一种喷雾冷冻干燥机辅助提取藻红蛋白的方法与流程

本发明涉及一种海洋微藻技术领域，具体涉及一种喷雾冷冻干燥机辅助提取藻红蛋白的方法。

背景技术：

紫球藻在众多的微藻品系中具有生物量产量高、高附加值产物丰富的特点，因为紫球藻细胞在生长过程中可以合成多种生物活性物质，如：藻红蛋白PE、胞外硫酸脂多糖、花生四烯酸ARA和二十碳五烯酸EPA等，在医药、化妆品、食品、保健品、纺织、印染、石油等行业具有广阔的应用前景。

近几年，随着天然产物越来越受人们的重视，藻红蛋白的价值逐渐被发掘，藻红蛋白是一种天然、水溶性极好的色素蛋白，作为紫球藻细胞的主要补光天线参与光合作用，在紫球藻细胞中的含量非常高。同时藻红蛋白还具有高荧光强度、稳定的物理性质、抗氧化性、清除自由基、高色度等优势，在食品、化妆品、药品等行业具有很广泛的用途，并且，藻红蛋白还可作为荧光标记物应用在分子生物学、临床医学等领域，比如它可以应用在光动力治疗肿瘤上，因其安全、天然的特性作为一种很好的光敏剂极具潜力。

作为高商业价值的紫球藻及其高附加值产物被大量的研究、生产和制备，通常生产紫球藻干藻粉需要尽可能的脱水。目前生产紫球藻干藻粉脱水的方法包括絮凝沉淀法、离心分离法、自然沉降法、膜过滤法等等，但是，因为紫球藻个体微小、培养需要大量的水、培养过程中细胞外包裹着一层厚厚的粘膜，导致粘度过高，不易沉降，给脱水带来了巨大的挑战，絮凝沉淀法、自然沉降法、膜过滤法往往因为藻液生物量浓度和粘度过高导致难以沉降、生产周期长、堵塞滤膜等问题；而离心分离法的设备要求高，一次离心的产量不高，需要多次繁杂的离心，给生产带来了较大的负担；目前，藻红蛋白的提取纯化方法多样化，如：液氮研磨提取法、超声波提取法、珠磨破碎提取法、冻融破碎提取法和盐析纯化法、超滤纯化法、柱层析纯化法等等，根据生产需求的不同，通常会选择合适的提取纯化方法从而更加符合能源高值化利用的发展要求。但是液氮研磨法、超声波破碎法、珠磨法等难以在工业上大规模实现，超滤纯化法、柱层析纯化法存在设备要求高等问题。

因此采用一种利用喷雾冷冻干燥机干燥紫球藻藻液辅助提取藻红蛋白的方法，将藻粉制备、藻红蛋白溶液制备等工艺高效优化结合在一起，对获取紫球藻中高附加值的藻红蛋白产品尤为重要。

技术实现要素：

本发明的主要目的是针对紫球藻干燥和藻红蛋白提取方面所存在的问题与不足，提供一种喷雾冷冻干燥机辅助提取藻红蛋白的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。

一种喷雾冷冻干燥机辅助提取藻红蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)培养获得高浓度藻液：在人工海水培养基(ASW)中培养紫球藻10～16天至高浓度时期(生物量8～12g/L)。

2)利用喷雾冷冻干燥制备紫球藻干藻粉：将体积为1000～2000mL的紫球藻藻液采用喷雾冷冻干燥机制成超细的紫球藻干藻粉，喷雾冷冻干燥的条件为：零下5℃～零下15℃，蠕动泵转速为11～20r/min,干燥时间为2h～5h。干燥结束后，收集干燥粉，过40吋 0.45mm孔径的筛子，即得超细的紫球藻干藻粉。

3)提取纯化：

第一步：将干藻粉与去离子水按一定质量体积比(1：3～1：10)利用机械搅拌装置混合搅拌均匀，搅拌速度为500r/min。

第二步：采用冻融法提取获得藻红蛋白，利用有机膜过滤设备制备藻红蛋白粗提液。冻融法是将混合的紫球藻藻液在-20℃下冷冻4h，在恒温25℃下解融4h，反复冻融2-5 次。将冻融之后的紫球藻藻液通过有机膜过滤设备，滤膜截留分子量分别为100KD～200KD，获得藻红蛋白粗提液。

第三步：采用一步纯化法纯化制备高浓度、高纯度的藻红蛋白溶液。具体步骤为：向藻红蛋白粗提液中添加饱和硫酸铵盐溶液(添加的同时利用机械搅拌装置搅拌)，使硫酸铵在藻红蛋白粗提液中的饱和度首先达到20％，静置4～6h；用有机膜过滤设备除杂后(滤膜截留分子量为100KD～200KD)，继续添加硫酸铵，使溶液饱和度达到50％～70％，静置4～6h；再用有机膜过滤设备过滤(滤膜截留分子量为10KD～50KD)，得到藻红蛋白沉淀和硫酸铵盐溶液，最后用去离子水反向冲洗滤膜获得高浓度(0.76～1.05g/L)、高纯度(PI值为1.51～2.21) 的藻红蛋白溶液。

