检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用与流程

本申请涉及生物医学领域临床检测技术中的和核酸检测
技术领域：
，尤其涉及检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用。
背景技术：
：华法林是目前临床常用的口服抗凝药，广泛用于深静脉血栓、慢性房颤、肺栓塞及心脏掰膜置换术后的治疗。作为口服抗凝药，华法林在很多方面有其不可取代性，但是由于华法林本身的一些特点，如有效治疗窗窄、个体间剂量差异大，导致其临床使用严重不足，影响了疗效的发挥。现有研究表明，cyp2c9和vkorc1基因多态性很大程度上与华法林计量个体间差异相关，因此，根据患者cyp2c9和vkorc1基因型来指导华法林剂量，比传统的经验型剂量调整用药，对患者的疗效获益及避免出血等不良事件的发生有重要意义。目前，检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的方法多种，包括测序法、聚合酶链反应-限制性长度多态性技术、芯片法以及荧光定量pcr法等。其中，荧光定量pcr法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用单个反应管检测单一靶核苷酸，这就造成检测过程中需要较多的反应管，且每个反应管都需要进行重复的pcr扩增与荧光信号采集动作，从而造成检测过程繁杂，且费时、费力。若在单个反应管检测多个靶核苷酸，由于要同时引入检测不同靶核苷酸的引物和探针序列，这些引入的引物和探针会因为互相之间存在杂交而产生干扰。cyp2c9基因430位点、1075位点与vkorc1基因-1639位点皆有一个点突变，较难找到既能区别野生型和突变型，且又能在单管中不会互相干扰的引物探针设计。同时，检测过程中，为了规避假阴性，需要加入内对照靶核酸序列以及能检测内对照靶核酸序列的引物探针，进一步加剧了单管多重pcr技术的困难。另外，待检样品通常需经过繁琐的核酸提取、纯化过程来获得较高纯度的模板dna，增加操作的步骤，费时费力，同时也增加人为操作误差导致的假阳性率和假阴性率。技术实现要素：本申请提供了一种检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用，以解决现有的cyp2c9和vkorc1基因多态性检测过程中，需要采用单个反应管检测单一靶核苷酸，造成检测过程繁杂、费时费力的问题。第一方面，本申请提供了一种检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的组合物，其特征在于，包括用于检测cyp2c9基因430位点、1075位点和vkorc1基因-1639位点多态性的引物，其中，所述检测cyp2c9基因430位点多态性的引物包括序列如seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示的引物；所述cyp2c9基因1075位点多态性的引物包括序列如seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示的引物；所述vkorc1基因-1639位点多态性的引物包括序列如seqidno7、seqidno.8和seqidno.9所示的引物；所述组合物还包括用于检测cyp2c9基因430、1075位点和vkorc1基因-1639位点多态性的探针，其中，检测所述cyp2c9基因430位点多态性的探针序列为seqidno.12；检测所述cyp2c9基因1075位点多态性的探针序列为seqidno.13；检测所述vkorc1基因-1639位点多态性的探针序列为seqidno.14。可选地，所述组合物还包括用于检测cyp2c9和vkorc1基因430位点、1075位点、-1639位点多态性的内标引物及内标探针，所述内标引物序列如seqidno.10和seqidno.11所示，所述内标探针序列如seqidno.15所示。第二方面，本申请还提供了一种检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒，所述试剂盒含有pcr检测试剂a和pcr检测试剂b，其中，所述pcr检测试剂a包含序列如seqidno.1、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15的多种引物和探针；所述pcr检测试剂b包含序列分别如seqidno.2、seqidno.3、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.10、seqidno.11的多种引物和探针。可选地，所述样本溶解液包含tris-hcl缓冲液、十二烷基硫酸钠、edta、甘油和蛋白酶k。可选地，所述试剂盒还包括野生型对照品、突变型对照品和空白对照品，其中，所述野生型对照品为包含有cyp2c9和vkorc1基因多态性位点430位点、1075位点、-1639位点的野生型重组质粒以及包含有内标基因的重组质粒的混合物；所述突变型对照品为包含有cyp2c9和vkorc1基因多态性位点430位点、1075位点、-1639位点的突变型重组质粒以及包含有内标基因的重组质粒的混合物；所述空白对照为不包含cyp2c9和vkorc1基因多态性位点及内标基因的生理盐水。