一种橡胶树开花调控基因HbFT1及其克隆与应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种橡胶树开花调控基因hbft1，并进一步公开其克隆与应用。

背景技术：

高等植物生命周期主要包括种子萌发、营养器官生长、开花、受精、胚胎发育和种子形成等过程。其中，开花过程涉及由营养生长向生殖生长的转换、花器官的发生，以及在环境因子作用下内部各种信号的产生、传递和相互作用等，在植物生命周期中占有中心地位，并与农作物产量以及品质密切相关。

开花诱导即植物由营养生长向生殖生长转换的过程，它受内源发育信号和环境因子的严格控制，开花诱导由一种复杂的信号途径“网络”形成，是一个非常复杂的过程。根据近年来对拟南芥、金鱼草、玉米等几种模式植物的开花调控信号途径的研究，尤其是对拟南芥的研究，提出影响植物的生长发育及开花的4个主要的生物学途径调控，包括自主调控途径(autonomouspathway)、春化途径(vernalization)、ga调控途径(gibberellicacid)和光周期调控途径(photoperiod)。其中自主调控途径和ga调控途径为植物主要内在调控因素，而春化途径和光周期调控途径则是外界主要的调控因素。

ft(floweringlocust)基因是花期调控途径中的关键基因。它位于花发育途径中的汇集点，整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号，在植物花发育中发挥着重要作用。ft蛋白是成花素的主要组成部分，在不同的开花遗传途径中，上游关键基因调控ft基因，使ft蛋白从韧皮部移动到茎顶端分生组织(sam)，与带碱性亮氨酸拉链蛋白(basicregion-leucinezipper，b-zip)转录因子fd(floweringlocusd)在茎尖通过蛋白质的相互作用来促进成花转变，并通过转录激活花分生组织特性基因ap1(apetala1)来启动花发育过程。

拟南芥的ft基因属于ft/tfl1基因家族，又称为磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-bindingprotein，pebp)基因家族，因其蛋白易与磷脂酰乙醇胺结合而得名。拟南芥ft基因受到光周期调控，ft突变体长日照环境下延迟植物开花(kobayashiy,kayah,gotok,etal.1999.apairofrelatedgeneswithantagonisticrolesinmediatingfloweringsignals.science286,1960-1962.)。ft同源基因ptft1转基因杨树在很短时间即可表现出开花表型，同时还能够可以抵制短日照条件下诱导的生长停止和芽休眠的现象的发生(bohleniush,huangt,charbonnel-campaal,etal.2006.co/ftregulatorymodulecontrolstimingoffloweringandseasonalgrowthcessationintrees.science312,1040-43.)。杨树ft2也被证明具有促进开花的作用，同时受到光周期的调控而调控杨树季节性开花的功能(hsucy,liuy,luthedsetal.2006.poplarft2shortensthejuvenilephaseandpromotesseasonalflowering.theplantcell18,1846-1861.)。西红柿ft同源基因sft调控多个不同的发育过程，比如开花转变、叶片的成熟、茎的伸长等(shalita,rozmana,goldshmidta,etal.2009.thefloweringhormoneflorigenfunctionsasageneralsystemicregulatorofgrowthandtermination.proc.nati.acad.sci.usa.106,8392-8397.)。美洲黑杨(populusdeltoides)中pdft1和pdft2因具有不同表达模式推测具有不同生物学功能(igasakit,watanabey,nishiguchim,etal.2008.thefloweringlocust/terminalflower1familyinlombardypoplar.plantandcellphysiology49,291-300.)。在梨树中，根据表达分析推测pcft1具有促进开花的功能，而pcft2则可能调控梨树的叶片的衰老和芽的休眠。过表达pcft2基因在烟草中能够引起烟草早花表型的产生，嫁接研究表明pcft2蛋白具有可移动性。然而转pcft2基因的梨树却不能表现早花表型，而是在延迟因短日照和低温引起的叶片脱落和芽的休眠(freimana,golobovitchs,yablovitzz,etal.2015.expressionoffloweringlocust2transgenefrompyruscommunisl.delaysdormancyandleafsenescenceinmalus×domesticaborkh,andcausesearlyfloweringintobacco.plantscience241,164-176.)。甜菜中bvft1行使开花抑制功能，其表达受到春化处理的抑制，而bvft2则为开花促进者(pinpa,benllochr,bonnetd,etal.2010.anantagonisticpairoffthomologsmediatesthecontroloffloweringtimeinsugarbeet.science330,1397-1400.)。可见，ft不仅在成花转变过程中起重要作用，而且还参与调节生长发育的一些过程。

