胞，使用mts法检测细胞增殖。结果如图8所示。图8结果表明：hil-12p35-fc能有效地抑制eae小鼠t细胞对自身抗原的反应。

(2)hil-12p35-fc诱导eae小鼠产生调节性t细胞而抑制th17的产生

调节性t细胞是免疫应答反应的抑制性细胞，而th17细胞是炎症反应细胞。研究显示在多发性硬化和它动物模型eae内，调节性t细胞下降，而th17升高。为了评价hil-12p35-fc对eae小鼠体内调节性t细胞和th17的影响，收集小鼠脑积液，应用细胞流式技术检测脑积液中treg，th17细胞。结果如图9所示。图9结果表明：hil-12p35-fc能有效地诱导eae小鼠产生调节性t细胞而抑制th17的产生。

(3)hil-12p35-fc抑制eae小鼠疾病发生、发展

通过eae发病标准判定eae临床得分，通过eae临床得分，评价hil-12p35-fc对eae小鼠疾病发生、发展的影响。结果如图10所示。图10结果表明：hil-12p35-fc能有效地抑制eae小鼠疾病的发生、发展。

(三)hil-12p35-fc抑制葡萄膜炎小鼠模型实验性自身免疫性葡萄膜炎(eau)小鼠疾病发生、发展。

葡萄膜炎(uveitis)是一种以th17介导的自身免疫性疾病，而调节性t细胞下降是疾病发生、发展重要决定性因素，而hil-12p35-fc能有效地诱导调节性t细胞并抑制th17产生从而抑制uveitis。

实验性自身免疫性葡萄膜炎(eau)小鼠模型与uveitis发病机制十分相似，是研究uveitis的极好动物模型。

eau诱导：在含有150g牛光感受器间维甲酸结合蛋白(irbp)和300g人irbp肽(氨基酸残基1-20)的0.2ml溶液与含有结核分枝杆菌菌株h37ra(2.5mg/ml)的完全弗氏佐剂1：1(v/v)乳化，主动免疫c57bl/6小鼠诱导了eau。同时接受百日咳博德特氏菌毒素(0.2克/小鼠)。

在第0天使用bovineinterphotoreceptorretinoid-bindingprotein(irbp)andhumanirbppeptide(aminoacidresidues1–20)诱导小鼠产生eau，在第7天使用每只小鼠200ng对照fc或hil-12p35-fc治疗eau小鼠，每组有6只小鼠，在第21d进行下面的实验：

(1)hil-12p35-fc抑制eau小鼠t细胞对自身抗原的反应

自身抗原刺激淋巴细胞如cd4+t细胞增殖是自身免疫病的一个关键事件，为了评价hil-12p35-fc对eau小鼠t细胞对自身抗原的反应的影响，使用irbp刺激各种处理的eae小鼠cd4+t细胞，使用h-tdr掺入法检测细胞增殖。结果如图11所示。图11结果表明：hil-12p35-fc能有效地抑制eau小鼠t细胞对自身抗原的反应。

(2)hil-12p35-fc诱导eau产生调节性t细胞而抑制th17的产生

调节性t细胞是免疫应答反应的抑制性细胞，而th17细胞是炎症反应细胞。研究显示在视网膜炎和它动物模型eau内，调节性t细胞下降，而th17升高。应用细胞流式技术检测eau小鼠眼内th17细胞。结果如图12所示。图12结果表明：hil-12p35-fc能有效地eau产生调节性t细胞而抑制th17的产生。

(3)hil-12p35-fc抑制eau小鼠临床症状

eau模型是眼睛视网膜炎的动物模型，因此本发明通过眼底镜检查免疫后21d的小鼠眼睛，结果如图13所示。图13结果表明：hil-12p35-fc能有效地抑制eau小鼠疾病的发展：接受fc的对照eau小鼠或eau小鼠的眼底图像显示出严重的视神经乳头水肿，视网膜血管炎和脉络膜浸润；而p35-fc显示抑制eau，相对于对照小鼠，eau评分显着降低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>王仁喜

<120>hil-12p35-fc融合蛋白、编码基因、重组载体、宿主细胞及应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>762

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgtggccccctgggtcagcctcccagccaccgccctcacctgccgcggccacaggtctg60

catccagcggctcgccctgtgtccctgcagtgccggctcagcatgtgtccagcgcgcagc120

ctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggccagaaacctcccc180

gtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagg240

gccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttct300

gaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgttta360

ccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataact420

aatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagt480

atttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctg540

atggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctg600

atgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccg660

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gtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcctaa762

<210>2

<211>253

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

mettrpproproglyseralaserglnproproproserproalaala

151015

alathrglyleuhisproalaalaargprovalserleuglncysarg

202530

leusermetcysproalaargserleuleuleuvalalathrleuval

354045

leuleuasphisleuserleualaargasnleuprovalalathrpro

505560

aspproglymetpheprocysleuhishisserglnasnleuleuarg

65707580

alavalserasnmetleuglnlysalaargglnthrleugluphetyr

859095

procysthrserglugluileasphisgluaspilethrlysasplys

100105110

thrserthrvalglualacysleuproleugluleuthrlysasnglu

115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

alalysleuleumetaspprolysargglnilepheleuaspglnasn

180185190

metleualavalileaspgluleumetglnalaleuasnpheasnser

195200205

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210215220

thrlysilelysleucysileleuleuhisalapheargileargala

225230235240

valthrileaspargvalmetsertyrleuasnalaser

245250

<210>3

<211>63

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

alathrglyalaalaalathrthrcysthrthralaglythrcysala

151015

alacysglythrthrglycyscyscysthrthrglythrthrthrthr

202530

thralathrglyglythrcysglythralathralacysalathrthr

354045

thrcysthrthralacysalathrcysthralathrglycyscys

505560

<210>4

<211>591

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

agaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaa60

aacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttac120

ccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtg180

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cttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttc540

agaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcc591

<210>5

<211>197

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

argasnleuprovalalathrproaspproglymetpheprocysleu

151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

leuglugluproaspphetyrlysthrlysilelysleucysileleu

165170175

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180185190

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195

<210>6

<211>678

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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tctccgggtaaatgataa678

<210>7

<211>224

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

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151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

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100105110

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115120125

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<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

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metglnalaleuasnpheasnsergluthrvalproglnlysserser

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275280285

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325330335

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