甘蓝型油菜矮杆性状位点的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及植物育种领域，具体涉及油菜矮杆位点及与矮杆位点的紧密连锁分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641及其应用。

背景技术：

株型育种在农作物产量提高中，发挥过最重要的作用。20世纪60年代和70年代的“绿色革命”，就是指将矮杆性状基因引入小麦、水稻等作物中，使得其在世界范围内的产量得到了大幅度的提升。高杆作物品种在生产上易出现倒伏，这会使得作物的产量下降16％左右。矮杆作物品种抗倒伏性强，收获系数大为提高。因此，矮杆作物品种选育是作物育种的十分重要的内容。

甘蓝型油菜(brassicanapus)是重要的油料作物。生产上应用的油菜属于高杆类型，其株高一般在1.8米-2.2米之间。高秆油菜品种易倒伏，影响光合作用，其菌核病往往大发生，造成严重减产；同时，油菜株高太高，也不利于机械化收割，阻碍机械化生产。矮秆油菜因为其株高较矮，抗倒伏力强，收获指数高，适合于机械化收割，也会减少病害。因此，目前油菜生产上继续培育油菜矮化品种。而培育矮杆油菜品种，就需要恰当的油菜矮杆种质资源，并且开发相应的分子标记，作为育种手段，提高育种效率。

油菜矮杆性状的研究目前还比较少。过去的研究中，认为油菜株高遗传比较复杂，主要受多基因控制。有限的研究中，也发掘了几个控制株高的主基因位点。foisset等(1995)获得了一个甘蓝型油菜矮杆突变体位点bzh，遗传上该位点呈现加性效应基因。石淑稳等(1995)发现了控制甘蓝型油菜株高的两个主效位点ds-1和ds-2。王茂林等(2004)发现了矮化突变体ndf-1，该突变体矮杆性状受1对加性效应基因控制。浦惠明等(1995)报道了从澳大利亚公司引进的矮杆材料，命名为矮源1号，其株高遗传受1对显性基因控制。梅德圣等(2006)在甘蓝型油菜品系中发现一株株高85cm左右的矮杆突变体99cdam，其矮杆性状主要受3对隐性基因控制，且存在母体细胞质效应。王衍坤等(2016)发现了控制甘蓝型油菜矮杆的两个新主效位点bndwf1和bndwf/dcl1，均是1对显性基因控制。

尽管学者们也对油菜矮秆性状遗传和育种，作了一些积极的探索，但矮杆油菜育种还没有取得突破，还需要继续开发控制油菜矮杆性状的新主效位点及其分子标记，为油菜矮化育种提供基础。开发油菜矮杆新主效位点的紧密连锁分子标记，可以在油菜苗期筛选矮化基因型，提高选择效率，还可以在分离世代提高选择的准确性。因此，油菜株高的主效位点的紧密连锁的分子标记开发和应用是油菜矮化育种的关键技术。

本发明发现了一个控制甘蓝型油菜矮杆性状的新主效位点，并且发展了其紧密连锁的分子标记技术。

技术实现要素：

本发明的目的是提供位于甘蓝型油菜c04染色体上控制油菜矮杆性状的新位点。

本发明的另一目的是提供甘蓝型油菜矮杆性状新基因位点的分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641引物对。

本发明的又一个目的是提供甘蓝型油菜矮杆位点的分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641或其引物对在检测所述的矮杆油菜及选育矮杆油菜品种中的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一个控制油菜矮杆位点bndwarf2，所述bndwarf2位点位于甘蓝型油菜c04染色体上bnac04:41993194bp-43723070bp。所述的紧密连锁标记bnc04y1361位于甘蓝型油菜c04染色体上42375505bp-42375810bp；所述的紧密连锁标记bnc04y2255位于甘蓝型油菜c04染色体上42635056bp-42635376bp；所述的紧密连锁标记bnc04y2498位于甘蓝型油菜c04染色体上42697768bp-42698073bp；所述的紧密连锁标记bnc04y2641位于甘蓝型油菜c04染色体上42724075bp-42724380bp。所述的紧密连锁标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示。

