灰楸CfPIP1-1水通道蛋白的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，尤其是灰楸CfPIP1-1水通道蛋白。

背景技术：

灰楸(Catalpa fargesii)为紫葳科(Bignoniaceae)梓树属(Catalpa Scop.)，原产我国，分布范围广，在甘肃、陕西、山西、河南、山东等省均有分布；具有悠久的栽培历史，是我国著名的优质珍贵用材和园林观赏树种，目前在人工造林和园林景观方面已有大量的应用。但是由于灰楸育种工作起步晚，良种缺乏和繁育技术滞后已经成为灰楸人工林规模化发展的瓶颈。

在干旱胁迫下，如何保持体内的水分在一定水平是植物能否耐旱的关键。植物的水分进出主要是由水通道蛋白控制。水分子从外部环境通过细胞膜进入细胞并参与生命活动，其70％的跨膜运输通过水通道蛋白完成。可见，水通道蛋白在水分运输中起到最为关键的作用。通过大量的转基因研究表明，一些AQP基因的表达可以提高抗旱性等对非生物胁迫的抗性。干旱能诱导水通道蛋白基因的表达，如干旱能诱导豌豆完成编码水通道蛋白Trh-31和诱导烟草产生水通道蛋白NeMIP1等，这些响应干旱而产生的水通道蛋白可以形成专一水分通道，提高细胞膜的透水性，便于水分的吸收，从而水细胞保持一定的膨压。在盐胁迫下，烟草的NtAQP1基因表达可以提高水分利用效率，提高导水性。但是，过量表达HvPIP2；1基因却提高了水稻蒸腾速率，降低了水分利用效率。因此，不同水通道蛋白基因，在干旱胁迫响应过程中所起的作用不同。

目前，灰楸主要应用于园林绿化和“四旁”植树，优良抗旱品种缺乏在一定程度上限制了其在低山、丘陵地带的规模化造林。因此，开展灰楸优良抗旱性种质创制与选择具有很强的现实意义。

目前已公布的AQP基因，如PIPs、TIPs、MIP等类型，多来源于模式植物和草本植物，部分林木也克隆获得了AQP基因，如马尾松、杨树等。灰楸为我国主要的珍贵阔叶用材树种，具有较高的用材和观赏价值，但目前尚无AQP同源基因的研究报道。

技术实现要素：

为了解决背景技术中描述的技术问题，本发明提供了一种灰楸CfPIP1-1水通道蛋白，通过从灰楸叶片中克隆获得与灰楸抗旱相关的PIP基因，通过RT-PCR证实了其在干旱胁迫下灰楸叶片和根系中的协同性表达，依据转基因拟南芥抗旱性评价证实其提高抗旱性的能力，从而提高了灰楸抗旱性的遗传改良。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种灰楸CfPIP1-1水通道蛋白，

灰楸抗旱相关的CfPIP1-1基因cDNA全长的核苷酸为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

灰楸抗旱相关的CfPIP1-1基因所编码的蛋白质为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

具体地，用于克隆灰楸抗旱相关的CfPIP1-1基因的引物对为：

CfPIP1-1—F：5’—TCATCGCCACTTTCTTGTTCTTGT—3’

CfPIP1-1—R：5’—TGAGCCTCTGGTATGGTCCCT—3’。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种灰楸CfPIP1-1水通道蛋白，通过从灰楸叶片中克隆获得与灰楸抗旱相关的PIP基因，通过RT-PCR证实了其在干旱胁迫下灰楸叶片和根系中的协同性表达，依据转基因拟南芥抗旱性评价证实其提高抗旱性的能力，从而提高了灰楸抗旱性的遗传改良。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是本发明的模拟干旱胁迫下转CfPIP1-1基因拟南芥与野生型根系生长差异比较图；

图2是本发明的干旱胁迫下转基因拟南芥表型图；

图3是本发明的干旱胁迫下转基因拟南芥含水率图；

具体实施方式

现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。

图1是本发明的模拟干旱胁迫下转CfPIP1-1基因拟南芥与野生型根系生长差异比较图，图2是本发明的干旱胁迫下转基因拟南芥表型图，图3是本发明的干旱胁迫下转基因拟南芥含水率图。

一种灰楸CfPIP1-1水通道蛋白，

灰楸抗旱相关的CfPIP1-1基因cDNA全长的核苷酸为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

灰楸抗旱相关的CfPIP1-1基因所编码的蛋白质为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

具体地，用于克隆灰楸抗旱相关的CfPIP1-1基因的引物对为：

CfPIP1-1—F：5’—TCATCGCCACTTTCTTGTTCTTGT—3’

