一种人类免疫缺陷病毒检测试剂盒的制作方法

[0001]
本发明涉及一种人类免疫缺陷病毒检测试剂盒，属于检测试剂盒领域。


背景技术：

[0002]
自首例病例被发现至今，hiv感染已在全世界广泛蔓延，成为一种严重危害人类生命健康和社会经济发展的传染性疾病。who估计全世界累计有超过6500万人感染，死亡人数接近2500万人。虽然艾滋病不是一种遗传性疾病，但人体对hiv-1的易感性，除病毒本身和个体的行为因素外，宿主的遗传因素也起了重要作用，一些个体的不感染和长期不进展现象完全是宿主本身的遗传背景造成的。发现艾滋病易感性和疾病进程相关的基因是揭示hiv发病机理、研发新的治疗药物和疫苗的一个重要突破口。
[0003]
1996年研究者发现了首个艾滋病相关基因ccr5
△
32，ccr5
△
32纯合子携带者对病毒几乎拥有完全的抵御力。该发现不但首次证明了ccr5是感染细胞的辅助受体，而且因此掀起了寻找艾滋病相关基因的高潮，发现了许多与艾滋病易感性、疾病进程快慢、治疗效果等因素有关的基因。最近五年，snp基因分型技术取得了长足的进展，使进行大样本、大量位点的研究成为可能。
[0004]
anrs01以anrs primo队列的606名有血清转换时间的欧洲白人为样本，以感染初期病毒载量为观察指标，最终发现rs2396029、rs13199524、rs12198173和rs309366四个位点有显著差异。此外，在候选基因研究方面，美国研究者报道部分与疾病进程有关的经典位点对haart疗效有相关关系。而亚洲人群遗传背景与欧美、非洲裔人群均有较大区别，因此对于中国人群相关的snp位点与疾病进程的关系进行研究，对于临床研究和诊断具有重要的意义。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种人类免疫缺陷病毒检测试剂盒。
[0006]
为实现上述发明目的，本发明采用的人类免疫缺陷病毒检测试剂盒的技术方案如下：
[0007]
所述试剂盒包括三对扩增引物、多重pcr混合反应液，其中扩增引物用于扩增肥胖基因多态性位点，包括rs13199524位点、rs12198173位点和/或rs3093662位点中的至少两个位点，每对引物分别对应一个snp位点的上下游区域。
[0008]
优选的，所述rs13199524位点的扩增引物序列如序列表seq id no：1～2所示。
[0009]
优选的，所述rs12198173位点的扩增引物序列如序列表seq id no：3～4所示。
[0010]
优选的，所述rs3093662位点的扩增引物序列如序列表seq id no：5～6所示。
[0011]
优选的，所述多重pcr混合反应液包括dna聚合酶、mg
2+
和dntps。更进一步优选的，多重pcr混合反应液中还包括pcr稳定剂和增强剂。
[0012]
优选的，所述扩增体系中，每个snp位点的扩增引物和模板的加入量相同。
[0013]
本发明中的检测试剂盒一般采用处理过的dna样品作为扩增模板，样品一般来源于人全血或组织，处理样品可以减少血液中的免疫球蛋白g、血红蛋白和乳铁蛋白对pcr反应体系的干扰。
[0014]
优选的，所述检测试剂盒还包括全血样品pcr缓冲液，所述缓冲液含有100mmol/l tris-hcl，50mmol/l kcl，ph 9.3～9.5。全血样品pcr缓冲液是本发明的一种优选的实施方案，其他类型的全血pcr试剂均可以采用，不限于本发明中的缓冲液和缓冲液配方。
[0015]
优选的，试剂盒扩增体系为50μl的pcr体系，体系中同时含有rs13199524位点、rs12198173位点和/或rs3093662位点中至少两对的扩增引物。
[0016]
所述扩增体系具体为：
[0017]
2
×
platinum multiplex pcr master mix 25μl；
[0018]
模板2μl；
[0019]
rs13199524、rs12198173和/或rs3093662中至少两对上下游引物(10μmol/l)各1μl；无菌双蒸水补齐至50μl。
[0020]
pcr反应条件：95℃预变性10min；然后95℃变性30s，65℃退火90s，72℃延伸60s，45个循环后，再次72℃延伸10min，恢复至4℃。
[0021]
本试剂盒中一般采用提纯处理后的dna样本进行扩增检测。但本试剂盒中还包括全血扩增缓冲液，便于将采集到的人全血样品直接进行扩增。
[0022]
本发明的另一个目的在于提供一种hiv病毒检测试剂盒的检测方法，所述检测试剂盒采用多重pcr的检测方法同时扩增rs13199524位点、rs12198173位点和/或rs3093662中至少两个位点，扩增后检测扩增产物。
[0023]
本发明的第三个目的在于提供hiv检测试剂盒的的应用，所述检测试剂盒在检测hiv预防能力、发病风险和/或预后中的应用。本试剂盒检出的hiv风险，不仅可以用于检测hiv风险，并且对于由hiv引起的各类疾病的发病风险均有一定的指导作用。
[0024]
与现有技术相比，本发明采用人类免疫缺陷病毒检测试剂盒采用多重pcr的扩增方法，同时扩增与hiv相关的三个重要snp位点，且可以根据实际需要灵活选择扩增的位点组合，可以起到一盒多用的作用，试剂盒中的引物特异性高，错配率低，引物长度和t
m
值设计合理，扩增产物便于检测分离。一次扩增多条目的产物，不仅大大提高了扩增效率，降低了扩增成本。这种检测试剂盒可以扩展延伸到其他的snp位点检测中，具有良好的推广价值。
具体实施方式
[0025]
下面结合实施例对本发明提供的人类免疫缺陷病毒检测试剂盒作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0026]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
[0027]
一、设计引物
[0028]
