一种以HCH285发酵所得的固体产物中提取分离bostrycin的方法与流程

本发明涉及bostrycin(卷线孢菌素)制备方法领域，特别涉及一种以hch285发酵所得的固体产物中提取分离bostrycin的方法。
背景技术：
：醌类化合物bostrycin是一种天然色素产物，最先在1968年由nodat发现(nodaetal1968&1970)。据文献报道，bostrycin能够抑制肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞的生长(chenetal2011，chenetal2012，陈冬妮2013)，且对卡介苗、结核分枝杆菌均有抑制作用，尤其对多种药物有耐性的结核分枝杆菌有较好活性(黄宇虹2011)。虽然bostrycin在抗菌、抗肿瘤等多方面表现出较大优势，但工业合成困难，产量较少，对其深入研究存在局限。而微生物资源丰富，培养成本低廉。利用微生物发酵生产药物具有生产周期短、产量高等优点。所以，从药用植物分离获得产bostrycin的微生物，经发酵后从产物中提取bostrycin，将可以大大提高其产量，具有极大的研究意义。国内外已有从植物中分离得到产bostrycin内生菌的报道(xuetal2010，xiaetal2011，charudattanetal1982)，但多集中于液体发酵研究，所得产物通常经乙酸乙酯多次萃取后浓缩，再用硅胶柱进行色谱分离，采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集一定浓度乙酸乙酯/石油醚的洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶得红色颗粒状晶体化合物bostrycin。此方法主要适用于从发酵液中提取分离bostrycin。但大量发酵液不易长期存放，且bostrycin易受温度、光照等影响从而发生性质的改变。本发明人所在的课题组之前筛选到了一株产bostrycin的蕲艾内生菌hch285，专利号为“201710183008.x”，所述的菌株已于2017年2月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285，保藏编号为cctccno：m2017061，地址：中国武汉武汉大学。如何开发一种以固体发酵方法所得发酵产物和发酵液经喷雾干燥后所得固体产物为原料，提取分离醌类化合物bostrycin的方法，成为亟待解决的技术问题。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种提取分离醌类化合物bostrycin的方法，该方法能够成功提取分离醌类化合物bostrycin，且bostrycin的得率高。本发明这样实现：本发明提供一种以hch285发酵所得的固体产物中提取分离bostrycin的方法，所述方法包括如下步骤：步骤1、固体产物原料的获得：将hch285固体发酵方法所得的发酵产物粉碎过筛即得固体产物原料；或将hch285液体发酵方法所得的发酵液经喷雾干燥后收集得到的固体粉末粉碎过筛即得固体产物原料；步骤2、提取分离：将步骤1所得的固体产物原料加入70％～95％的甲醇超声提取，以固体产物原料为基础按体积计算，料液比为1：250～1：400(g/ml)；所述发酵液制得的固体产物原料使用70％～95％的甲醇超声提取时将ph调至1.5～2.5。本发明具有以下有益效果：本发明提供的一种提取分离醌类化合物bostrycin的方法，该方法能够成功提取分离醌类化合物bostrycin，且提取bostrycin的得率高，纯度高，工艺简单。附图说明图1为hch285固体发酵产物中bostrycin的高效液相分析图谱；图2为hch285发酵液中bostrycin的高效液相分析图谱；图3为溶剂种类对固体发酵产物中bostrycin得率的影响；图4为溶剂百分数对固体发酵产物中bostrycin得率的影响；图5为料液比对固体发酵产物中bostrycin得率的影响。具体实施方式实施例1s1、固体产物原料的获得：将hch285固体发酵工艺所得发酵产物于50℃干燥24h后粉碎，经过筛得60～80目粉末。