一种基于CRISPR/Cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法与流程

本发明属于食源性致病菌痕量检测技术领域，尤其涉及一种基于crispr/cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法。

背景技术：

食源性致病菌是引发食源性疾病的主要原因之一，是世界食品安全的重要，已严重威胁到人类健康。食源性致病菌的检测是食品安全保障的重要手段。伴随着核酸检测技术的快速发展，各种食源性致病菌的快速检测方法相继而生。常用的有聚合酶链式反应及其衍生技术、核酸恒温扩增技术、寡核苷酸微阵列技术和免疫磁性细胞分离技术等。现有的这些方法虽各有优势，但存在检测周期长或者检测时荧光背景太强等缺陷。鉴于申请人在食品无损检测领域积累的良好经验以及团队成员熟练的分子生物学基础，特别是在上转换荧光检测技术以及crispr/cas技术领域的深入研究，本项目拟构建一种基于crispr/cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法，深入探究快速、灵敏的食源性致病菌核酸定量检测方法，该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。

目前，运用上转换荧光纳米技术实现食源性致病菌核酸的快速检测方法仍未报道。本发明作为一种新颖的食源性致病菌核酸定量方法，实现食源性致病菌核酸的快速检测。

技术实现要素：

本发明根据现有技术中存在的问题，提出了一种基于crispr/cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法，本发明检测周期短、特异性强和灵敏度高的优势，可实现食源性致病菌核酸的痕量检测分析，适用于食品安全、环境监测等技术领域。

本发明所采用的技术方案如下：

一种基于crispr/cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法，以食源性致病菌核酸为研究对象，运用crispr/cas13a技术，结合重组酶聚合酶扩增技术制备核酸靶标，并通过合成猝灭荧光rna报告标志物，构建一套强大的核酸检测工具，运用新型核酸酶cas13a对痕量致病菌细胞中的特定核酸靶标进行精确切割，并利用该酶的附带切割效应，剪切猝灭荧光rna报告标志物，释放可被检测的荧光；借助荧光光谱系统采集荧光光谱数据，获取上转换荧光纳米材料最大吸收峰的荧光强度值，构建上转换纳米荧光强度与食源性致病菌核酸靶标含量的定量检测模型，实现食源性致病菌核酸纳米荧光痕量快速检测。

进一步，所述荧光光谱数据采集的方法为：将纯化的cas13a蛋白、crrna、猝灭荧光rna报告标志物、rna酶抑制剂、背景rna和不同含量的致病菌体外转录产物rna混合在核酸酶测定缓冲液中孵育，通过上转换荧光光谱仪记录不同含量致病菌核酸靶标所对应的荧光强度。

进一步，所述核酸酶cas13a对靶标rna进行特异性切割，激活的cas13a具有附带切割活性，可以剪切其他非靶标rna。

进一步，所述核酸靶标制备方法：提取食源性致病菌核酸，采用rpa/rt-pcr重组酶聚合酶扩增技术对致病菌痕量核酸片段进行扩增反应，接着进行体外转录得到rna片段作为食源性致病菌核酸靶标片。

进一步，所述食源性致病菌crrna的制备方法为：合成结构为5’-锚定序列-向导序列-3’的crrna，锚定序列依cas13a来源而定，向导序列与体外转录rna片段互补，将5’-锚定序列-向导序列-3’进行反转录，在其5’添加t7启动子序列，将5’-t7启动子序列-锚定序列-向导序列-3’dna在t7rna聚合酶作用下快速合成大量crrna。

进一步，所述猝灭荧光rna报告标志物的制备方法：

采用溶剂热法制备带有氨基修饰的上转换纳米颗粒，采用戊二醛交联法将rna荧光标志物(nh2-rna-bhq)与带有氨基修饰的上转换纳米颗粒(nh2-ucnps)连接在一起作为猝灭荧光rna标志物，该猝灭荧光rna报告标志物具有信号报告功能，当cas13a切割其中的rna序列时，释放能够检测到的荧光信号。

进一步，所述上转换荧光纳米颗粒为nagdf4:yb/er、nagdf4:yb/tm或nagdf4:yb/ho。

本发明的有益效果：

本发明涉及的一种基于crispr/cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法简单易于操作、检测周期短，灵敏度高，可广泛应用于食品安全、环境监测等技术领域。

本发明涉及的crispr-cas13a技术中的新型核酸酶cas13a具有双重功能，不仅参与crrna的成熟过程，同时对靶标rna进行特异性切割，而且激活的cas13a具有附带切割活性，可以剪切其他非靶标rna。crispr/cas13a技术将原本靶向dna的基因编辑工具延伸至靶向rna的全新检测系统，具有检测速度快、特异性强和灵敏度高的优势。

本发明涉及的结合重组酶聚合酶扩增技术rpa技术不依赖热循环扩增模板序列，利用重组酶与寡核苷酸引物结合精确定位到靶序列，在单链dna结合蛋白酶辅助下解旋模板双链，接着在dna聚合酶作用下启动靶序列的指数级扩增，整个反应在常温下即可进行，无需变性，20min内可获得扩增产物检出水平，具有特异性强，灵敏度高，反应迅速，设备依赖性低和扩增精确等传统体外核酸扩增技术所不具备的优点。

附图说明

图1为基于crispr/cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测的技术路线图；

图2为上转换荧光纳米颗粒ucnps的表征图，a为上转换荧光纳米颗粒ucnps的透射电镜图，b为0.1mg/ml的上转换荧光纳米颗粒ucnps荧光强度。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1，本发明所提出基于crispr/cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法，进一步验证本发明所提出的检测方法，本发明所设计的方案适用于食源性致病菌的检测，在本实施例中仅金黄色葡萄球菌(s.aureus)为例，具体操作过程如下：