CfPIP1-1—R：5’—TGAGCCTCTGGTATGGTCCCT—3’。

灰楸抗旱相关的CfPIP1-1蛋白质为1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

依据生物学特性，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其生物活性的前提下，取代、缺失和(或)增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白质的突变序列。

因此，本发明的灰楸抗旱相关的CfPIP1-1蛋白质还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，具有灰楸抗旱相关的CfPIP1-1蛋白质同等活性的由灰楸抗旱相关的CfPIP1-1蛋白质衍生得到的蛋白质。

本发明还提供了前述蛋白的编码基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏好性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明从灰楸中分离出CfPIP1-1基因，通过农杆菌介导法将灰楸抗旱相关的CfPIP1-1基因转入拟南芥，获得了转基因拟南芥。转基因拟南芥与野生型拟南芥的区别在于转基因拟南芥的抗旱性较强。

灰楸CfPIP-1基因从DNA序列的分子克隆步骤为：

(1)灰楸叶片总RNA的提取；

(2)灰楸叶片总RNA的3’—RACE实验；

(3)灰楸叶片总RNA的5’—RACE实验；

(4)对3’—RACE和5’—RACE的PCR测序结果，进行分析和拼接，得到灰楸CfPIP-1基因的cDNA序列全长，长度为1077bp，序列如SEQ ID No.1所示。

实施例1:

6％PEG胁迫下转CfPIP1-1拟南芥根系生长发育状态

(1)材料

以转CfPIP1-1的第三代拟南芥和野生型拟南芥为实验材料。

(2)培养基配制

对照组：1/2MS培养基

实验组：1/2MS+6％PEG6000培养基

(3)试验设计和性状测定

种子播种前使用灭菌水清洗3次，75％酒精消毒30秒，灭菌水清洗3次，1％次氯酸钠消毒2分钟，灭菌水清洗4次。散播于1/2MS和1/2MS+6％PEG培养基中，培养基以45°倾斜放置，利于根系的向地性生长。生长一周后进行拍照观察和根系长度测定。

(4)测定结果

1/2MS培养基中生长的野生型和转基因植株根系均能良好生长，

且生长一周后长度没有显著差异。添加6％PEG培养基中野生型拟南芥根系生长停滞，转化灰楸CfPIP1-1基因拟南芥根系生长虽受到一定程度抑制，但其长度均显著大于野生型拟南芥。如附图1所示，根系长度比野生型长69.24％。表明CfPIP1-1基因表达能激活或直接参与了植株体内的渗透调节机制，提高植株的水分运输和利用，从而增强其抗旱性。附图1中，**代表1％水平的显著差异；不同小写字母代表5％水平的显著差异。

实施例2：

干旱胁迫下转CfPIP1-1拟南芥生长表型和含水率检测

(1)材料

以转CfPIP1-1的第三代拟南芥和野生型拟南芥为实验材料。

(2)栽培基质

培养基：1/2MS培养基；1/2MS+50mg/L卡那霉素培养基

栽培基质：蛭石+1/4MS营养液

(3)试验设计和性状测定

野生型拟南芥在1/2MS培养基中培养，转基因拟南芥在1/2MS+50mg/L卡那霉素培养基中培养。待幼苗长到一定大小后移栽至营养钵。移栽7天后进行干旱胁迫处理，共设置3个处理条件。对照(CK)：3天浇灌一次1/4MS营养液；轻度干旱(LS)：10天浇灌一次1/4MS营养液；重度干旱(SS)：持续保持干旱。生长27天后进行拍照观察、生长性状和叶片含水率测定。

(4)测定结果

未干旱胁迫和中度干旱胁迫的野生型植株和转基因植株表型差异不明显，但重度干旱胁迫下野生型植株无法正常生长。过表达灰楸CfPIP1-1基因的植株能正常生长。

如附图2所示，中度干旱胁迫下转化CfPIP1-1苗高显著大于野生型，高出野生型27.93％。过表达CfPIP1-1的植株基叶高度显著高出野生型47.95％。过表达植株在对照组合胁迫处理组叶片数量显著多余野生型。重度胁迫下过表达CfPIP1-1株苗高均显著大于野生型植株4.8、倍。基叶高度显著大于野生型76.40％。这意味着CfPIP1-1在植株响应干旱环境中起到了关键作用。

如附图3所示，叶片含水率结果显示轻度干旱处理下转基因植株的相对含水率和绝对含水率均与野生型植株没有显著差异。重度干旱下转化CfPIP1-1植株的相对含水率高出野生型植株26.87％。绝对含水率是野生型的4.4倍。这暗示了CfPIP1-1基因具有提高植物吸收和转运水分的能力。在功能上证明了CfPIP1-1具有促使植物抵抗干旱胁迫的能力。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 灰楸CfPIP1-1水通道蛋白

