肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的序列及其应用的制作方法

背景技术：
肠道病毒d组68型(enterovirusd68,ev-d68)属于小核糖核酸病毒科，最早于1962年在美国加利福利亚州的下呼吸道感染住院人的咽拭子样本中分离获得。ev-d68病毒感染所致的临床表现多样，从症状较轻的上呼吸道感染到严重的成人和儿童脑膜炎症状。研究表明，ev-d68在儿童中能引起急性迟缓性麻痹及脑神经功能性障碍。近年来，ev-d68病毒在中国及世界范围内均有流行。从2008年-2010年，ev-d68病毒在亚洲、欧洲、美国等地均有小范围流行。2014年12月，在全美47个州和哥伦比亚地区，有1152人被确诊为由ev-d68病毒引起的急性呼吸道感染。在我国，2014年8月，北京儿童医院的一个5岁女童被诊断为ev-d68病毒阳性，随后发展为严重的肺部感染。在中国，xiang等人通过对2006年8月-2010年4月的6942例与急性呼吸道感染(acuterespiratorytractinfection，arti)相关的成年病人(年龄≥15岁)的鼻拭、咽拭样本检测发现，其中130例样本为肠道病毒感染样本，而感染的肠道病毒以ca21和ev-d68为主，ev-d68感染比例为10％，然而，此报道缺乏儿童arti的数据。lu等人对2009年-2012年间的41例儿童肠道病毒感染病例样本检测发现，ev-d68感染病例为7例，比例达17.1％。xiao等人的另一项研究对中国2012-2014年重庆地区的1876个呼吸道感染的(respiratorytractinfections,rtd儿童的鼻拭子样本进行检测，发现19例ev-d68感染样本，其中13例样本是在2014年9月到10月检测出，并从样本中分离获得13株病毒，进化树分析发现这13株病毒与2014年的美国主要流行株具有高度同源性。目前，尚无针对ev-d68的有效抗病毒药物及预防性疫苗，所以对人群抗ev-d68抗体的血清学检测，以及研发有效的ev-d68治疗性药物、预防性疫苗是控制ev-d68病毒感染与流行的关键。肠道病毒d68型vp1基因，不仅可以作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，而且也可以依据vp1基因对小rna病毒科内不同属进行分类。vp1是ev-d68的主要免疫显性衣壳蛋白，vp1基因全长927bp，含有病毒的主要抗原表位。

技术实现要素：

本发明的目的在于根据现有技术的不足，制备一种针对evd68-vp1的单克隆抗体，提供单克隆抗体的可变区核苷酸序列及氨基酸序列。并用流式细胞术对抗体进行检测。

本发明的技术方案为：

肠道病毒d组68型vp1单克隆抗体的可变区序列，所述的抗体包括重链可变结构域vh和轻链可变结构域vl；其中，重链可变结构域vh的核苷酸序列为seqidno：1，氨基酸序列为seqidno：2；重链可变结构域vh依次包含高变区frh1、cdrh1、frh2、cdrh2、frh3、cdrh3和frh4，所述的核苷酸序列依次为seqidno：3、5、7、9、11、13、15，所述氨基酸序列依次为seqid：4、6、8、10、12、14、16；轻链可变结构域vl的核苷酸序列为seqidno：17，氨基酸序列为seqidno：18；轻链可变结构域vl依次包含高变区frl1、cdrl1、frl2、cdrl2、frl3、cdrl3和frl4，所述的核苷酸序列依次为seqidno：19、21、23、25、27、29、31所述氨基酸序列依次为seqid：20、22、24、26、28、30、32。

一种抗体或抗原结合片段或多肽，能与evd68-vp1结合，其包含肠道病毒d组68型vp1单克隆抗体的可变区序列中所述的任一种氨基酸序列。

一种抗体或抗原结合片段或多肽，能与evd68-vp1结合，其序列与所述重链和轻链序列至少有91％和64％的序列相似性。

一种基因工程抗体，它所包含的重链和轻链可变区序列与所述的可变区序列一致或具有至少64％的相似性。

一种核酸，包含上述的核苷酸序列，包括seqid:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31。

一种抗体或抗原或核酸在研究evd68时用流式细胞术检测免疫原性中的应用。。

本发明的有益效果：本发明设计了一种高产量的重组人ev-d68vp1的方法，并产生了一种高亲和力的抗vp1单克隆抗体，获得了该抗体的可变区核苷酸序列及氨基酸序列，具有很好的基础研究和临床应用的潜力。

附图说明：

图1.evd68-vp1蛋白基因pcr扩增产物电泳图；其中m:dnamarker；1:pcr产物；

图2.evd68-vp1蛋白基因pcr扩增产物和重组表达质粒pgex6p-1双酶切胶图(bamh1/xhoi)；其中m:dnamarker；1:pcr产物；2：载体；