s2、提取分离：称取0.50g上述粉末至锥形瓶中，加入80％的甲醇超声提取，以粉末质量为基础按体积计算，料液比为1：300g/ml，提取3次，超声时间50min，超声温度60℃，超声功率600w，超声频率45khz。s3、纯化：提取液合并后浓缩至干，分次加入50ml5％碳酸钠溶液溶解，再过滤除去不溶性杂质，滤液用盐酸调ph至2.0，静置36h，抽滤，得红色晶体颗粒0.0806g。s4、含量测定：精密称取上述红色晶体颗粒10.0mg，至50ml容量瓶，加入色谱甲醇溶解并定容，得浓度为0.20mg/ml的溶液。取适量经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液置于样品瓶中，利用高效液相色谱分析，产品纯度为91.77％，得率14.79％。高效液相色谱图见图1。色谱条件为：symmetryc18色谱柱，250×4.6mm，5μm；vwd-3100可变波长紫外可见光检测器；柱温30℃；进样量10μl；检测波长302nm；流动相为甲醇与缓冲液(35：65v/v)，均用0.45μm的滤膜过滤并脱气处理；缓冲液为取3ml色谱级甲酸，加水稀释至1000ml；流速1ml/min；运行时间30min。实施例2s1、固体产物原料的获得：将hch285接种于psb培养基，置于摇床中发酵培养。培养温度22～26℃，摇床转速100～300r/min培养时间2-5d，过滤除去菌丝，得含bostrycin的发酵液。取2000ml色素溶液，用喷雾干燥机制备得固体粉末61mg(紫红色)。喷雾干燥机的进风温度为130～180℃、进料速度为5～20r/min。s2、提取分离：精密称取上述固体粉末50mg，加入80％的酸性甲醇(ph2.11)超声提取，以粉末质量为基础按体积计算，料液比为1：300g/ml，提取3次，超声时间50min，超声温度60℃，超声功率600w，超声频率45khz。本发明人意外发现发酵液喷雾干燥后的固体粉末可能物理性质发生改变，不溶于80％的甲醇，经过本发明人的大量创新性探索性试验发现ph调至1.5～2.5时，发酵液喷雾干燥后的固体粉末即可溶解；s3、纯化：提取液合并后浓缩至干，分次加入50ml5％碳酸钠溶液溶解，再过滤除去不溶性杂质，滤液用盐酸调ph至1.85，静置36h，抽滤，得红色晶体颗粒5.14mg。s4、含量测定：精密称取上述红色晶体颗粒5.0mg，至25ml容量瓶，加入色谱甲醇溶解并定容，得浓度为0.20mg/ml的溶液。取适量经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液置于样品瓶中，利用高效液相色谱分析，产品纯度为82.09％，得率25.74％(g/l)。高效液相色谱图见图2。色谱条件为：symmetryc18色谱柱，250×4.6mm，5μm；vwd-3100可变波长紫外可见光检测器；柱温30℃；进样量10μl；检测波长302nm；流动相为甲醇与蒸馏水(35：65v/v)，均用0.45μm的滤膜过滤并脱气处理；流速1ml/min；运行时间60min。由于在研究过程中发现，超声提取后旋干直接溶解上样，目的产物的含量也较高，所以不纯化可直接上色谱柱，即不经过所述实施例1-实施例2中的步骤s3，步骤s2后进行步骤s4。以下实施例3-实施例7为不经过纯化步骤，将hch285固体发酵方法所得的发酵产物粉碎过筛即得固体产物原料。实施例31、固体产物原料的获得将hch285固体发酵工艺所得发酵产物于50℃干燥24h，所得干燥产物冷却后经粉碎过筛，取60～80目粉末备用。2、提取分离精密称取上述粉末0.05g至锥形瓶中，加入80％的甲醇进行超声辅助提取，超声功率600w，超声频率45khz。以粉末质量为基础按质量体积比计算，料液比(g/ml)为1：300，提取2～3次，超声时间30～50min，超声温度50～65℃。超声提取后过滤，得提取液备用。3、含量测定上述提取液合并后浓缩至干，再加入一定量的色谱甲醇溶解，过0.45μm微孔滤膜，滤液置于样品瓶中，得供试品溶液。采用高效液相色谱仪进行分析，根据色谱图的峰面积，按下式计算固体发酵产物中bostrycin的得率。上述公式中的h为固体发酵产物的得率(％，g/100g)，c为供试品溶液的浓度(mg/ml)，v为加入色谱甲醇的体积(ml)，m为固体发酵产物的质量(g)。