天然橡胶一直是我国重要的战略物资和储备资源，目前在我国，橡胶树新品种的选育仍然是以传统的人工授粉育种为主。由于橡胶树生长缓慢，从胚后发育的童期到开花需要5-8年时间，而且有些性状只有在成年期才能表现出来，这将严重阻碍橡胶树育种的进程。目前，对橡胶树尤其是巴西橡胶树的成花机理与相关基因克隆和功能研究还未见报道。对橡胶树开化调控基因的克隆及其生物学功能的研究和探索，明确其在橡胶树开花转变过程中的作用，为利用分子育种技术加快橡胶树新品的培育奠定基础。

技术实现要素：

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种橡胶树开花调控基因hbft1，并进一步公开其克隆与应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种橡胶树开花调控基因hbft1，所述基因hbft1的cdna包括如seqidno：1所示的核苷酸序列。

所述的橡胶树开花调控基因hbft1，所述基因hbft1的cdna核苷酸序列如seqidno：1所示。

本发明还公开了一种所述的橡胶树开花调控基因hbft1编码的蛋白，包括如seqidno：2所示的氨基酸序列。

具体的，所述的橡胶树开花调控基因hbft1编码的蛋白，其氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明还公开了一种橡胶树开花调控基因hbft1，所述基因hbft1的基因组dna包括如seqidno：3所示的核苷酸序列。

所述的橡胶树开花调控基因hbft1，所述基因hbft1的基因组dna核苷酸序列如seqidno：3所示。

本发明还公开了一种含有所述的橡胶树开花调控基因hbft1的重组植物表达载体，所述载体为重组质粒pxcs-hbft1。

所述重组植物表达载体中的载体为pmd19-t载体。

本发明还公开了一种克隆所述的橡胶树开花调控基因hbft1的方法，包括如下步骤：

(1)以巴西橡胶树的叶片和花序cdna混合为模板，设计如下引物进行pcr扩增，获得hbtf1基因开放阅读框；

hbft1of：ggaattcatgcctagtgacagag；

hbft1or：ccccccggggcatcttcttcc；

(2)以hbtf1基因开放阅读框为基础，设计如下引起合成5’utr及3’utr；

hbft1-5uf：gtaaaagctggatacctcaggctcc；

hbft1-5ur：caccaacatgaaccctaggttggtt；

hbft1-gsp3^1st：gtgagcgacatccctggaaca；

hbft1-gsp3^2nd：cgaagacagacaatcaacccacc；

(3)根据5’utr和3’utr的获得，设计如下特异引物，进行目标基因hbft1全长的扩增；

hbft1-f：gtaaaagctggatacctcaggctccaaac；

hbft1-r：atggggtcaaatgtggtagaaaaat。

本发明还公开了所述的橡胶树开花调控基因hbft1用于制备促进橡胶树提前开花的促进剂的应用。

本发明首次在巴西橡胶树中获得橡胶树开花调控基因hbft1的全长cdna，并通过橡胶树hbft1基因组织特异性表达分析，hbft1基因在稳定叶、开花的雄花和雌花中表达，但表达量都比较低，且在不同龄树的稳定叶中其表达量随年龄的增加而升高，在主花期3-5月表达量极低，但到9-10月份表达达到高峰期。

本发明通过对拟南芥野生型遗传转化表明，hbft1基因的转基因植株表现出过度早花表型，并伴有终端花序的形成。同时，该基因在ft-10突变体拟南芥中过表达，ft-10突变表型皆能被有效地恢复为野生型表型，甚至一些开花比野生型植株还要早。这些结果均表明hbft1同源基因有很大的潜力行使ft同源基因的功能。因此该基因可作为巴西橡胶树非常有用的开花调控候选基因，可通过功能获得突变或者功能缺失突变研究实现对橡胶树开花的有效调控。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为hbft1基因的组织特异性表达分析(10龄树根，茎，古铜叶，变色叶，淡绿叶，稳定叶，芽，第一发育阶段的花序，开花的雄花，开花的雌花，果皮及种子)；