图3.evd68-vp1重组蛋白试表达；其中m:蛋白质marker；1:诱导前；2：诱导后；

图4.evd68-vp1重组蛋白纯化产物的westernblot分析；其中m:蛋白质marker；1，2：融合蛋白；

图5.流式细胞术检测抗体的特异性结合情况。

具体实施方式：

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，这些附图和实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。在本发明的构思前提下对本发明制备单克隆抗体及其制备方法的简单改造，都属于本发明要求保护的范围。

以肠道病毒d组68型fermon株结构蛋白vp1基因为模板，设计引物扩增出目的片段vp1，将其连接至大肠杆菌表达载体pgex6p-1上。将重组表达载体pgex6p-1-vp1转化大肠杆菌表达菌株rosetta(de3)，对该工程菌用iptg进行诱导表达。菌体裂解后用sds-page电泳、western-blot鉴定融合蛋白；对表达菌体进行高压破碎后用8m尿素进行变性，变性蛋白进行亲和层析纯化。通过将全长蛋白作为免疫原多次免疫balb/c小鼠，待其血清效价达到达到融合要求，取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合制备抗vp1单克隆抗体，在分子水平上进行抗体重链、轻链可变区基因的调取并用流式细胞术鉴定抗体特异性。

实施例1：

vp1蛋白基因的克隆：

使用聚合酶链式反应(pcr)和dna聚合酶分别从先前构建的含有vp1基因的质粒扩增vp1dna片段：95℃2分钟，30个循环(95℃20秒，57℃20秒和72℃20秒)，最后在72℃延伸10分钟。引物1cgggatccttaaaccacttacatggagc和引物2ccgctcgagttagtgatgatgatgatgatgatgatgatgatgggtggttactatgttgtgagg用于vp1的扩增。pcr扩增产物依次用1％琼脂糖凝胶(biowest)电泳分析(如图1所示)，用bamh1/xhoi限制酶(neb)双重消化(酶切后验证如图2所示)，最后克隆到pgex6p-1(novagen)中。将最终的构建体命名为pgex6p-1-vp1，将其转化到大肠杆菌菌株dh5α感受态细胞(lifetechnologies)中，分别将其涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的(lb)琼脂上并在37℃过夜。第二天，使用单菌落接种5mllb在培养管中含有50μg/ml氯霉素抗性的培养基中，在37℃下以220rpm振荡培养过夜，随后进行测序。

实施例2：蛋白的表达与纯化

将pegx6p-1-vp1表达质粒转化大肠杆菌rosseta(de3)感受态细胞，将菌落接种于含有50μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的的lb培养基中。在37℃，220rpm下培养过夜。当培养物的od600达到0.4-0.6时，加入iptg至终浓度为0.6mm。在16℃温育16-18小时后，以4000rpm离心20分钟收获细菌沉淀，用裂解缓冲液中的高压破碎器破碎细胞。(裂解缓冲液：50mmtris，300mmnacl，10mm咪唑，1.4mmβ-巯基乙醇，ph7.8)。在4℃以18000rpm离心40分钟后，收集澄清的上清液并用8m尿素(ph7.8)使包涵体蛋白质变性。然后离心，收集上清液用于纯化。根据his基因融合系统手册，使用ni-nta琼脂糖(gehealthcare，usa)纯化蛋白质。用50ml洗涤缓冲液(洗涤缓冲液：50mmtris，300mmnacl，20mm咪唑，1.4mmβ-巯基乙醇，8m尿素，ph7.4)连续洗涤十次以上，10ml洗脱缓冲液进行洗脱(洗脱缓冲液：50mmtris，300mmnacl，500mm咪唑，1.4mmβ-巯基乙醇，8m尿素，ph7.4)。使用sds-page(如图3,4所示：分别为试表达和蛋白纯化胶图)和nanodrop测量蛋白质纯度和浓度。

实施例3：evd68-vp1单克隆抗体的制备

1.动物免疫

1.1选取balb/c雌鼠4只，可购买4周龄小鼠，饲养1-2周内注射抗原；

1.2动物免疫：

初免：第1天，200ug抗原/只老鼠+同体积弗式完全佐剂，用注射器相互注射的方式形成油包水化合物，皮下多点注射；

二免：第14天，200ug抗原/只老鼠+同体积弗式不完全佐剂，用注射器相互注射的方式形成油包水化合物，皮下多点注射；

三免：第28天，200ug抗原/只老鼠+同体积弗式不完全佐剂，用注射器相互注射的方式形成油包水化合物，皮下多点注射；

尾血检测：第35-36天，尾静脉采集约20ul尾血，室温30min后，5000rpm离心5min，弃血细胞沉淀，吸取血清，用于elisa检测效价；

四免：第42天，200ug抗原/只老鼠+同体积弗式不完全佐剂，用注射器相互注射的方式形成油包水化合物，皮下多点注射；

1.3效价检测：酶联免疫吸附法(elisa)