第三方面，本申请还提供了一种检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的方法，包括如下步骤：1)取预处理好的基因组核酸样本2份，将2份基因组核酸样本分别与所述pcr检测试剂a和pcr检测试剂b混合，其中，seqidno.14、seqidno.13、seqidno.12所示探针分别被rox、cy5、fam荧光标记，seqidno.15所示探针被vic或hex荧光标记；进行pcr扩增反应，采集fam、cy5、rox以及hex荧光信号；2)结果判断：当野生型对照品和突变型对照品有fam、cy5、rox以及hex荧光信号起线，空白对照均无fam、cy5、rox以及hex荧光信号起线，样品检测管vic或hex的ct≤35时，判断实验成功；根据两个样品检测管a、b中fam荧光信号的δct值情况判读cyp2c9基因430位点的分型，根据两个样品检测管a、b中cy5荧光信号的δct值情况判读cyp2c9基因1075位点的分型，根据两个样品检测管a、b中rox荧光信号的δct值情况判读vkorc1基因-1639位点的分型。可选地，pcr扩增反应的反应条件具体包括：ung酶反应的反应温度50℃、持续时间2分、循环数1次；taq酶活化的反应温度95℃、持续时间5分、循环数1次；cdna/dna变性的反应温度95℃、持续时间15秒、循环数5次；退火、延伸的反应温度58℃、持续时间32秒、循环数5次；cdna/dna再变性的反应温度95℃、持续时间15秒、循环数40次；退火、延伸及荧光采集的反应温度60℃、持续时间32秒、循环数40次；仪器冷却的冷却温度25℃、持续时间10秒、循环数1次。可选地，基因分型判读遵循如下规则：当seqidno.15所示探针被vic荧光标记时，cthex为ctvic；若rox/cy5/fam判定无ct值，则默认为ct值为40，将各ct值列入基因型计算公式中计算δct值，并根据计算的δct值与基因型的对应关系，判读基因分型，其中，基因型计算公式为：δctfam＝ctfam(b)-ctfam(a)-(cthex(b)-cthex(a))，δctcy5＝ctcy5(b)-ctcy5(a)-(cthex(b)-cthex(a))，δctrox＝ctrox(b)-ctrox(a)-(cthex(b)-cthex(a))。第四方面，本申请还提供了上述检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒在检测cyp2c9和vkorc1基因多态性方面的应用。本申请提供一种检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用，用于对cyp2c9和vkorc1基因进行分型。本申请提供的检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒及其方法，通过提供一组用于检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的组合物，组合物内的引物与探针互不干扰、且无交叉污染，可在单个pcr反应管内的进行多重检测，即在单个pcr反应管内实现对多个靶核酸的扩增反应与荧光信号采集。与现有的检测方法相比，本申请的检测过程中，使用的反应管数量较少，且无需多次、重复的进行pcr扩增与荧光信号采集动作，使检测过程得到简化，节省了大量的人力、财力。本申请提供的检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒及其方法的特异性强、灵敏度高、重复性，且判定准确度高，另外，其操作便捷、省时省力，能够满足临床需要，便于推广使用。附图说明为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例一cyp2c9和vkorc1基因型的三重检测的检查结果图；图2为实施例二cyp2c9和vkorc1基因型的三重检测的检查结果图；图3为实施例三cyp2c9和vkorc1基因型的三重检测的检查结果图；图4为实施例四cyp2c9和vkorc1基因型的三重检测的检查结果图。具体实施方式为实现对待检样品的cyp2c9和vkorc1基因型的同时检测，本申请中，筛选优化出互不干扰的引物与探针。针对cyp2c9基因430位点，优选其高度保守区域作为扩增区域，针对该区域设计的引物对序列为野生型引物seqidno.1和突变型引物seqidno.2，下游引物为序列为seqidno.3，探针序列为seqidno.12。针对cyp2c9基因1075位点，优选其高度保守区域作为扩增区域，针对该区域设计的引物对序列为野生型引物seqidno.4和突变型引物seqidno.5，下游引物为序列为seqidno.6，探针序列为seqidno.13。针对vkorc1基因-1639位点，优选其高度保守区域作为设计区域，针对该区域设计的引物对序列为野生型引物seqidno.7和突变型引物seqidno.8，下游引物为序列为seqidno.9，探针序列为seqidno.14。