图2为hbft1基因在两个不同树龄橡胶树不同季节的表达模式；

图3为不同光周期对hbft1基因表达的影响；

图4为不同温度对hbft1基因表达的影响；

图5为橡胶树hbft1基因转化野生型拟南芥的功能验证；

图6为hbft1基因对ft-10突变体表型恢复验证实验。

具体实施方式

下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1巴西橡胶树开花调控基因hbft1的获得

分析已在ncbi登陆的拟南芥、蓖麻的ft基因的cdna序列，通过搜索建立的橡胶树叶片转录组数据库，通过同源比对的方式获得的片段信息，然后进行拼接，再预测开放阅读并设计特异引物获得包含有完整开放阅读框的dna序列和cdna序列。具体方法如下：

(1)hbtf1基因开放阅读框的获得

基因特异性引物设计如下：

hbft1of：ggaattcatgcctagtgacagag；

hbft1or：ccccccggggcatcttcttcc。

以巴西橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育)叶片和花序cdna混合为模板(以随机引物反转录获得)，以hbft1of和hbft1or为引物，其终浓度为0.4μmol/l，在20μl反应体系中进行pcr扩增。

pcr扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。将扩增产物与pmd19-t载体连接，转化大肠杆菌eha105中并测序。最后，获得hbft1的完整开放阅读框。

(2)5’及3’端utr

按照smart^tmcdnalibraryconstructionkit说明书进行构建racecdna文库(试剂盒购自clontech公司)，5’utr通过5’race获得，所用的接头引物共有3条，分别为：

qt：

ccagtgagcagagtgacgaggactcgagctcaagcttttttttttttttt；

q1：gaggactcgagctcaagc；和

q0：ccagtgagcagagtgacg。

5’race操作流程参照文献(迪芬巴赫cw，德维克斯勒gr.pcr技术实验指南.黄培堂译.北京:科学出版社,1998:268-277)。根据hbft1的cdna序列设计2条引物分别为：

hbft1-5uf：gtaaaagctggatacctcaggctcc；

hbft1-5ur：caccaacatgaaccctaggttggtt。

具体扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。

hbft1的3’utr通过3’race获得：所用的接头引物与5’race用到的3个接头引物一样，同时3’race操作流程也是参照文献(迪芬巴赫cw，德维克斯勒gr.pcr技术实验指南.黄培堂译.北京:科学出版社,1998:268-277)。先用qt引物作为反转录引物，反转录程序按反转录照说明书进行。之后分别以如下hbft1基因的gsp3^1st和q0为引物分别进行3组第一轮pcr，之后分别以50倍稀释pcr产物作为第二轮pcr的模版。进行第二轮pcr时，再分别以这2个基因的如下gsp3^2nd和q1组合为引物对进行第二轮pcr，产物通过电泳挖胶获得；

hbft1-gsp3^1st：gtgagcgacatccctggaaca；

hbft1-gsp3^2nd：cgaagacagacaatcaacccacc；

扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。5’及3’端race产物分别为122bp和113bp，产物经切胶纯化后，并进行克隆测序。

(3)hbft1基因全长的克隆

根据5’和3’utr的获得，再次设计能够扩增全长的特异引物：

hbft1-f：gtaaaagctggatacctcaggctccaaac；

hbft1-r：atggggtcaaatgtggtagaaaaat。

以橡胶树叶片和花序cdna混合为模版，进行目标基因hbft1全长的扩增。

扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃终延伸10min。获得的pcr产物与pmd19-t连接并进行测序，测序表明上述获得的片段即为本发明所需的橡胶树开花调控基因，记为hbft1，该片段具有序列表中seqidno：1所示的核苷酸序列，其全长为763个核苷酸，包含一个长度为528个核苷酸的开放阅读框(orf，自序列1的5＇端第123-650位核苷酸序列)、122个核苷酸的5’-utr(自序列1的5’端第1-122位核苷酸序列)和113个核苷酸的3’-utr(自序列1的5’端第651-763位核苷酸序列)，该基因编码一个长度为118个氨基酸(见序列表中seqidno：2)。