本发明所述的甘蓝型油菜矮杆位点的分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641，这四个紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为seqy1361-f、seqy2255-f、seqy2498-f和seqy2641-f，下游引物序列分别为seqy1361-r、seqy2255-r、seqy2498-r和seqy2641-r，

seqy1361-f的序列如seqidno.5所示；

seqy1361-r的序列如seqidno.6所示；

seqy2255-f的序列如seqidno.7所示；

seqy2255-r的序列如seqidno.8所示；

seqy2498-f的序列如seqidno.9所示；

seqy2498-r的序列如seqidno.10所示；

seqy2641-f的序列如seqidno.11所示；

seqy2641-r的序列如seqidno.12所示。

其序列为：

seqy1361-f：catcacggtttgagtttc(5’-3’)

seqy1361-r：ttcttaatttcggctaag(5’-3’)

seqy2255-f：atttggtctccataagtatt(5’-3’)

seqy2255-r：tgagtcagtcgtctttgtt(5’-3’)

seqy2498-f：ccagttataaagcgcac(5’-3’)

seqy2498-r：tgattcttgaaaggtcc(5’-3’)

seqy2641-f：ggacagaaaatccagag(5’-3’)

seqy2641-r：tgccaagatgtaccaag(5’-3’)

本发明所述的甘蓝型油菜矮杆位点的分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641，在含所述的甘蓝型油菜矮杆性状位点的品种和种质检测中的应用。

本发明所述的甘蓝型油菜矮杆位点的分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641在选育矮杆油菜品种和种质中的应用。

本发明所述的甘蓝型油菜矮杆位点的分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641引物对，这四个紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为seqy1361-f、seqy2255-f、seqy2498-f和seqy2641-f，下游引物序列分别为seqy1361-r、seqy2255-r、seqy2498-r和seqy2641-r。

seqy1361-f的序列如seqidno.5所示；

seqy1361-r的序列如seqidno.6所示；

seqy2255-f的序列如seqidno.7所示；

seqy2255-r的序列如seqidno.8所示；

seqy2498-f的序列如seqidno.9所示；

seqy2498-r的序列如seqidno.10所示；

seqy2641-f的序列如seqidno.11所示；

seqy2641-r的序列如seqidno.12所示；

本发明所述的甘蓝型油菜矮杆位点的分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641引物对，在含所述的甘蓝型油菜矮杆性状位点的品种和种质检测中的应用。

本发明所述的甘蓝型油菜矮杆位点的分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641引物对在选育矮杆油菜品种和种质中的应用。

一种利用本发明所述分子标记或引物对检测矮杆甘蓝型油菜的方法，利用本发明所述的引物对扩增油菜基因组dna，扩增产物在40％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，检测是否获得亲本mb1501-1的扩增片段。如果获得亲本mb1501-1的扩增片段，则表明存在本发明所述的矮杆油菜。

一种利用本发明所述分子标记或引物对选育矮杆甘蓝型油菜品种的方法，优选用所述nc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641引物对扩增油菜基因组dna，扩增产物在40％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，检测是否获得mb1501-1的扩增片段。如果获得mb1501-1的扩增片段，则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜矮杆位点，预测该油菜是矮杆油菜。如果获得亲本zs11的扩增片段，则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜高杆位点，预测该油菜是高杆油菜。

本发明甘蓝型油菜矮杆基因连锁的分子标记是通过下列步骤筛选的：

(1)遗传群体构建：在自交多代的甘蓝型油菜品系中发现一株矮杆突变体mb1501-1，利用mb1501-1与常规优良品种中双11杂交，得到杂种f1，f1自交得到f2，f2与zs11杂交得到f2bc1，f2自交得到f3，对f1、f2、f2bc1和f3进行表型调查；

(2)甘蓝型油菜f2、f2bc1和f3群体表型测定：对上述f2、f2bc1和f3群体中共1947个单株进行表型观察以及农艺性状调查；

(3)遗传图谱的构建：选择f2群体中的65个单株叶片dna样品用于snp标记的数据获取，采用joinmap4.0作图软件构建连锁图谱；

(4)将用于snp芯片的dna样品的表型数据与其snp遗传连锁图谱数据一起进行定位分析，控制甘蓝型油菜矮杆性状的bndwarf2位点被定位到c04连锁群，定位区间位于42697814bp-42698038bp的区段内；

(5)利用油菜c04染色体41993194bp-43723070bp的ssr信息，设计分子标记；

(6)根据f2、f2bc1和f3群体表型数据和分子标记数据，发现紧密连锁共显性分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641，而且其遗传带型清晰可见。