其中，上述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同。综上，本申请提供一种检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的组合物，其包括用于检测cyp2c9基因430位点、1075位点和vkorc1基因-1639位点多态性的引物，其中，检测cyp2c9基因430位点多态性的引物包括序列如seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示的引物。cyp2c9基因1075位点多态性的引物包括序列如seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6所示的引物。vkorc1基因-1639位点多态性的引物包括序列如seqidno7、seqidno.8和seqidno.9所示的引物。组合物还包括用于检测cyp2c9基因430、1075位点和vkorc1基因-1639位点多态性的探针，其中，检测cyp2c9基因430位点多态性的探针序列为seqidno.12；检测cyp2c9基因1075位点多态性的探针序列为seqidno.13；检测vkorc1基因-1639位点多态性的探针序列为seqidno.14。组合物还包括用于检测cyp2c9和vkorc1基因430位点、1075位点、-1639位点多态性的内标引物及内标探针，内标引物序列如seqidno.10和seqidno.11所示，内标探针序列如seqidno.15所示。应当说明，本申请中涉及的序列具体见表1。表1序列表seqidno.1gaagaggagcattgaggaccseqidno.2gaagaggagcattgaggactseqidno.3actatcttctctactgacattseqidno.4gtgcacgaggtccagagatacaseqidno.5gtgcacgaggtccagagataccseqidno.6taagtttgtttctcctacaseqidno.7tgaaaaacaaccattggccgseqidno.8tgaaaaacaaccattggccaseqidno.9ctggccaacatggtgaaaseqidno.10gccaggagatcatcgaccseqidno.11gccaggagatcatcgactseqidno.12cagggtccaaggcactgggseqidno.13atcctagcattttgggaggccgaggseqidno.14gtcggggaacagaggatagcseqidno.15ccagtacgactccacccatggaaagtaca本申请还提供一种检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒，用于检测cyp2c9和vkorc1基因型，试剂盒内包括上文所述的检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的组合物。本申请的试剂盒内含有pcr检测试剂a和pcr检测试剂b，其中，pcr检测试剂a包含序列如seqidno.1、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15的多种引物和探针。试剂a用于检测cyp2c9基因430位点、1075位点和vkorc1基因-1639位点的野生型。pcr检测试剂b包含序列分别如seqidno.2、seqidno.3、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.10、seqidno.11的多种引物和探针。试剂b用于检测cyp2c9基因430位点、1075位点和vkorc1基因-1639位点的突变型。试剂盒还包括样本溶解液，样本溶解液包含tris-hcl缓冲液、十二烷基硫酸钠、edta、甘油和蛋白酶k。实际使用时，将样本溶解液与待检样品混合，经短暂静置后制得基因组核酸样本，该基因组核酸样本可配合pcr检测试剂a和b直接进行实时荧光pcr扩增，无需经过复杂繁琐的核酸提取纯化步骤，减少了操作的步骤，省时省力，并降低了人为操作误差导致的假阳性率和假阴性率。另外，本申请中，对pcr扩增反应中dntps、酶、氯化镁等组分的使用浓度进行优化。此外，还可增加其他pcr所需反应试剂，如ph缓冲剂和盐，其中，ph缓冲剂优先选择的是bicine-koh、k-acetate，盐优先选择的是kcl。当然，还可加入用于延长酶在pcr条件下的活性甘油，以及用于蛋白酶保护剂的bsa(牛血清白蛋白)。为确保对靶核酸检测的具有高特异性、高灵敏度和高重复性，并且单个pcr反应管内混合体系中的各个引物与探针之间不发生互相干扰，本申请中，单个pcr反应管内各个引物与探针的工作浓度进行优化。表2为pcr检测试剂a所在的单个pcr反应管内混合体系内的环境范围，表3为pcr检测试剂b所在的单个pcr反应管内混合体系内的环境范围。