同时以巴西橡胶树热研7-33-97叶片基因组dna为模板，进行pcr扩增(程序同上所述)，测序结果表明获得橡胶树开花基因的基因组dna序列，该序列具有序列表中seqidno：3的核苷酸序列，共2692个核苷酸，包含了三个长度分别为144、1181和604个核苷酸的内含子(自序列3的5’端第323-466、529-1709和1751-2354位核苷酸序列)。

实施例2橡胶树hbft1基因组织特异性表达分析

本研究选取3月份采集的橡胶树7-33-97的10龄树的各个营养组织和繁殖器官(包括根、茎、古铜叶、变色叶、淡绿叶、变色叶、稳定叶、芽、第一发育阶段的花序、开花的雄花、开花的雌花)和8月份采集的果皮和种子，分别提取它们的rna备用。

对上述所获得的rna进过dnasei消化后按照反转录试剂盒进行反转录。通过荧光定量技术进行目标基因组织特异性表达分析。

定量引物为：

hbft1-qf：tacacatcaacggtacacaccagtc；

hbft1-qr：ccaaaacatcccctatcacacg。

如图1所示的结果显示，hbft1基因只在稳定叶、开花的雄花和雌花中有低量表达。

实施例3hbft1基因在两个不同树龄橡胶树不同季节的表达模式

以2龄树和10龄树的稳定叶为研究对象，从3月份开始采集材料，每个月采集一次，直至11月份为止。之后对hbft1基因进行荧光定量分析，定量引物同前述组织特异性表达分析引物。

如图2所示结果显示，hbft1基因在两个不同树龄橡胶树中表现出相似的表达模式，在3到6月份之间，hbft1基因表达量一直都很低，从7月份开始，两个树龄稳定叶中的hbft1表达量开始逐渐升高，其中10龄树稳定叶中的hbft1表达量在9月份最高，而2龄树稳定叶中的hbft1表达量则在10月份表现出最高。然后，两树龄树中hbft1表达量逐渐降低直至11月份，此时，hbft1基因表达量再次回到最低。更为重要的是，hbft1基因在10龄树中的表达量几乎都比2龄树中的要高。

实施例4不同光周期对hbft1基因表达的影响

将长势一样的40株3个月大的小苗平均分成两组，每组20株。其中一组培养在28℃长日照环境(16h光照/8h黑暗)；另外一组则培养在28℃短日照环境(8h光照/16h黑暗)。在两种环境下培养30天后，两组植株的叶片分别在一天之内(24h)每两个小时采集一次，一共采集12次。荧光定量分析同上。

如图3所示结果显示，hbft1基因在短日照环境下的表达量明显高于长日照环境下的表达量。在短日照环境下，hbft1基因从早上8点到晚上凌晨12点都表现出相对稳定的表达水平(除了中午12点时出现一个表达峰以外)，凌晨12点以后，其表达水平逐渐升高，在早上6点钟表现出最高的表达水平，然后又开始降低直至早上8点。在长日照环境下，hbft1基因虽然表达很低但亦表现出一些小的表达波动现象。

实施例5不同温度对hbft1基因表达的影响

将40株3个月大的小苗平均分成两组，每组20株。第一组植株种植在一个培养箱，里面设定28℃、32℃和36℃三个温度时段；另外一组则培养在另外一个培养箱里，里面分别设定28℃、24℃、20℃、16℃和8℃五个温度时段。每个温度持续3天，然后依次调到下一个温度。为了避免光周期和生物钟可能对hbft1表达的影响，统一在每天早上10点准时采样。

如图4所示的结果显示，在28℃时，hbft1基因表达量达到最高，当温度高于或者低于28℃时，其表达量会受到抑制，由此说明，28℃是橡胶树hbft1基因表达的最适合的诱导温度。