4)保藏或应用：将获得的高浓度、高纯度的藻红蛋白溶液于4℃冰箱保藏或直接应用。

通过上述工艺步骤，能够直接获得高质量的紫球藻干藻粉和食品级纯度的藻红蛋白溶液，提高了生产效率，降低了生产工艺的繁杂。

本发明具有以下优点：

(1)操作工艺简单，生产效率高，生产成本低，环境污染小；

(2)直接将高浓度、高粘度的紫球藻藻液干燥成高质量的藻粉，克服了藻液难脱水、难沉淀、难干燥的难题；

(3)利用高质量的干藻粉快速高效的获得高纯度的食品级藻红蛋白溶液，减少了生产步骤缩短了生产周期，促进了微藻产业的发展，提高了紫球藻的附加值；

(4)产品得率好，质量高，干藻粉得率在80％以上，藻红蛋白浓度可达0.9g/L 以上以及纯度PI值在2.2以上，可适用于食品行业使用。

附图说明

图1为人工海水培养基中紫球藻的生长曲线图。

图2为经过喷雾冷冻干燥机干燥的紫球藻干藻粉的得率。

图3为经过喷雾冷冻干燥机干燥紫球藻藻液辅助提取的藻红蛋白溶液的浓度、纯度图。

图4为不同纯度的藻红蛋白溶液的紫外吸收光谱图。

具体实施方案

现以实验室实施为例，对本发明提供的一种喷雾冷冻干燥机辅助提取藻红蛋白的方法进行详细的说明。

实施例1

本实施例的一种喷雾冷冻干燥机辅助提取藻红蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)培养获得高浓度藻液：在人工海水培养基(ASW)中培养紫球藻10天至高浓度时期(生物量8.04g/L)。

2)利用喷雾冷冻干燥制备紫球藻干藻粉：将体积为1000mL的紫球藻藻液采用喷雾冷冻干燥机制成超细的紫球藻干藻粉，喷雾冷冻干燥的条件为：干燥温度为-5℃，蠕动泵转速为11r/min,干燥时间为2h。干燥结束后，收集干燥粉，过40吋0.45mm孔径的筛子，即得超细的紫球藻干藻粉。

3)提取纯化：

第一步：将干藻粉与去离子水按一定质量体积比(1：3)利用机械搅拌装置混合搅拌均匀，搅拌速度为500r/min。

第二步：采用冻融法提取获得藻红蛋白，利用有机膜过滤设备制备藻红蛋白粗提液。冻融法是将混合的紫球藻藻液在-20℃下冷冻4h，在恒温25℃下解融4h，反复冻融2 次。将冻融之后的紫球藻藻液通过有机膜过滤设备，滤膜截留分子量为100KD，获得藻红蛋白粗提液。

第三步：采用一步纯化法纯化制备高浓度、高纯度的藻红蛋白溶液。具体步骤为：向藻红蛋白粗提液中添加饱和硫酸铵盐溶液(添加的同时利用机械搅拌装置搅拌)，使硫酸铵在藻红蛋白粗提液中的饱和度首先达到20％，静置4h；用有机膜过滤设备除杂后(滤膜截留分子量为100KD)，继续添加硫酸铵，使溶液饱和度达到50％，静置6h；再用有机膜过滤设备过滤(滤膜截留分子量为10KD)，得到藻红蛋白沉淀和硫酸铵盐溶液，最后用去离子水反向冲洗滤膜获得高浓度(0.76g/L)、高纯度(PI值为1.51)的藻红蛋白溶液。

4)保藏或应用：将获得的高浓度、高纯度的藻红蛋白溶液于4℃冰箱保藏或直接应用。

实施例2

本实施例的一种喷雾冷冻干燥机辅助提取藻红蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)培养获得高浓度藻液：在人工海水培养基(ASW)中培养紫球藻12天至高浓度时期(生物量10.86g/L)。

2)利用喷雾冷冻干燥制备紫球藻干藻粉：将体积为1300mL的紫球藻藻液采用喷雾冷冻干燥机制成超细的紫球藻干藻粉，喷雾冷冻干燥的条件为：干燥温度为-8℃，蠕动泵转速为14r/min,干燥时间为3h。干燥结束后，收集干燥粉，过40吋0.45mm孔径的筛子，即得超细的紫球藻干藻粉。

3)提取纯化：

第一步：将干藻粉与去离子水按一定质量体积比(1：5)利用机械搅拌装置混合搅拌均匀，搅拌速度为500r/min。

第二步：采用冻融法提取获得藻红蛋白，利用有机膜过滤设备制备藻红蛋白粗提液。冻融法是将混合的紫球藻藻液在-20℃下冷冻4h，在恒温25℃下解融4h，反复冻融3 次。将冻融之后的紫球藻藻液通过有机膜过滤设备，滤膜截留分子量为130KD，获得藻红蛋白粗提液。