根据ncbi中公布的多态性位点进行引物设计，rs13199524位点为“c/t”碱基突变，以“y”表示。具体序列如下：
[0029]
ttgtttgttt gagacggagt ttcactctta ttgcccaggc tggagtgcag tggtgcgatc
[0030]
tcagctcacc acaacctccg cctcccaggt ccaagcgatt ctcctgcctc agcctcctga
[0031]
gtagctggga ttacaggcat gccccaccat gcctggctaa ttttgtactt ttagtagaga
[0032]
ccgggtttct ccatgtcggt caggctggtc tcagactcct aacctcaggt gatctgctcg
[0033]
cctcagcctc ccaaagtgct gggattacag gcatgagcca ccgcacccgg ctctacactg
[0034]
gtcttttgtt tttcccacga gcactacaag ctctcactac tccaagggcc tttgcattgt
[0035]
gtgttcccta tgtctgggat gctcttcact ctgctcataa aggctggctc catcttcaaa
[0036]
tcttaactcc cagttagggc agtcttccat tactctctat cacaatatcc tgttcctgtt
[0037]
cttcatggca tttactgctg
[0038]
y
[0039]
ctgagttatc agtttactta ttacctttct ctcaatgcta caatgggagc tccatgagaa
[0040]
caaggacctc atctatccca ggactgctgt atacttgtgt ctggcacata aatgttctat
[0041]
ctgacacatc aatgttgaat gaattagtgg atgagtacct agggccaatc cttccccaaa
[0042]
cacctggatc ccagctccta ctgtcttcta agaaaagtgc agattatctt ctccctctct
[0043]
ctctcacttt tttttttttt tttgagatgg aatcttactc tgtcgcccag gctggagtgc
[0044]
agtggtgcga tctcggctca ctgcaacctc tgtctcctag ctcaagtgat tttcctgcct
[0045]
cggcctcctg agtagctggg attataggtg cccacctcca tgcccagcta atttttgtat
[0046]
ttttagtaga aatgaggttt caccatgtag gcaggctggt ctcgaactcc tgaccacaag
[0047]
tgatgtgccc gccttggcct
[0048]
根据ncbi中公布的多态性位点进行引物设计，rs12198173位点为“a/g”碱基突变，以“r”表示。具体序列如下：
[0049]
gtgactcttg gaataagagc cggtgaggta tccccgagcc cccggcctgt actgctggca
[0050]
gagctgcact gttagaaacc tccagaaggc aactgagaca tagtgtcagg agccaaagta
[0051]
attctcattt cctttgaccc aataatccca gttctgggca tctgtcctaa gaaaattatt
[0052]
aaagcaggaa aaagttatag catggaagaa ctcacgatgg ggttattcat gacagcagat
[0053]
gtgtcaggaa cacaaatgac ccgtagaaga tgattaattt tgttatagtg ctttcaccgc
[0054]
aacgcatcaa ataaccattg aaacgatgat gaatgctggt tgtgtagccg tgaggtgaat
[0055]
gattacaatg tacttgtgta caaaaaagga agtgccaaga actttatgaa cactgattgc
[0056]
aactttaaaa cacgctctgc atgcaaaata caggaaggga atgtgcacta cacacattgt
[0057]
tattaatgcc ggcagctggg
[0058]
r
[0059]
gagaaagtag gactatgaga ttcttgtttt ctgtttttca agctttccac ataatgttgc
[0060]
tgtattattt tcactagaaa aacgtgggct aaaaaagaaa ttctgggctg ggagcagtgg
[0061]
ttcacgcctg taatcctagc attttgggag gccgaggcgg gtggatcacc tgaggttggg
[0062]
aattcgagtc tagcttggcc aatatcatga aacccggtct ctactgaaaa tacaaaaatt
[0063]
agccaggcgt ggtggcatgc acctgtaatc ccagctactc aggaggctga ggcaggacaa
[0064]
tcacttgaac ctgggaggca gaggttgcag tgagctgaga tcacaccact gcactccagc
[0065]
ctgggcaaca gagtgagact cagtctcaaa aaaaaaaaaa aaaaagaaaa agaaagaaag
[0066]
aaattctggg ctacaacaat taataataga gtgtggggtg ggggtggggc agcaatacac