实施例6橡胶树hbft1基因转化野生型拟南芥的功能验证

利用pxcs植物表达载体(由中国热带农业科学院橡胶研究所保存)与hbft1基因连接构建转化拟南芥野生型转化载体。具体实施方案如下：

分别设计构建植物表达载体的目标基因的引物：所用到的用于构建植物表达载体的引物即为实施例1中所述基因的特异引物，其中基因的正引物5’端分别加有ecori酶切位点，反引物5’端分别加有xmai酶切位点。获得的pcr产物与pmd19-t载体连接并进行测序。最后，提取测序正确的质粒，用ecori和xmai分别双酶切pxcs和测序正确的质粒，通过t4dna连接酶构建hbft1目标基因的植物表达载体，并命名为pxcs-hbft1。

对于野生型拟南芥的侵染，参照文献(cloughsjandbentaf.1998.floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj16,735-743.)获得的t0代种子，先将其用自来水浸泡，并放置于4℃环境暗室里春化3天。之后播撒在经1/2m培养基浸泡过的蛭石上面于22℃长日照环境生长(16h/8h)，待小苗发芽时，用浓度为10mg/l的除草剂进行喷洒，以便筛选抗性植株。10天后，将生长正常的小苗移栽到营养土(营养土：蛭石＝2：1)中生长并等待收种。阳性植株的检测通过southern方法，此方法参照文献(blancg,baptistec,oliverg,martinf,montorop.2006.efficientagrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofembryogeniccalliandregenerationofheveabrasiliensismüllarg.plants.plantcellrep2006,24,724-733)。

将基因t3代转基因植株分别和野生型在相同环境中培养，并比较对它们进行开花表型比较，结果见图5及表1。

表135s::hbft1的野生型转基因拟南芥和野生型对照开花比较

*表示0.01<p<0.05；**表示p<0.01.

结果显示，所有35s::hbft1/wt的野生型转基因株系都能表现出不同程度的早花表型，野生型植株25天左右开花，而转基因株系在17-19天开花，开花时间和轮座叶数目确实比野生型的要少。除了叶片比较小和植株比较矮以外，与野生型拟南芥表型相似，都表现出正常的花序表型。

实施例7hbft1基因对ft-10突变体表型恢复验证实验

将构建好的hbft1目标基因植物表达载体转化拟南芥ft-10突变体中，参照文献(clough，s.j.andbent，a.f.(1998)floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj.16:735-743.)。获得的t0代种子，先将其用自来水浸泡，并放置于4℃环境暗室里春化3天。之后播撒在经1/2m培养基浸泡过的蛭石上面于22℃长日照环境生长(16h/8h)，待小苗发芽时，用浓度为10mg/l的除草剂进行喷洒，以便筛选抗性植株。10天后，将生长正常的小苗移栽到营养土(营养土：蛭石＝2：1)中生长并等待收种。

ft-10突变体转基因植株分别和野生型、ft-10突变体植株在相同环境中培养，并分别比较它们和野生型，ft-10突变体植株的开花表型，结果见图6和下表2。

表235s::hbft1的ft-10突变体转基因拟南芥和ft-10突变体以及野生型开花比较

*表示0.01<p<0.05；**表示p<0.01.

结果显示，ft-10突变体植株开花时间为42天左右，而ft-10突变体转基因植株都不同程度的出现了比ft-10突变体更早的早花表型，且选取的6株35s::hbft1/ft-10转基因株系甚至表现出比野生型拟南芥还要早的开花表型并长出更少的轮座叶和茎上叶。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110>中国热带农业科学院橡胶研究所

