植物干旱诱导型合成启动子SP16及其应用的制作方法

本发明属于生物技术与基因工程领域，具体涉及一种植物干旱诱导型启动子sp16及其应用。

背景技术：

人工合成启动子是按照天然合成启动子的元件组成和序列结构特点，人工设计的一段dna序列。设计较好的人工启动子可实现对基因更为精细的调控，不仅可以控制基因的表达强度，还可以对基因的表达部位和表达时间进行准确的控制。未来植物生物技术领域，可通过正确设计和使用人工合成启动子，精心调控单个基因或多个基因的表达，使其直接响应特定的环境、生理或化学等信号。

2012年，koschmann等人在plantphysiology上发表了一篇文章，里面详细阐述了一种人工合成启动子的设计策略。首先，利用拟南芥基因芯片数据注释的pathoplant数据库，锚定到732个受病原菌刺激上调表达两倍以上的基因，聚类分成510个上调基因group。接着，利用best软件鉴定这510个上调基因group中基因前1000bp的上游序列中的保守序列元件，综合获得了443个motif。然后，使用stmp软件对motif进行分类，分成了37个group。最后，筛选顺式元件，构建人工合成启动子，进行实验分析诱导响应基因的表达，发现了25个诱导响应序列。采用类似的策略，本团队通过将大豆逆境转录组测序数据与genbank中已有大豆逆境表达谱数据相结合，筛选出受干旱调控的目的基因63个，然后将它们列表进行cluster模块分类。获得4个cluster后，利用motif鉴定软件分别对每个cluster进行motif的鉴定，最终获得46个与逆境调控相关的启动子共有表达元件。在此工作基础上，根据文献和已有载体的相关信息，我们获得了可用于设计人工启动子的核心序列rd29acorelittlemini和35scorelittlemini，根特异性元件rootspecificmotif以及增强子序列martbox、vr-acs15'utr、gmsm8intron3、fs-(tgacg)2等。

顺式作用元件和核心序列可作为人工合成启动子构建的基本单元，组合成更为广谱或功能强大的人工启动子。目前有许多研究者都将特定功能的顺式元件以2聚体、4聚体或6聚体的形式，再添加上启动子核心序列，构建而成了有功能的启动子。rushton等曾利用w1-box、w2-box、gcc元件、jere元件等组合成多种四聚体人工合成启动子。mullerandsheen直接将细胞分裂素双组分产物传感器（two-component-outputsensor，tcs）基因启动子元件中的核心元件重复6次设计了人工合成启动子，经过验证，该合成启动子对不同的细胞分裂素具有广谱响应性。

转基因分子育种已经成为提高作物抗逆能力的一个有效方法。在转基因拟南芥和烟草等植物中，利用胁迫响应顺式作用元件：g-box、abre、dre、crt、aba、cbfs、abf等，构建合成许多人工合成启动子，发现这些启动子可以在逆境条件下驱动靶基因在转基因植物的不同组织部位表达，或者受某种逆境信号诱导而调控基因的表达，比植物中的天然启动子具有更高的调控能力，说明这些合成启动子在提高作物的抗逆性方面具有应用价值，或可提高极端环境下作物的相对产量。

技术实现要素：

本发明目的是为解决天然启动子不能对基因进行精细调控的问题，而提供一种植物干旱诱导型启动子sp16。

一种植物诱导型启动子sp16，它的核苷酸序列如seqidno.1所示。

一种植物表达载体，它是在载体质粒中插入了如seqidno.1所示的核苷酸序列；

所述的载体质粒为pcambia3301。

所述的一种植物诱导型启动子sp16在培育抗干旱转基因植物的应用；

所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

发明详述：本发明sp16属于人工合成启动子，是以2个拷贝的erf1元件、2个拷贝的abfs元件、1个拷贝的abre元件、2个拷贝的rootspecificmotif、2个拷贝的abrelike元件、2个拷贝的rootspecificmotif组成串联单元，每两个元件中间以10个碱基的特异序列间隔，将以上设计片段再与一段minipromoter序列连接构建而成，命名为syntheticpromoter16，简称为sp16。

本发明提供了一种植物诱导型启动子sp16，它的核苷酸序列如seqidno.1所示；一种植物表达载体，它是在载体质粒中插入了如seqidno.1所示的核苷酸序列；以及启动子sp16在培育抗干旱转基因植物的应用；利用大豆发状根遗传转化体系，鉴定出sp16启动子受干旱胁迫诱导，即驱动gus报告基因在干旱胁迫下表达，未胁迫条件下gus基因不表达，且表达强度与camv35s启动子相当；本发明人工设计构建的一种植物干旱诱导型启动子sp16，可直接应用于农作物转基因抗旱育种。