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1077

<212> DNA

<213> 灰楸(Catalpa fargesii)

<400> 1

aggtcattac tataggcgat tgagctgccc ttaccttcac tccttcttca aagagcaaaa 60

cagaagcaaa cttctgcaaa tttttcactt tttagtgata aagagctcga atccatggcg 120

gaaaacaagg aggaggatgt taatctagga gcaaataagt tcatagagaa gcagccgttg 180

ggtacagctg ctcaaacaga caaagattac aaagagctac cgccggctcc attgttcgaa 240

cctggagagc tcaaatcatg gtccttttac agagctggaa ttgcagagtt catcgctact 300

ttcttgttct tgtacatcag tattttgact gtgatggggg tgaacagagc acctaataag 360

tgtgcttctg tgggtattca ggggattgct tgggcctttg gtggcatgat ttttgccctt 420

gtatactgta ctgctggtat ttcaggaggg cacataaatc cagctgtgac cttaggtttg 480

ttcttggcaa gaaagctttc cctgacaagg gctctgttct acatggtgat gcagtgcctt 540

ggggccatct gtggagctgg agtggtcaag ggttttatgc agggaccata ccagaggctc 600

aatggtgggg ccaactttgt gaaccatggc tacacaaagg gggatgctct tggtgctgag 660

attgtgggca cttttgtcct tgtctacact gtcttctctg ccactgatgc caagagaaat 720

gccagagact cccatgtccc tcttttagca cctcttccca ttgggttcgc agtctttttg 780

gttcatctgg ccaccattcc catcaccgga actggcatta accccgcccg gagcctcggc 840

gctgccatta tttacaaccg agatcacgca tgggatgacc actggatctt ctgggttggt 900

cccttcattg gagcttttct tgctgctgtt taccaccaga ttgtcattag agcaattcct 960

ttcaaaagca ggggctaatt tgcaaaatat attatcttct ttgtgaggtg tgtgttgagc 1020

catgaaatct atatgtaaat tatgagaata tgtacctatg gtgtgcgcgc gcgctac 1077

<210> 2

<211> 287

<212> PRT

<213> 灰楸(Catalpa fargesii)

<400> 2

Met Ala Glu Asn Lys Glu Glu Asp Val Asn Leu Gly Ala Asn Lys 15

Phe Ile Glu Lys Gln Pro Leu Gly Thr Ala Ala Gln Thr Asp Lys 30

Asp Tyr Lys Glu Leu Pro Pro Ala Pro Leu Phe Glu Pro Gly Glu 45

Leu Lys Ser Trp Ser Phe Tyr Arg Ala Gly Ile Ala Glu Phe Ile 60

Ala Thr Phe Leu Phe Leu Tyr Ile Ser Ile Leu Thr Val Met Gly 75

Val Asn Arg Ala Pro Asn Lys Cys Ala Ser Val Gly Ile Gln Gly 90

Ile Ala Trp Ala Phe Gly Gly Met Ile Phe Ala Leu Val Tyr Cys 105

Thr Ala Gly Ile Ser Gly Gly His Ile Asn Pro Ala Val Thr Leu 120

Gly Leu Phe Leu Ala Arg Lys Leu Ser Leu Thr Arg Ala Leu Phe 135

Tyr Met Val Met Gln Cys Leu Gly Ala Ile Cys Gly Ala Gly Val 150

Val Lys Gly Phe Met Gln Gly Pro Tyr Gln Arg Leu Asn Gly Gly 165

Ala Asn Phe Val Asn His Gly Tyr Thr Lys Gly Asp Ala Leu Gly 180

Ala Glu Ile Val Gly Thr Phe Val Leu Val Tyr Thr Val Phe Ser 195

Ala Thr Asp Ala Lys Arg Asn Ala Arg Asp Ser His Val Pro Leu 210

Leu Ala Pro Leu Pro Ile Gly Phe Ala Val Phe Leu Val His Leu 225

Ala Thr Ile Pro Ile Thr Gly Thr Gly Ile Asn Pro Ala Arg Ser 240

Leu Gly Ala Ala Ile Ile Tyr Asn Arg Asp His Ala Trp Asp Asp 255

His Trp Ile Phe Trp Val Gly Pro Phe Ile Gly Ala Phe Leu Ala 270

Ala Val Tyr His Gln Ile Val Ile Arg Ala Ile Pro Phe Lys Ser 285

Arg Gly 287