表2pcr检测试剂a所在的单个pcr反应管内混合体系内的环境范围表3pcr检测试剂b所在的单个pcr反应管内混合体系内的环境范围序号组分终浓度1bicine-kohph8.2100mm2k-acetate125mm3glycerol8％(v.v)4bsa20μg/ml5kcl5mm6edta1μm7tthdnapolymerase1u/test8taqdnapolymerase2u/test9dntps2mm10mgcl22.5mm11seqidno.215pmol/test12seqidno.315pmol/test13seqidno.515pmol/test14seqidno.615pmol/test15seqidno.815pmol/test16seqidno.915pmol/test17seqidno.1015pmol/test18seqidno.1115pmol/test19seqidno.125pmol/test20seqidno.135pmol/test21seqidno.145pmol/test22seqidno.155pmol/test试剂盒还包括野生型对照品、突变型对照品和空白对照品，其中，野生型对照品为包含有cyp2c9和vkorc1基因多态性位点430位点、1075位点、-1639位点的野生型重组质粒以及包含有内标基因的重组质粒的混合物。突变型对照品为包含有cyp2c9和vkorc1基因多态性位点430位点、1075位点、-1639位点的突变型重组质粒以及包含有内标基因的重组质粒的混合物。空白对照为不包含cyp2c9和vkorc1基因多态性位点及内标基因的生理盐水。为便于本领域技术人员更好的理解本申请试剂盒的组成，以下将提供一个实例，表4为实例中试剂盒的组成。表4试剂盒的组成本申请还提供一种检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的方法，即使用本申请试剂盒检测cyp2c9和vkorc1基因型，其包括以下步骤：步骤s101，取预处理好的基因组核酸样本2份。本申请中，基因组核酸样本预处理过程包括：用1.5mlep管取50μl人口腔拭子悬液(或抗凝血)，加入100μl细胞沉淀剂(或红细胞裂解液)，移液器吹打数次混匀，10000rpm/min离心1min弃上清，再加入100μl样本溶解液，室温静置10min，震荡混匀。应当说明，本申请中，待检样品是含有靶核酸的离体样品，如血液、血液制品、脱落细胞等。进行基因组核酸样本获取时，将待检样品与样本溶解液混匀、并短暂静置后，获得基因组核酸样本，该基因组核酸样本可配合pcr检测试剂a和b直接进行实时荧光pcr扩增。步骤s102，将2份基因组核酸样本分别与pcr检测试剂a和pcr检测试剂b混合。本申请中，pcr检测试剂a置于一单个pcr反应管内，pcr检测试剂a与基因组核酸样本混合，用于检测cyp2c9基因430位点、1075位点和vkorc1基因-1639位点的野生型。pcr检测试剂b置于另一单个pcr反应管内，pcr检测试剂b与基因组核酸样本混合，用于检测cyp2c9基因430位点、1075位点和vkorc1基因-1639的突变型。本步骤中，在两个单个pcr反应管内各加入一份步骤s101中预处理的基因组核酸样本，使基因组核酸样本分别与pcr检测试剂a和pcr检测试剂b混合均匀。本领域技术人员可根据实际需要，调整基因组核酸样本、pcr检测试剂a和b的用量，例如，45ulpcr检测试剂a、45ulpcr检测试剂b、5ul基因组核酸样本，其属于本申请的保护范围。步骤s103，进行pcr扩增反应。pcr扩增反应为本领域技术人员常用的技术，在此不对其进行赘述。为了平衡不同种核酸的扩增条件，本申请中，根据引物及相应需要pcr扩增的核酸，设计了适用于本申请多重检测的pcr反应条件，表5为本申请的pcr扩增反应条件。表5本申请的pcr扩增反应条件步骤s104，采集fam、cy5、rox以及hex或vic荧光信号。将完成pcr扩增反应的pcr反应管置于荧光pcr仪中进行荧光pcr扩增反应，并采集荧光信号。seqidno.12、13、14所述的探针可被不同检测波长的荧光标记，本申请中，其荧光标记分别为fam、cy5和rox，内对照探针的荧光标记为hex或vic，各靶核酸采用的荧光标记如表6所示。表6各靶核酸对应的荧光标记种类探针荧光波长nmcyp2c9基因430位点seqidno.12fam520±5cyp2c9基因1075位点seqidno.13cy5650±5vkorc1基因-1639位点seqidno.14rox520±5内对照seqidno.15hex550±5应当说明，不同种探针之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这样就能够同时且快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变化，从而能够进行同时检测。在本文中，探针具有本领域技术人员所熟知的含义，其为能与扩增出的靶核酸单链结合的单链dna。通常，在每种探针的核苷酸序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。采用的荧光基团及淬灭基团是市售的，如可以采用fam/sybr-green、vic/joe/hex、ned/tamra/cy3、rox/texasred和cy5等常规产品，它们的检测波长互不相同，也可以委托公司直接合成有荧光标记的探针。