第三步：采用一步纯化法纯化制备高浓度、高纯度的藻红蛋白溶液。具体步骤为：向藻红蛋白粗提液中添加饱和硫酸铵盐溶液(添加的同时利用机械搅拌装置搅拌)，使硫酸铵在藻红蛋白粗提液中的饱和度首先达到20％，静置5h；用有机膜过滤设备除杂后(滤膜截留分子量为130KD)，继续添加硫酸铵，使溶液饱和度达到55％，静置5h；再用有机膜过滤设备过滤(滤膜截留分子量为20KD)，得到藻红蛋白沉淀和硫酸铵盐溶液，最后用去离子水反向冲洗滤膜获得高浓度(0.88g/L)、高纯度(PI值为1.86)的藻红蛋白溶液。

4)保藏或应用：将获得的高浓度、高纯度的藻红蛋白溶液于4℃冰箱保藏或直接应用。

实施例3

本实施例的一种喷雾冷冻干燥机辅助提取藻红蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)培养获得高浓度藻液：在人工海水培养基(ASW)中培养紫球藻14天至高浓度时期(生物量11.24g/L)。

2)利用喷雾冷冻干燥制备紫球藻干藻粉：将体积为1600mL的紫球藻藻液采用喷雾冷冻干燥机制成超细的紫球藻干藻粉，喷雾冷冻干燥的条件为：干燥温度为-12℃，蠕动泵转速为16r/min,干燥时间为4h。干燥结束后，收集干燥粉，过40吋0.45mm孔径的筛子，即得超细的紫球藻干藻粉。

3)提取纯化：

第一步：将干藻粉与去离子水按一定质量体积比(1：7)利用机械搅拌装置混合搅拌均匀，搅拌速度为500r/min。

第二步：采用冻融法提取获得藻红蛋白，利用有机膜过滤设备制备藻红蛋白粗提液。冻融法是将混合的紫球藻藻液在-20℃下冷冻4h，在恒温25℃下解融4h，反复冻融4 次。将冻融之后的紫球藻藻液通过有机膜过滤设备，滤膜截留分子量为160KD，获得藻红蛋白粗提液。

第三步：采用一步纯化法纯化制备高浓度、高纯度的藻红蛋白溶液。具体步骤为：向藻红蛋白粗提液中添加饱和硫酸铵盐溶液(添加的同时利用机械搅拌装置搅拌)，使硫酸铵在藻红蛋白粗提液中的饱和度首先达到20％，静置5h；用有机膜过滤设备除杂后(滤膜截留分子量为160KD)，继续添加硫酸铵，使溶液饱和度达到60％，静置5h；再用有机膜过滤设备过滤(滤膜截留分子量为30KD)，得到藻红蛋白沉淀和硫酸铵盐溶液，最后用去离子水反向冲洗滤膜获得高浓度(0.98g/L)、高纯度(PI值为2.17)的藻红蛋白溶液。

4)保藏或应用：将获得的高浓度、高纯度的藻红蛋白溶液于4℃冰箱保藏或直接应用。

实施例4

本实施例的一种喷雾冷冻干燥机辅助提取藻红蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)培养获得高浓度藻液：在人工海水培养基(ASW)中培养紫球藻16天至高浓度时期(生物量12.03g/L)。

2)利用喷雾冷冻干燥制备紫球藻干藻粉：将体积为2000mL的紫球藻藻液采用喷雾冷冻干燥机制成超细的紫球藻干藻粉，喷雾冷冻干燥的条件为：干燥温度为-15℃，蠕动泵转速为20r/min,干燥时间为5h。干燥结束后，收集干燥粉，过40吋0.45mm孔径的筛子，即得超细的紫球藻干藻粉。

3)提取纯化：

第一步：将干藻粉与去离子水按一定质量体积比(1：10)利用机械搅拌装置混合搅拌均匀，搅拌速度为500r/min。

第二步：采用冻融法提取获得藻红蛋白，利用有机膜过滤设备制备藻红蛋白粗提液。冻融法是将混合的紫球藻藻液在-20℃下冷冻4h，在恒温25℃下解融4h，反复冻融5 次。将冻融之后的紫球藻藻液通过有机膜过滤设备，滤膜截留分子量为200KD，获得藻红蛋白粗提液。

第三步：采用一步纯化法纯化制备高浓度、高纯度的藻红蛋白溶液。具体步骤为：向藻红蛋白粗提液中添加饱和硫酸铵盐溶液(添加的同时利用机械搅拌装置搅拌)，使硫酸铵在藻红蛋白粗提液中的饱和度首先达到20％，静置6h；用有机膜过滤设备除杂后(滤膜截留分子量为200KD)，继续添加硫酸铵，使溶液饱和度达到65％，静置4h；再用有机膜过滤设备过滤(滤膜截留分子量为50KD)，得到藻红蛋白沉淀和硫酸铵盐溶液，最后用去离子水反向冲洗滤膜获得高浓度(1.05g/L)、高纯度(PI值为2.21)的藻红蛋白溶液。

4)保藏或应用：将获得的高浓度、高纯度的藻红蛋白溶液于4℃冰箱保藏或直接应用

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应该被认为是说明性的而非限制性的。