有益效果：

本发明在国际上首次鉴定了一个位于甘蓝型油菜c04染色体41993194bp-43723070bp区域内控制甘蓝型油菜矮杆位点，同时发现与矮杆位点紧密连锁的共显性分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641，这些分子标记在f2、f2bc1和f3群体的表现使其在甘蓝型油菜矮杆育种中具有非常重要的价值。

1、首次鉴定了一个位于甘蓝型油菜c04染色体41993194bp-43723070bp区域内控制甘蓝型油菜矮杆位点，同时发现与矮杆位点紧密连锁的共显性分子标记bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641；

2、在f2、f2bc1和f3群体中，甘蓝型油菜矮杆性状与这四个分子标记呈极显著相关，f2、f2bc1和f3单株基因型和表型一致，因此这四个分子标记在今后的矮杆油菜辅助选择育种中具有巨大的应用前景；

3、本发明能够在甘蓝型油菜中找到纯合矮杆油菜，对矮杆株型育种有很大帮助。

附图说明

图1：矮杆油菜表型图。

图2：分子标记bnc04y1361对f2部分单株基因分型；其中1为zs11扩增带型，2为mb1501-1扩增带型，4、8、9和12为高杆油菜扩增带型，5-7为纯合矮杆油菜扩增带型，3、10和11为杂合矮杆扩增带型。

图3：分子标记bnc04y2255对f2部分单株基因分型；其中1为mb15010-1扩增带型，2为zs11扩增带型，3、10和11为高杆油菜扩增带型，8和12为纯合矮杆油菜扩增带型，4、5、6、7和9为杂合矮杆油菜扩增带型。

图4：分子标记bnc04y2498对f2部分单株基因分型；其中1为mb1501扩增带型，2为zs11扩增带型，4、11和12为纯合矮杆油菜扩增带型，5和10为高杆油菜扩增带型，3和6-9为杂合矮杆油菜扩增带型。

图5：分子标记bnc04y2641对f2部分单株基因分型；其中11为zs11扩增带型，12为mb1501-1扩增带型，1为纯合矮杆油菜扩增带型，4-6为高杆油菜扩增带型，2、3和7-10为杂合矮杆油菜扩增带型。

具体实施方式

实施例1

下面结合说明书附图对本发明创造作进一步说明。

实施例1

甘蓝型油菜矮杆位点的获得：

(1)遗传群体构建

利用两个甘蓝型油菜材料“mb1501-1”与中双11进行杂交，得到杂种f1，f1自交得到284个f2单株，f2与zs11杂交得到880株f2bc1，f2自交共获得783个f3单株。

(2)甘蓝型油菜f2、f2bc1和f3群体表型测定

对上述f2、f2bc1和f3群体中共1947个单株进行表型观察以及农艺性状调查。矮杆油菜表型图如图1所示。

(3)遗传图谱的构建

选择f2群体中的65个单株叶片dna样品用于snp标记的数据获取，其中有15株为高杆型单株和50株矮杆型单株。snp芯片共有52157个位点，但此f2群体的dna样品并不是在所有位点上都有多态性。在去除无效标记(无多态标记以及单个基因型所占比例大于95％)后，剩余7457个具有多态性、可以进行snp遗传连锁图谱构建的标记。用joinmap4.0作图软件构建连锁图谱。

(4)结果与分析

将65个用于snp芯片的dna样品的表型数据与其snp遗传连锁图谱数据一起进行定位分析，控制甘蓝型油菜矮杆性状的bndwarf2位点被定位到c04连锁群，定位区间位于bnac04:42697814bp-42698038bp的区段内。

实施例2

甘蓝型油菜矮杆位点紧密分子标记的获得：

(1)分子标记开发

本研究利用snp芯片技术将矮秆位点定位在油菜c04染色体的42697814bp-42698038bp区段内，下载油菜参考基因组序列，利用ssrhunter1.3软件查找ssr位点，在其上下游各增加150bp设计引物，ssr标记位点命名为“bnc04y+ssr位点”，采用primerpremier5.0软件在bnac04:41993194bp-43723070bp区域内设计多个分子标记。

(2)f2、f2bc1和f3群体分子标记鉴定

采用ctab法提取f2群体油菜材料叶片的基因组dna，pcr反应体系(10ul)，其中含有0.5uldna模板、上、下游引物(1mmol/l)各0.25ul、5ulmix，和4ulddh2o。pcr反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。pcr扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。胶片在bio-radvisadoc3.0(bio-rad，usa)成像系统中扫描分析。