应当说明，本申请中“单个pcr反应管”指实时荧光pcr方法在技术上是在同一个容器中进行的，没有必要更换容器。最优选择的容器是pcr反应管，当然，其他可以进行pcr反应并可进行实时荧光检测的容器也在本申请的保护范围内。在申请中，在同一个容器中就可完成pcr扩增和实时检测的步骤，整个过程不必更换容器，操作者只需要向容器中加入样品与各种测试试剂即可，然后通过实时荧光pcr仪完成目标基因位点的检测，检测过程方便、便捷，非常方便于使用者，也便于机械实现自动化。在本文中，“多重检测”是指在单个pcr反应管内同时检测多种靶核酸，即至少一种。在申请中，由于至少检测了内对照和一种把核算，因此检测的核酸至少有两种。当要检测的靶核酸种类不止一种时，同时检测的核酸相应增加，其中，每种核酸只能是dna。在本发明的具体实施方式中，优先选择进行二重检测、三重检测检测。步骤s105，根据采集fam、cy5、rox以及vic或hex荧光信号，判断cyp2c9和vkorc1的基因型。当野生型对照品和突变型对照品有fam、cy5、rox以及vic或hex荧光信号起线，空白对照均无fam、cy5、rox以及vic或hex荧光信号起线，样品检测管vic或hex的ct≤35时，判断实验成功。应当说明，在实时荧光pcr反应中，ct值表示每个pcr反应管内荧光信号到达实时荧光pcr仪所默认设定的阈值时所经历的循环数，其具有良好的再现性，因此，可以用于作为判断结果的良好指标。本实施例中，设定阈值选为3-10循环的荧光信号的标准偏差的10倍。根据两个样品检测管a、b中fam荧光信号的δct值情况，判读cyp2c9基因430位点的分型，其基因型计算公式为：δctfam＝ctfam(b)-ctfam(a)-(cthex(b)-cthex(a))。根据两个样品检测管a、b中cy5荧光信号的δct值情况判读cyp2c9基因1075位点的分型，其基因型计算公式为：δctcy5＝ctcy5(b)-ctcy5(a)-(cthex(b)-cthex(a))。根据两个样品检测管a、b中rox荧光信号的δct值情况判读vkorc1基因-1639位点的分型，其基因型计算公式为：δctrox＝ctrox(b)-ctrox(a)-(cthex(b)-cthex(a))。当seqidno.15所示探针被vic荧光标记时，cthex为ctvic；若rox/cy5/fam判定无ct值，则默认为ct值为40，列入对应的计算公式中计算δct，并根据δct与基因型的对应关系，判定cyp2c9和vkorc1基因型，其中，δct与基因型的对应关系如下表7所示。表7δct与基因型的对应关系以下给出几类cyp2c9和vkorc1基因型对应的三重检测的检查结果图。实施例一待检样品选自430杂合子、1075纯合子、-1639纯合子的个体。图1为实施例一cyp2c9和vkorc1基因型的三重检测的检查结果图，图中，横坐标cycle为循环数，纵坐标δrn为荧光强度，amplificationplot为扩增曲线。根据图1的检测结果可判定，该待检样品基因型为430ct、1075aa、-1639gg。实施例二待检样品选自430纯合子、1075纯合子、-1639纯合子的个体。图2为实施例二cyp2c9和vkorc1基因型的三重检测的检查结果图，根据检测结果可判定，该待检样品基因型为430cc、1075aa、-1639gg。实施例三待检样品选自430纯合子、1075纯合子、-1639纯合子的个体。图3为实施例三cyp2c9和vkorc1基因型的三重检测的检查结果图，根据检测结果可判定，该待检样品基因型为δ430cc、1075aa、-1639gg。实施例四待检样品选自430纯合子、1075纯合子、-1639杂合子的个体。图4为实施例四cyp2c9和vkorc1基因型的三重检测的检查结果图，根据检测结果可判定，该待检样品基因型为430cc、1075aa、-1639ga。本申请还提供一种上述试剂盒在检测cyp2c9和vkorc1基因多态性方面的应用。本申请提供一种检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的组合物、试剂盒、方法及应用，用于对cyp2c9和vkorc1基因进行分型。本申请提供的检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒及其方法，通过提供一组用于检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的组合物，组合物内的引物与探针互不干扰、且无交叉污染，可在单个pcr反应管内的进行多重检测，即在单个pcr反应管内实现对多个靶核酸的扩增反应与荧光信号采集。与现有的检测方法相比，本申请的检测过程中，使用的反应管数量较少，且无需多次、重复的进行pcr扩增与荧光信号采集动作，使检测过程得到简化，节省了大量的人力、财力。本申请提供的检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的试剂盒及其方法的特异性强、灵敏度高、重复性，且判定准确度高，另外，其操作便捷、省时省力，能够满足临床需要，便于推广使用。以上所述的本申请实施方式并不构成对本申请保护范围的限定。当前第1页12