一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用与流程

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，是芽孢杆菌属的一种，cas号68038-70-0。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。

中国专利文献cn109161506a(申请号201811098313.x)公开了一株枯草芽孢杆菌及其应用，涉及生物防治植物病害领域。该菌株为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)yt1004，保藏编号为cgmccno.14672。本发明还公开了含有上述菌株的生物防治制剂及其制备方法。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料防治作物根结线虫病害，包括黄瓜根结线虫、西红柿根结线虫、大姜根结线虫、甜瓜根结线虫等一种或几种。

中国专利文献cn109337841a(申请号201811350457.x)公开了一株保藏编号为cgmccno.14220具有高效抑菌能力的枯草芽孢杆菌bys2；所述的枯草芽孢杆菌bys2能够耐高温、耐酸、耐胆盐，不仅能适应胃肠道内环境，而且对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌具有显著的抑制作用；枯草芽孢杆菌bys2作为饲料添加剂，能提高动物体抗病原微生物感染能力即抗病能力(p<0.05)，显著促进肉鸡生长性能，提高养殖效益；同时具有安全、高效、益生的特点，对动物体无毒副作用。

本领域技术人员已熟知枯草芽孢杆菌可以通过消耗游离氧来实现竞争性抑制相关致病菌，从而实现灭杀致病菌的目的，因此，枯草芽孢杆菌的缺氧耐受性直接会影响枯草芽孢杆菌在特定环境下的抑菌效果，因此，寻找低氧耐受特性高的枯草芽孢杆菌是提高以枯草芽孢杆菌作为主要抑菌成分的饲料添加剂的主要途径之一。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。

本发明技术方案如下：

一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)bsbc01，于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号cgmccno.17239。

上述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)bsbc01的培养方法，步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)bsbc01划线接种于lb固体培养基平板上35～38℃活化培养20～28h，制得活化菌株；

(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于lb液体培养基中，35～38℃、180～220rpm振荡培养16～20h，制得种子液；

(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，37℃培养8h，制得初级发酵液；

(4)将步骤(3)制得的初级发酵液按体积百分比5～8％的接种量接种到发酵培养基中，35～38℃培养20～28h，制得发酵液。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，液体培养基组分如下：

玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，kh2po40.03％，k2hpo40.01％，cacl20.01％，余量水，ph7.0～7.2。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，所述发酵培养基每升组分如下：

玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，kh2po40.03％，k2hpo40.01％，cacl20.01％，余量水，ph7.0～7.2。

上述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)bsbc01在制备动物饲料添加剂中的应用。

一种动物饲料，将上述发酵液按饲料总重量0.05％～0.2％的比例与日常饲料混合均匀，即可。

根据本发明优选的，所述发酵液的菌体浓度为(2～8)×10⁹cfu/ml。

有益效果

本发明首次公开了一种具有从青藏高原养殖区筛选获得的枯草芽孢杆菌，该菌较现有已知枯草芽孢杆菌具有显著的低氧耐受特性，作为动物饲料添加剂较现有枯草芽孢杆菌具有更好的应用效果。

附图说明

图1是实施例1所述不同菌株在低氧环境条件下生长的结果照片；

图2是实施例3所述在相同条件下施用本申请菌株和枯草芽孢杆菌cmcc63501后，利用麦康凯琼脂培养基定向分离畜牧动物肠道病害菌的培养结果照片；

图中：左图为施用枯草芽孢杆菌cmcc63501结果图；右图为施用本申请所述枯草芽孢杆菌结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所述的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)bsbc01，于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号cgmccno.17239；

实施例1

取自青藏高原牦牛散养区土壤，将样品进行10倍梯度稀释，分别涂布在固体lb培养基和固体tsb培养基上进行培养，48小时后将长出的单菌落转接至液体培养基，继续培养24小时。涂布至固体lb培养基进行纯培养。