(3)结果与分析

在设计的多个分子标记中，bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641分子标记与表型一致性达到99％，认为这四个分子标记与甘蓝型油菜矮杆位点是紧密连锁。在f2和f3群体中这四个紧密连锁分子标记分别有三种带型，bnc04y1361条带大小分别为170bp，176bp和同时拥有两条带，拥有170bp带型的单株是纯合矮杆单株(36.64±1.86cm)，拥有176bp带型的单株是高杆油菜(193.54±6.80cm)，同时具有170bp与176bp条带的为矮杆杂合体(105.30±5.16cm)；bnc04y2255条带大小分别为212bp，191bp和同时拥有两条带，拥有212bp带型的单株是纯合矮杆单株(36.64±1.86cm)，拥有191bp带型的单株是高杆油菜(193.54±6.80cm)，同时具有212bp与191bp条带的为矮杆杂合体(105.30±5.16cm)；bnc04y2498条带大小分别为231bp，225bp和同时拥有两条带，拥有231bp带型的单株是纯合矮杆单株(36.64±1.86cm)，拥有225bp带型的单株是高杆油菜(193.54±6.80cm)，同时具有231bp与225bp条带的为矮杆杂合体(105.30±5.16cm)；bnc04y2641条带大小分别为227bp，233bp和同时拥有两条带，拥有227bp带型的单株是纯合矮杆单株(36.64±1.86cm)，拥有233bp带型的单株是高杆油菜(193.54±6.80cm)，同时具有227bp与233bp条带的为矮杆杂合体(105.30±5.16cm)。这四个紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为seqy1361-f、seqy2255-f、seqy2498-f和seqy2641-f，下游引物序列分别为seqy1361-r、seqy2255-r、seqy2498-r和seqy2641-r。

实施例3

紧密连锁分子标记在矮杆油菜选择上的应用：

(1)双亲本基因组扩增检测

用于验证矮杆油菜亲本分别为亲本“mb1501-1”(bnc04y1361等位条带为170bp；bnc04y2255等位条带为212bp；bnc04y2498等位条带为231bp；bnc04y2641等位条带为227bp，株高为36.64±1.86cm)，亲本zs11(bnc04y1361等位条带为176bp；bnc04y2255等位条带为191bp；bnc04y2498等位条带为225bp；bnc04y2641等位条带为233bp，株高为193.54±6.80cm)，如图2-5所示。

(2)群体扩增检测及标记分析

用以上两个亲本进行杂交，得到f1代种子种植后长成一个f1代单株，其自交结实收获得f2代种子，后者种植长成一个包含分离性状的f2群体，f2自交得到f3分离群体，f2与zs11杂交得到f2bc1群体，对f2、f2bc1和f3群体单株农艺性状和表型测定。

采用ctab法分别提取每份f2单株叶片的基因组dna。pcr反应体系(10ul)，其中含有0.5uldna模板、上、下游引物(1mmol/l)各0.25ul、5ulmix，和4ulddh2o。pcr反应程序：95℃变性5min；随后进行35个循环的95℃变性30s，tm值退火30s，72℃延伸30s；再经72℃延伸10min；最后4℃保存。pcr扩增产物用40％聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。胶片在bio-radvisadoc3.0(bio-rad，usa)成像系统中扫描分析。分析bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641在亲本mb1501-1和zs11的条带类型。

(3)结果与分析

在mb1501-1和zs11的杂交组合后代f2、f2bc1和f3因型的检测中，发现bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641分子标记与表型一致性达到99％。结果表明了用bnc04y1361、bnc04y2255、bnc04y2498和bnc04y2641分子标记预测油菜高矮杆有较好的预测效果。

序列表

<110>南京农业大学

<120>甘蓝型油菜矮杆性状位点的分子标记及其应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>306

<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

<400>1

attggataagatgaaaaataatagtagtttatataatttcaaatttttaataatatttca60

aaaagttacttttatctagttgttagtgtgcccttttaaaagggtatcgcatcacggttt120

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acgacgtcgtcttatcttgttaacggttgactaacttctgttagagtctaagaatctcag240

ttaagagactggggttaagaaccgtctcttagccgaaattaagaatcccagttaagagac300

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<210>2

<211>321

<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

<400>2

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<210>3

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<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

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<210>4

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<212>dna

<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

<400>4

atatgggaaaaagccaaaacgtttacttatccgtcatcatagctggacagaaaatccaga60

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<213>甘蓝型油菜(brassicanapus)

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