<120>一种橡胶树开花调控基因hbft1及其克隆与应用

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>763

<212>cdna

<213>橡胶树属橡胶

<400>1

gtaaaagctggatacctcaggctccaaacaatatatatatacatgcctgtatgtcattga60

attctacacatcaacggtacacaccagtccactactagctagtgcttctcatagttagaa120

aaatgcctagtgacagagatcctcttgctattgggcgtgtgataggggatgttttggacc180

ctttcgcaaggtctatctccctccaggtcacctacaatagcagagatcatgtcaccaatg240

gttgtgagctcaaaccctctcaaattgtcaaccaacctagggttcatgttggtggtgatg300

atttaaggaccttctatactttggttatggtggaccctgacgcacctagccccagtgacc360

caaatctcagagaatacttgcattggctggtgactgatattccagccactacagggacaa420

gctttgggcaagaggttgtgtgctatgagagcccagcaccatcggtggggattcatcggt480

ttgttttcatattgtttcggcaactggggaggcagaccgtgtatgcgcctggttggcgtc540

agaatttcaacactagagactttgctgagctttacaatcttggatcgccggtggccgctg600

tttactttaactgccagaggcagagtggcaccgggggaagaagatgctaactcatcaagt660

aataataatggggtccctttctccaaggttaatgagtactgaactgtatttccaaactat720

ctcaataatatttttctaccacatttgacctcataaaagaaat763

<210>2

<211>175

<212>prt

<213>橡胶树属橡胶

<400>2

metproseraspargaspproleualaileglyargvalileglyasp

151015

valleuaspprophealaargserileserleuglnvalthrtyrasn

202530

serargasphisvalthrasnglycysgluleulysproserglnile

354045

valasnglnproargvalhisvalglyglyaspaspleuargthrphe

505560

tyrtyrleuvalmetvalaspproaspalaproserproserasppro

65707580

asnleuargglutyrleuhistrpleuvalthraspileproalathr

859095

thrglythrserpheglyglngluvalvalcystyrgluserproala

100105110

proservalglyilehisargphevalpheileleupheargglnleu

115120125

glyargglnthrvaltyralaproglytrpargglnasnpheasnthr

130135140

argaspphealagluleutyrasnleuglyserprovalalaalaval

145150155160

tyrpheasncysglnargglnserglythrglyglyargargcys

165170175

<210>3

<211>2692

<212>dna

<213>橡胶树属橡胶

<400>3

gtaaaagctggatacctcaggctccaaacaatatatatatacatgcctgtatgtcattga60

attctacacatcaacggtacacaccagtccactactagctagtgcttctcatagttagaa120

attctacacatcaacggtacacaccagtccactactagctagtgcttctcatagttagaa180

ctttcgcaaggtctatctccctccaggtcacctacaatagcagagatcatgtcaccaatg240

gttgtgagctcaaaccctctcaaattgtcaaccaacctagggttcatgttggtggtgatg300

atttaaggaccttctatactttggtaacttcttcttcttcttcttcttcttcttcttctt360

ctttcataatagaatcttattatgcacatttggtttctgtatatatcctatggtttttta420

cgtgtgagagatagatatatggttgagattctattcgctcgacgcaggttatggtggacc480

ctgacgcacctagccccagtgacccaaatctcagagaatacttgcattggtaccttcttg540

attctctctccttctctctggcctccactattcacacacaactacacgtatatgcacgtt600

tgagttttggtgctctaggcttaattaatatatgatatctaatatatatgtattcattca660

ttttcatctttctgaaacaaacttcaacaatataatccatgcacaaagcctccctcttca720

actaaccgggcatgggtgaattgtcaatagcttggagagttaatggtagttggcgactta780

cactcgtggaaatcatcaagccccatatgaaagcttacaaagctatctatagaaagcgag840

atgtggtagtgccaccatataatataacatcaaaaatttattttatatgtgaattttata900

ttttatcttgaattcattgtgaattgaatctaaataagaattttcctgcttatcctcatt960

ccatacttgcttctagaaatagatacacacctgtctttcttctactcctctgtgcaactt1020

tttttttttcagtaattaattgattggccccgaatttttcaagactgacttaaaagaata1080

aggttttatttaatatctctagagcctatgctcttttatatgcatggaataattataaac1140

atatgagtgcatggtatactaaattttagtacacaagaaatatcttataaatttctaaag1200

aatgaatatatgcatatggaattaggacgataaagaacttaaaaaattaaatattgagat1260

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tcttaacctcaagtgacaattatgtatcacttatagaatgatcatgtctaattaaattaa1440

taattcaacaatcgagtgcttcattacttcacaatgtaaatgacgcaaaaaaatgccttc1500

tcgccatcctagtctatgggctgcctgcataagacatcacatcaaaaggaatcgatgatc1560

gaggtccatcatcttttcgatgaagtaggggcttaaatacaaattcattgttattgaata1620

ttgtgtgcgataattaagaggaattaatacaactcaaggctagctgattatgtgaactaa1680

cagactgtttcttttatgaaatttttgtaggctggtgactgatattccagccactacagg1740

gacaagctttggtgagtagatttaattaccttaaaattttttatatatccttcattttga1800

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