随机选取1000个单克隆进行抑菌杀菌实验检测。用到的致病菌种属为：胡萝卜软腐欧文氏菌(erwiniacarotovora)，胡萝卜果胶杆菌(pectobacteriumcarotovorum)，铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosapao1)，水稻致病菌布克氏菌(burkholderiaglumae)，水稻谷枯病菌(burkholdriaglumae)，解淀粉欧文氏菌(erwiniaamylovora)，玉米细菌性枯萎病菌(pantoeastewartiissp.stewartii)；其中具有窄谱杀菌活性的菌株共39株，具广谱杀菌活性的菌株12株，将具有最强抑菌杀菌活性的1株菌株进行测序，定名为枯草芽孢杆菌bsbc。

通过分析芽孢杆菌bsbc生长特性结果可知，在耐盐性方面，bsbc的耐盐性较强，在nacl的质量百分比含量为12％的培养基条件下生长良好，在生长温度方面bsbc能耐受低温及高温环境，可以在4℃～45℃条件下生长；在耐酸碱性方面，可以适应ph在5.5～9.0的生长环境，金属离子对bsbc的生长影响不大。需要特别指出的优势是，bsbc低氧耐受特性尤为突出，利用微需氧产气袋对bsbc与之前已报道的枯草芽孢杆菌atcc6633和cmcc63501(与背景技术中提及的yt1004同源性为100％)进行比较，进行低氧环境下(11000pa，正常大气氧分压的50％)，经lb培养基培养48小时进行活力检测，结果显示bsbc在低氧环境下的生存率是对照组的3.6倍，杀菌能力是对照组的3.3倍。

随后对bsbc进行紫外随机紫外诱变，然后在低氧环境下筛选抗低氧环境突变株，获得突变株bsbc01，与野生菌株进行比较，结果显示bsbc01在低氧环境下的生存率是野生型菌株的2倍，杀菌能力是野生型菌株的1.8倍。低氧环境下培养48小时后，菌株生存能力比较结果如图1所示。

将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)bsbc01于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号cgmccno.17239。

实施例2

上述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)bsbc01的培养方法，步骤如下：

(1)将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)bsbc01划线接种于lb固体培养基平板上37℃活化培养24h，制得活化菌株；

(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种于lb液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养18h，制得种子液；

(3)将步骤(2)制得的种子液按体积百分比5％的接种量接种到液体培养基中，37℃培养8h，制得初级发酵液；

所述液体培养基组分如下：

玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，kh2po40.03％，k2hpo40.01％，cacl20.01％，余量水，ph7.0；

(4)将步骤(3)制得的初级发酵液按体积百分比8％的接种量接种到发酵培养基中，37℃培养24h，制得发酵液；

所述发酵培养基每升组分如下：

玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，kh2po40.03％，k2hpo40.01％，cacl20.01％，余量水，ph7.0。

经检测，发酵液中菌体浓度为5×10⁹cfu/ml。

实施例3

将发酵液按照0.1％的比例与日常饲料(普通市售产品)进行混合，作为实验组；另设添加相同菌体浓度枯草芽孢杆菌cmcc63501发酵液的对比组，发酵液添加比例与日常饲料与实验组相同；两组按均按常规方式和用量进行喂养。

经对上述施用产品后的畜牧动物进行肠道菌群分离，并进行实验室培养，培养条件分别为lb培养基、麦康凯琼脂培养基、ma培养基、tsb培养基，培养温度分别为37℃，32℃，30℃，培养时间为48小时，分析菌群多样性。同时，进行高通量及肠道宏基因组测序，将测序后的结果进行比对分析，发现本品能够显著降低肠道病害菌大肠杆菌和铜绿假单胞菌的比率，两种菌实验组较对比组在肠道内的丰度分别降低了38.2％和26.1％；同时，提高了有益菌枯草芽孢杆菌，肠道乳酸菌的比率，两种菌实验组较对比组在肠道内的丰度分别提高了12.8％和22.6％。其中，病害大肠杆菌的抑菌效果最为明显，实验组显著高于对比组，结果如图2所示。