附图说明

图1为sp16与gus融合表达载体图；

图2为转sp16基因大豆发状根在干旱胁迫前后的gus蛋白染色情况。

具体实施方式

实施例1植物干旱诱导型启动子sp16的设计

通过将大豆逆境转录组测序数据与genbank中已有大豆逆境表达谱数据相结合，筛选出受干旱调控的目的基因63个，然后将它们列表进行cluster模块分类；获得4个cluster后，利用motif鉴定软件分别对每个cluster进行motif的鉴定，最终获得46个与逆境调控相关的启动子共有表达元件；选择其中的erf1、abfs、abre、abrelike、rootspecificmotif为基本顺式元件，以2个拷贝的erf1元件、2个拷贝的abfs元件、1个拷贝的abre元件、2个拷贝的rootspecificmotif、2个拷贝的abrelike元件、2个拷贝的rootspecificmotif组成串联单元，每两个元件中间以10个碱基的特异序列间隔，将以上设计片段再与一段131bp的rootbaseminipromoter序列连接构建而成syntheticpromoter16，简称为sp16，其核苷酸序列为seqidno.1序列。

实施例2启动子sp16表达载体的构建

通过人工合成方法将sp16（seqidno.1）序列合成到载体puc57上，并在序列两端添加酶切位点sacl和ncoi；将puc57-sp16载体和pcambia3301质粒，分别用sacl和ncoi进行双酶切，分别回收酶切产物后，经连接、转化、鉴定，获得表达载体pcambia3301-sp16（图1）；将载体pcambia3301-sp16转化至发根农杆菌k599中，用于浸染大豆子叶节。

实施例3转sp16基因大豆发状根的获得

利用已建立的大豆发状根诱导体系，将含有pcambia3301-sp16载体的发根农杆菌k599侵染大豆子叶节，经诱导和鉴定，获得转基因阳性发状根后；进行干旱胁迫处理；具体方法如下：

（1）用次氯酸钠和浓盐酸1:1混后，对大豆种子进行氯气灭菌过夜；

（2）用无菌水清洗大豆并种到高温高压灭过菌的蛭石中，用1/4霍格兰溶液保湿；

（3）在人工气候室中25℃、光照16小时、培养6天左右；

（4）将含重组质粒pcambia3301-sp16的发根农杆菌k599在28℃培养箱过夜培养；

（5）用刀片刮菌收集菌体；

（6）将发根农杆菌注射到临近子叶的下胚轴处；

（7）注射完成后需保水5~6天；

（8）然后用灭过菌的蛭石将伤口盖住，并保水；

（9）培养15天左右去除真实根，在蛭石中缓苗3天左右后移到霍格兰培养液中培养。

实施例4干旱胁迫处理及gus组织化学染色

培养7天的大豆复合植株（根部为转sp16的发状根，地上为非转基因的大豆植株），用6%peg6000模拟干旱胁迫处理，处理时间为72小时；剪取胁迫处理的大豆发状根，通过gus染色对诱导出的大豆发状根进行染色，染色方法参照中科瑞泰生物科技有限公司的gus染色试剂说明书；染色后避光室温培养6-10小时，然后用无水乙醇或80%的丙酮脱色3次左右，直至阴性对照变为白色为止，然后统计染色情况并拍照留存；结果显示（图2）：转camv35s启动子的根在未胁迫与干旱胁迫后均被染成了蓝色，说明camv35s启动子驱动的gus报告基因表达不受干旱诱导，而sp16启动子驱动的gus基因只在干旱胁迫处理后表达，且其gus染色结果与camv35s启动子驱动的gus染色情况相当，表明sp16为干旱诱导型启动子，且其表达活性近似于camv35s启动子，适合作为利用植物基因工程手段培育抗旱作物新品种的候选启动子。

序列表

<110>吉林农业大学

<120>植物干旱诱导型合成启动子sp16及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>336

<212>dna

<213>syntheticpromoter16

<400>1

gccgcctcataacgctgccgcctcataacgctcacgtggctcataacgctcacgtggctc60

ataacgcttacgtggctcataacgctatatttcataacgctatatttcataacgctacgt120

gtcttcataacgctacgtgtctcataacgctatatttcataacgctatatttcataacgc180

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