金黄色葡萄球菌核酸靶标片段的制备：首先将金黄色葡萄球菌接种在luria-bertani培养基上，37℃，200rpm/min培养24h，然后取菌夜1ml，12000/min离心1min，弃去上清液。使用细菌基因组提取试剂盒提取金黄色葡萄球菌核酸。采用rpa/rt-pcr技术对金黄色葡萄球菌痕量核酸靶标片段进行扩增反应，接着进行体外转录得到rna片段。rpa(recombinasepolymeraseamplification，重组酶聚合酶扩增)技术被称为是目前唯一能够替代pcr技术的新型恒温核酸扩增方法，不依赖热循环扩增模板序列，而是利用重组酶与寡核苷酸引物结合精确定位到靶序列，在单链dna结合蛋白酶辅助下解旋模板双链，接着在dna聚合酶作用下启动靶序列的指数级扩增，整个反应在常温下即可进行，无需变性，20-30min内可获得扩增产物检出水平，具有特异性强，灵敏度高，反应迅速，设备依赖性低和扩增精确等传统体外核酸扩增技术所不具备的优点。

金黄色葡萄球菌crrna的制备：采用化学合成法合成crrna。crrna结构为5’-锚定序列-向导序列-3’。锚定序列依cas13a来源而定，cas13a为lshcas13a时，锚定序列为5’-ccaccccaauaucgaaggggacuaaaac-3’；cas13a为lwcas13a时，锚定序列为5’-gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaac-3’。向导序列设计的长度为21-28核苷酸，其与体外转录rna片段互补。然后将设计的5’-锚定序列-向导序列-3’进行反转录，在其5’添加t7启动子序列，将5’-t7启动子序列-锚定序列-向导序列-3’dna在t7rna聚合酶作用下快速合成大量crrna。使用rnaxp清洁珠纯化合成的crrna。

cas13a蛋白的纯化：将cas13a细菌表达载体转化到感受态细胞中，取16ml培养物在terrificbroth4生长培养基中培养过夜。接着补充iptg，并将细胞冷却至18℃持续16小时进行蛋白表达。4℃，5200g离心15min，收集细胞沉淀并将其破碎进行蛋白纯化。

猝灭荧光rna报告标志物的制备：采用溶剂热法制备上转换纳米颗粒ucnps，所制备的为氨基修饰的纳米颗粒。具体过程为：将nh4f(6.24mmol)溶解在12mleg中。取nacl(1mmol)，pei(0.5g)，gd(no3)3(0.8mmol)，yb(no3)3(0.17mmol)和er(no3)3(0.03mmol)溶解于eg(38ml)中，磁力搅拌30min。待溶液透明时，加入nh4f溶液，搅拌10min，将溶液转移到不锈钢高压反应釜中。反应釜在200℃条件下加热1.5h，冷却至室温。通过离心分离纳米颗粒，用去离子水洗涤三次，并在真空干燥箱中干燥6h，得到粉末状上转换纳米颗粒。在本实施例中，粒径大小(<100nm)通过添加nh4f的量来调节，荧光颜色通过调节稀土元素掺杂比例来控制。采用戊二醛交联法将rna荧光标志物nh2-rna-bhq1与氨基修饰的纳米颗粒nh2-ucnps连接在一起，最终得到猝灭荧光rna报告标志物ucnps--rna-bhq1，在本实施例中，rna荧光标志物采用由takara公司合成的nh2-rna-bhq1。该猝灭荧光rna报告标志物具有信号报告功能，当cas13a切割其中的rna序列时，释放能够检测到的绿色荧光信号。

荧光光谱数据采集分析：将纯化的cas13a蛋白、crrna、猝灭荧光rna报告标志物、rna酶抑制剂、背景rna和不同含量的金黄色葡萄球菌体外转录产物rna混合在核酸酶测定缓冲液(40mmtris-hcl，60mmnacl，6mmmgcl2，ph7.3)中孵育，通过上转换荧光光谱仪记录不同含量金黄色葡萄球菌核酸靶标所对应的荧光强度。

金黄色葡萄球菌核酸靶标的纳米荧光痕量检测：构建荧光强度变化值与不同含量金黄色葡萄球菌核酸靶标的定量分析模型，从而实现金黄色葡萄球菌靶标核酸的纳米荧光痕量检测，如图2所示。

本发明所提出的基于crispr/cas13a的食源性致病菌核酸纳米荧光痕量检测方法，适用于食品安全与环境监测等技术领域，本发明中的核酸酶cas13a不仅参与crrna的成熟过程，同时对靶标rna进行特异性切割，激活的cas13a具有附带切割活性，可以剪切其他非靶标rna。crispr/cas13a技术将原本靶向dna的基因编辑工具延伸至靶向rna的全新检测系统，具有检测速度快，可实现单碱基错配的特异性检测和单个目标核酸分子灵敏度检测的优势。

本发明所设计的检测方法特异性强，当有多种食源性致病菌存在时，只有目标致病菌核酸经扩增后体外转录物与设计好的crrna匹配，cas13a的附带切割活性才被激活，从而释放可被检测的荧光。

以上实施例仅用于说明本发明的设计思想和特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，本发明的保护范围不限于上述实施例。所以，凡依据本发明所揭示的原理、设计思路所作的等同变化或修饰，均在本发明的保护范围之内。