包被：10ug抗原+10ml包被液(1.6gnaco3+2.92gnahco3+100ml去离子水)，混匀，100ul/孔铺elisa板，37°孵育2h；

封闭：包被好的板子吸弃抗原包被液，直接加入封闭液(5％脱脂奶粉+包被液)300ul/孔，37°温育2h后洗板3次；

检测：血清和1xpbs以1:1000配制，混匀，吸150ul稀释液加入第一个孔，第2-8孔均加入100ul1xpbs，从第一个孔吸50ul液体加入第二孔，吸吹10次后吸取50ul到第三孔，吸吹10次后吸50ul到第四孔，依次吸吹到第7孔后吸取50ul丢弃，第八孔作为阴性对照；37°孵育1h后去离子水洗3次，加二抗(羊抗鼠igg-hrp1:10001xpbs)100ul/孔，37°孵育30min后去离子水洗3次，加入显色液(依照试剂盒说明书使用)，100ul/孔，5-10min，观察颜色变化。

2.细胞融合

2.1细胞融合：选取1只小鼠终加强，与peg常规融合方法进行细胞融合。共铺6块板，第8天进行细胞上清检测；

2.2融合筛选：于融合后的第3，6天换液处理，于融合后第7-14天筛选融合细胞：采用间接elisa方法对融合细胞上清筛选，经过两次筛选最终确认阳性细胞孔进行单克隆化。

3.亚克隆及建株

采用有限稀释方法对所有筛选确认的阳性细胞株进行亚克隆，待细胞集落生长至显微镜视野1/3时吸取上清进行筛选；待亚克隆阳性率达到100％时，正式建株，每株细胞冻存2支以上。

实施例4：通过elisa检测抗体的效价

1.包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

2.加样：加一定稀释的抗体0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中。

3.洗涤：加入0.1ml新鲜稀释的酶标第二抗体，37℃孵育30-60分钟，洗涤，最后一遍用ddw洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入0.1mltmb底物溶液，37℃反应10分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入0.05ml2m硫酸。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测o·d值：在elisa检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔o·d值，若大于规定的阴性对照od值的2.1倍，即为阳性。

实施例5：流式细胞术检测抗体的免疫原性

1、细胞的收集

rd细胞弃掉培养基，用pbs清洗两次，加入0.5ml0.25％胰酶-edta放置细胞培养箱中消化1min用dmem(10％fbs)终止消化，细胞计数收集2x10⁶个细胞。此时，需取两部分细胞，一部分作为空白对照，另一部分为测定样品。每部分1x10⁶个细胞。

2、细胞清洗

将收集细胞通过离心机离心1000rpm离心5min，吸弃上层培养基(注：此过程最好先用1ml枪头吸取大部分液体，再用200ul枪头小心吸取剩余液体，防止操作过程中将细胞吸走)，加入2mlpbs重悬细胞(轻轻吹打细胞清洗)，再次离心5min，吸弃上清液体，再重复清洗一次。

3、细胞表面封闭

封闭是为了抗体不和细胞进行非特异性结合，造成假阳性现象。封闭液，采用pbs(2％fbs)。加入0.5ml封闭液，4度冰箱封闭30分钟。离心，弃上清，加入100ulpbs(2％fbs)，此过程仍采用封闭液体系的pbs可以有效阻止假阳性产生，同时加入20ul单克隆抗体(10μg/ml)和无关抗体(sftsv-4h1,10μg/ml)一起孵育30分钟，无关抗体作为阴性对照。用pbs洗涤两次后，加入fitc缀合的绵羊抗小鼠抗体(sungenebiotech；稀释度1：100)，并将细胞在黑暗中再孵育30分钟。

4、再次清洗

孵育过程结束后，1000rpm离心5min，吸弃上清，加入2mlpbs轻轻重悬吹打细胞，清洗2次如第2步过程所述。最终加入300ulpbs上机。

从图5中我们可以清楚地看到单克隆抗体检测到肠道病毒感染的高阳性率，可以清楚地区分感染细胞和未感染细胞。

实施例6：抗evd68-vp1单克隆抗体重轻链可变结构域的基因测序及分析

用trizol法提取杂交瘤细胞样品的rna，反转录后获得cdna，扩增并获得重链和轻链可变区，将扩增产物进行文库构建并进行质量qc，使用miseq2x300pe进行高通量测序，通过生物信息学分析，与数据库进行比对。测序结果显示，成功获得杂交瘤细胞株抗体可变结构域基因。分析结果表明：杂交瘤细胞株抗体重链可变结构域vh的核苷酸序列为seqidno：1，氨基酸序列为seqidno：2；重链可变结构域vh依次包含高变区frh1、cdrh1、frh2、cdrh2、frh3、cdrh3和frh4，所述的核苷酸序列依次为seqidno：3、5、7、9、11、13、15，所述氨基酸序列依次为seqidno：4、6、8、10、12、14、16；轻链可变结构域vl的核苷酸序列为seqidno：17，氨基酸序列为seqidno：18；轻链可变结构域vl依次包含高变区frl1、cdrl1、frl2、cdrl2、frl3、cdrl3和frl4，所述的核苷酸序列依次为seqidno：19、21、23、25、27、29、31所述氨基酸序列依次为seqid：20、22、24、26、28、30、32。

<110>天津大学

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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