[0067]
atagaacagg aggggcaggg
[0068]
根据ncbi中公布的多态性位点进行引物设计，rs3093662位点为“a/g”碱基突变，以“r”表示。具体序列如下：
[0069]
cccccagagg gaagaggtga gtgcctggcc agccttcatc cactctccca cccaagggga
[0070]
aatggagacg caagagaggg agagagatgg gatgggtgaa agatgtgcgc tgatagggag
[0071]
ggatggagag aaaaaaacgt ggagaaagac ggggatgcag aaagagatgt ggcaagagat
[0072]
ggggaagaga gagagagaaa gatggagaga caggatgtct ggcacatgga aggtgctcac
[0073]
taagtgtgta tggagtgaat gaatgaatga atgaatgaac aagcagatat ataaataaga
[0074]
tatggagaca gatgtggggt gtgagaagag agatggggga agaaacaagt gatatgaata
[0075]
aagatggtga gacagaaaga gcgggaaata tgacagctaa ggagagagat gggggagata
[0076]
aggagagaag aagatagggt gtctggcaca cagaagacac tcagggaaag agctgttgaa
[0077]
tgcctggaag gtgaatacac
[0078]
r
[0079]
gatgaatgga gagagaaaac cagacacctc agggctaaga gcgcaggcca gacaggcagc
[0080]
cagctgttcc tcctttaagg gtgactccct cgatgttaac cattctcctt ctccccaaca
[0081]
gttccccagg gacctctctc taatcagccc tctggcccag gcagtcagta agtgtctcca
[0082]
aacctctttc ctaattctgg gtttgggttt gggggtaggg ttagtaccgg tatggaagca
[0083]
gtgggggaaa tttaaagttt tggtcttggg ggaggatgga tggaggtgaa agtagggggg
[0084]
tattttctag gaagtttaag ggtctcagct ttttcttttc tctctcctct tcaggatcat
[0085]
cttctcgaac cccgagtgac aagcctgtag cccatgttgt aggtaagagc tctgaggatg
[0086]
tgtcttggaa cttggagggc taggatttgg ggattgaagc ccggctgatg gtaggcagaa
[0087]
cttggagaca atgtgagaag
[0088]
针对上述序列设计特异性扩增引物，便于进行快速高效的扩增。引物序列如下：
[0089][0090]
本实施例采用多重pcr法对三个snp位点进行同时或任意组合扩增后检测。
[0091]
二、试剂盒组成
[0092]
本实施例中的快速检测试剂盒为针对三个相关性较高的snp位点进行同时扩增的多重pcr试剂盒，其中包括三对snp位点的上下游扩增引物及扩增模板提取试剂、多重pcr混合反应液，反应液包括dna聚合酶、mg
2+
、dntps、pcr稳定剂和增强剂。
[0093]
本实施例试剂盒中采用的dna模板为处理后提取的人血dna模板，对于采集的人全血或组织来说，需要预先进行处理。如待扩增样品为未经处理的全血样品，需采用用于全血样品pcr的缓冲液，其中含有100mmol/l tris-hcl，50mmol/l kcl，ph 9.3～9.5。
[0094]
三、多重pcr
[0095]
多重pcr选择platinum multiplex pcr master mix作为反应体系，其中包括dna聚合酶、mg
2+
、dntps、pcr稳定剂和增强剂，本次实验选择invitrogen platinum multiplex pcr master mix，pcr体系为50μl，其中
[0096]
2
×
platinum multiplex pcr master mix 25μl；
[0097]
模板2μl；
[0098]
rs13199524、rs12198173和/或rs3093662中至少两对上下游引物(10μmol/l)各1μl；无菌双蒸水补齐至50μl。
[0099]
pcr反应条件：95℃预变性10min；然后95℃变性30s，65℃退火90s，72℃延伸60s，45个循环后，再次72℃延伸10min，恢复至4℃。
[0100]
四、扩增结果检测
[0101]
1、扩增产物检测
[0102]
由于多重pcr的影响因素较多，扩增时需要对反应条件和引物位点、扩增产物等信息进行综合考虑，本实施例中的扩增引物组合是通过多次实验反复验证，相互间影响最小可以实现多重pcr的组合。
[0103]
采用本实施例中的上下游引物组合扩增后验证扩增产物，pcr产物选择2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果中条带1、2为rs12198173的扩增产物序列，条带3、4为rs17817449的扩增产物序列，条带5、6为rs3093662的扩增产物序列，电泳条带位置说明扩增结果无误。
[0104]
将电泳结果胶回收后送测序，测序结果也与目的产物序列一致。
[0105]
2、基因snp位点基因型频率与hiv相关性验证
[0106]
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。