实施例4该实施例中除将实施例3中的步骤2的80％的甲醇改为70％的甲醇外，其他均同实施例3。实施例5该实施例中除将实施例3中的步骤2的80％的甲醇改为90％的甲醇外，其他均同实施例3。实施例6该实施例中除将实施例3中的步骤2的80％的甲醇改为95％的甲醇外，其他均同实施例3。实施例7该实施例中除将实施例3中的步骤2的料液比改为1：250外，其他均同实施例3。实施例8该实施例中除将实施例3中的步骤2的料液比改为1：350外，其他均同实施例3。实施例9该实施例中除将实施例3中的步骤2的料液比改为1：400外，其他均同实施例3。对比例1-对比例6对比例1-6分别采用体积分数为10％、20％、30％、40％、50％、60％的甲醇超声提取，其他均同实施例3。对比例7-对比例10对比例7-10的料液比分别为1：50、1：100、1：150、1：200，其他均同实施例3。实验例11、本实施例说明溶剂种类对hch285固体发酵产物中bostrycin得率的影响。hch285固体发酵产物干燥后经粉碎过筛，精密称取60～80目粉末0.05g各7份，分别加入适量的乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙腈和水，在一定条件下进行超声辅助提取，测定并计算固体发酵产物中bostrycin的得率分别为9.03％、15.65％、6.53％、6.25％、7.27％、6.68％、7.97％，结果见表1。由表1可以看出，hch285固体发酵产物0.05g，料液比(g/ml)为1:300，提取3次，超声时间46min，超声温度59±5℃，当提取溶剂为甲醇时，固体发酵产物中bostrycin的得率最高。表1不同溶剂种类条件下bostrycin的得率2、分别提取并统计实施例3-实施例6以及对比例1-6所得的发酵产物中bostrycin的得率。表2-不同溶剂百分数条件下bostrycin的得率由表2可知，由表2可以看出，hch285固体发酵产物0.05g，料液比(g/ml)为1:300，提取3次，超声时间46min，超声温度59±5℃，当提取溶剂为80％甲醇时，固体发酵产物中bostrycin的得率最高。3、分别统计实施例3、实施例7-9、以及对比例7-10所得的发酵产物中bostrycin的得率，如表2所示。表3-不同料液比条件下bostrycin的得率由表3可知，hch285固体发酵产物0.05g，提取溶剂为80％甲醇，提取3次，超声时间46min，超声温度59±5℃，当料液比(g/ml)为1:300时，固体发酵产物中bostrycin的得率最高。综上所述，本发明将固体产物原料加入70％～95％的甲醇超声提取，以固体产物原料为基础按体积计算，料液比为1：250～1：400。该方法能够成功提取分离醌类化合物bostrycin，且bostrycin的得率高。实验例2本发明人意外发现发酵液喷雾干燥后的固体粉末可能物理性质发生改变，不溶于80％的甲醇，经过试验发现将80％的甲醇ph调至1.5～2.5时，发酵液喷雾干燥后的固体粉末即可溶解。表4-不同ph下发酵液喷雾干燥后的固体粉末的溶解情况组别ph溶解情况11不溶解21.5溶解32溶解42.5溶解53不溶解实验例3为探索纯化步骤中的参数采用5％碳酸钠溶液溶解，使浓缩产物溶解得蓝紫色溶液，再过滤除去不溶性杂质，滤液用hcl调分别ph至1～2.5，静置，抽滤，得红色晶体颗粒。分别检测纯度，结果如表5所示。表5-不同ph下的纯化纯度组别碳酸钠溶液浓度ph纯度15％165.14％25％1.572.23％35％1.683.61％45％1.785.12％55％1.887.33％65％1.990.81％75％2.091.77％85％2.191.23％95％2.284.68％105％2.379.82％115％2.475.56％125％2.570.43％综上可知，超声提取后提取液合并后浓缩至干，分次加入5％碳酸钠溶液，使浓缩产物溶解得蓝紫色溶液，再过滤除去不溶性杂质，滤液用hcl调ph至1.6～2.2，静置，抽滤，得红色晶体颗粒。所得bostrycin纯度高。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3