植物干旱诱导型合成启动子SP18及其应用的制作方法

本发明属于生物技术与基因工程领域，具体涉及一种植物干旱诱导型启动子sp18及其应用。

背景技术：

目前，我国农作物品种选育主要依靠传统育种技术进行选育。多年来，人们通过广泛杂交选育，育成了大批高产优质品种，为农产品生产和国家粮食安全做出了重要贡献。但随着重要基因资源的逐步挖掘，传统育种的瓶颈效应日益显现，新品种选育的困难越来越多。目前，生物技术已成为新的科技革命的主体之一，生物产业正推动农业生物技术的飞速发展。转基因技术是现有生物育种技术中发展最快、效率最高的针对作物单一性状进行改良的技术。2011年全球转基因作物种子销售额约130亿美元，而转基因作物商业化最终产品年产值为1600亿美元。另外，分子标记辅助育种也可以将1-3个少数基因进行遗传改良，从而获得具有目标性状的作物新品种。另外，近些年人们针对复杂性状的基因调控网络“模块化”的特点开发了新的模块育种技术，通过发掘和解析控制农作物复杂性状形成的调控“模块”并将它们有效地耦合，从而解决复杂性状育种难题。以这些育种新技术为代表的作物分子育种将是未来生物育种的发展方向。

启动子是基因的一个重要组成部分，控制基因的表达起始、表达部位和表达强度，它是作物分子育种的必备工具之一。高等植物基因启动子主要可以分为三种类型：组成型启动子、组织特异性启动子与诱导型启动子。组成型启动子可驱动基因在植物的大部分组织中都表达，其中应用最广泛的是从花椰菜花叶病毒中克隆得到的camv35s启动子。组织特异性启动子只能在植物的某个特定组织中驱动基因表达，比如根特异性表达启动子和种子特异性启动子等。这些启动子的应用可以调控植物特定组织中的成分，比如用植物种子特异性启动子来增加作物种子中的油分和蛋白质含量等。而诱导型启动子在正常生长条件下几乎不表达，在特定信号刺激诱导条件下才可以驱动目的基因的表达。诱导型启动子的应用可以避免基因在不必要的组织或正常条件下过量表达而给植物带来的资源浪费和发育影响，更加合理利用植物自身能量，达到调节植物信号并使植物适应刺激因素所带来的影响。因此，诱导型启动子的开发和利用具有重要意义。

人工合成启动子是根据天然启动子的特点，使用启动子功能元件和核心序列，通过不同的组合或突变构建而成的启动子，可实现对基因的精细调控。在原核生物中，人们设计出细菌的合成启动子来调控基因的表达水平而提高番茄红色素的生产；在真核生物中，研究者利用酵母的合成启动子文库来调节甘油的产量；在哺乳动物细胞中，tornoe等人设计的嵌合启动子能够使靶基因的转录活性增加十倍。rushton等用jere、gcc元件、w1-box、w2-box等元件为基本功能单元，通过元件的4聚体形式的不同组合设计出多种人工启动子，用这些启动子驱动报告基因gus在转基因植物中进行功能鉴定表明，不同启动子的本底表达水平、诱导因子和诱导程度均存在明显差别。因此，通过逆境响应元件的自由组合或序列突变，再与核心启动子序列结合，有望设计出逆境特异性诱导、表达活性强、启动速度快的人工合成启动子，为转基因工程育种提供新的有力工具。

技术实现要素：

本发明目的是为解决天然启动子不能对基因进行精细调控的问题，而提供一种植物干旱诱导型启动子sp18。

一种植物诱导型启动子sp18，它的核苷酸序列如seqidno.1所示。

一种植物表达载体，它是在载体质粒中插入了如seqidno.1所示的核苷酸序列；

所述的载体质粒为pcambia3301。

所述的一种植物诱导型启动子sp18在培育抗干旱转基因植物的应用；

所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

发明详述：本发明sp18属于人工合成启动子，它是以e2fvaraiant、ravi、abre、cbf1、rootspecificmotif、g-box、rootspecificmotif为基本顺式元件，每个元件串联重复2次，两元件中间以10个碱基的特异序列间隔，将以上设计片段再与一个131bp的rootbaseminipromoter序列连接构建而成，命名为syntheticpromoter18，简称为sp18。

本发明提供了一种植物诱导型启动子sp18，它的核苷酸序列如seqidno.1所示；一种植物表达载体，它是在载体质粒中插入了如seqidno.1所示的核苷酸序列；以及启动子sp18在培育抗干旱转基因植物的应用；在大豆发状根转化体系中鉴定sp18启动子驱动报告基因gus的表达情况表明，sp18启动子可以受干旱胁迫所诱导，且表达强度与camv35s启动子相当。

附图说明

图1为sp18与gus融合表达载体图；

图2为转sp18基因大豆发状根在干旱胁迫前后的gus蛋白染色情况。

具体实施方式

实施例1植物干旱诱导型启动子sp18的设计

通过将大豆逆境转录组测序数据与genbank中已有大豆逆境表达谱数据相结合，筛选出受干旱调控的目的基因63个，然后将它们列表进行cluster模块分类。获得4个cluster后，利用motif鉴定软件分别对每个cluster进行motif的鉴定，最终获得46个与逆境调控相关的启动子共有表达元件。选择其中的e2fvaraiant、ravi、abre、cbf1、rootspecificmotif、g-box、rootspecificmotif为基本顺式元件，每个元件串联重复2次，两元件中间以10个碱基的特异序列间隔，将以上设计片段再与一个131bp的rootbaseminipromoter序列连接构建而成，命名为syntheticpromoter18，简称为sp18，其核苷酸序列为seqidno.1序列。

实施例2启动子sp18表达载体的构建

通过人工合成方法将sp18（seqidno.1）序列合成到载体puc57上，并在序列两端添加酶切位点sacl和ncoi；将puc57-sp18载体和pcambia3301质粒，分别用sacl和ncoi进行双酶切，分别回收酶切产物后，经连接、转化、鉴定，获得表达载体pcambia3301-sp18（图1）；将载体pcambia3301-sp18转化至发根农杆菌k599中，用于浸染大豆子叶节。

实施例3转sp18基因大豆发状根的获得

利用已建立的大豆发状根诱导体系，将含有pcambia3301-sp18载体的发根农杆菌k599侵染大豆子叶节，经诱导和鉴定，获得转基因阳性发状根后；进行干旱胁迫处理；具体方法如下：

（1）用次氯酸钠和浓盐酸1:1混后，对大豆种子进行氯气灭菌过夜；

（2）用无菌水清洗大豆并种到高温高压灭过菌的蛭石中，用1/4霍格兰溶液保湿；

（3）在人工气候室中25℃、光照16小时、培养6天左右；

（4）将含重组质粒pcambia3301-sp18的发根农杆菌k599在28℃培养箱过夜培养；

（5）用刀片刮菌收集菌体；

（6）将发根农杆菌注射到临近子叶的下胚轴处；

（7）注射完成后需保水5~6天；

（8）然后用灭过菌的蛭石将伤口盖住，并保水；

（9）培养15天左右去除真实根，在蛭石中缓苗3天左右后移到霍格兰培养液中培养。

实施例4干旱胁迫处理及gus组织化学染色

培养7天的大豆复合植株（根部为转sp18的发状根，地上为非转基因的大豆植株），用6%peg6000模拟干旱胁迫处理，处理时间为72小时；剪取胁迫处理的大豆发状根，通过gus染色对诱导出的大豆发状根进行染色，染色方法参照中科瑞泰生物科技有限公司的gus染色试剂说明书；染色后避光室温培养6-10小时，然后用无水乙醇或80%的丙酮脱色3次左右，直至阴性对照变为白色为止，然后统计染色情况并拍照留存；结果显示（图2）：转camv35s启动子的根在未胁迫与干旱胁迫后均被染成了蓝色，说明camv35s启动子驱动的gus报告基因表达不受干旱诱导，而sp18启动子驱动的gus基因只在干旱胁迫处理后表达，且其gus染色结果与camv35s启动子驱动的gus染色情况相当，表明sp18为干旱诱导型启动子，且其表达活性近似于camv35s启动子，适合作为利用植物基因工程手段培育抗旱作物新品种的候选启动子。

序列表

<110>吉林农业大学

<120>植物干旱诱导型合成启动子sp18及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>417

<212>dna

<213>syntheticpromoter18

<400>1

tctcccgcctcataacgcttctcccgcctcataacgctcacctgtcataacgctcacctg60

tcataacgcttacgtggctcataacgcttacgtggctcataacgcttggccgactcataa120

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