一株能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌及其应用的制作方法

本发明属于有机污染物微生物修复技术领域，特别涉及一株能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌及其应用。

背景技术：

四环素(tetracycline,tc)因可以与细菌核糖体30s亚基结合，抑制核糖体蛋白质的合成，从而抑制细菌的生长。因此被广泛应用于治疗各种革兰氏阳性和阴性菌引起的感染，对某些立克次体，滤过性病毒和原虫具有作用；被不断用于治疗人体和动植物体疾病，以及低浓度的抗生素还具有促进动物生长作用。然而由于四环素对人体具有潜在的危害作用，已被取消治疗人体疾病；而在动植物中的应用却未有减少。四环素被应用于动物后，有35～90％的含量未被动物体吸收，以初始形态或者代谢产物随粪尿排出体外，最终以农业废水和市政污水形式进入环境和食物链。此外，研究表明在多种介质中检测到四环素，且含量在5～10000ug·kg^-1，如土壤、自来水、地下水、农作物(玉米、高粱等)以及动植物食品中(牛肉、鸡蛋和蜂蜜等)等。由于四环素的抑菌作用，四环素进入环境及食物链后，对土壤肥力、植物生长、环境微生物多样性以及抗性基因都具有潜在的威胁。致使降低环境中四环素残留含量至关重要。目前微生物方法因成本相对较低、降解产物毒性低，而被认为是一种极具应用前景的降低环境中四环素残留含量的方法。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌。

本发明的另一目的在于提供所述能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌，名称为sphingobacteriumchangzhouense(常州鞘氨醇杆菌)tc931，保藏编号为gdmccno：60635，该菌株于2019年4月23日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心。

所述的能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌的16srdna序列由1325个碱基(bp)组成，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

一种培养所述能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌的方法，具体步骤为：将所述能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌接种于培养基中，于30℃～37℃条件下进行培养。

所述的培养基为lb培养基。

所述的培养的温度优选为30℃。

所述的培养的时间为18～36h；优选为20h。

所述的能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌在降解四环素中的应用。

所述的能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌在降解四环素中的应用，是将所述能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌加入到含有四环素的土壤或水体中，对土壤或水体中的四环素进行降解，以去除或者降低四环素在环境中的残留。

所述的含有四环素的水体中四环素的浓度为5～50mg·l^-1；优选为10mg·l^-1。

所述的降解的时间优选为6～9天。

一种四环素生物降解菌剂，含有所述能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌。

本发明中的常州鞘氨醇杆菌tc931在lb平板上生长24小时后，菌落呈淡橘色、圆形、菌落中心向上凸起、光滑、有光泽，在37℃培养36h后，菌落直径约3～4mm；可在四环素浓度为10mg/l的含有10g/l蛋白胨的无机盐液体培养基中生长良好。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明中的常州鞘氨醇杆菌tc931可通过共代谢方式对四环素进行降解，将菌株tc931接种于四环素浓度为10mg/l的含有10g/l蛋白胨的无机盐液体培养基中，30℃，150r/min震荡培养0、2、6、9天，四环素2d后自然水解率为34.29％，加菌后降解率为67.93％，其中微生物降解率33.64％，说明菌株tc952具有降解四环素的性能，可用于降解水体中低浓度的四环素。利用菌株tc931对中低浓度四环素的降解作用可以去除或降低四环素在环境中的残留，可达到治理环境污染的效果，因此，该菌株tc931可应用于液体和土壤中的残留四环素去除。

附图说明

图1是菌株tc931的菌落形态图。

图2是菌株tc931的系统发育树图。

图3是菌株tc931在含10g·l^-1蛋白胨msm培养基中对四环素的降解图(ck代表不加菌对照)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的原料、方法和设备为本技术领域常规原料、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。

实施例1菌株tc931的筛选、分离纯化以及鉴定

一、一株四环素降解菌株tc931筛选方法

1.材料准备

菌株筛选土壤来源：取自湖南省株洲市茶陵县左垅村农家施肥菜地，土样用采样袋密封，4℃带回实验室保存并备用。

lb培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取粉5.0g，nacl10.0g，ph7.0～7.2，蒸馏水定容至1l，固体培养基另加18.0g琼脂粉。121℃灭菌15min。

无机盐培养基(msm)：将5ml磷酸缓冲溶液(kh2po48.5g·l^-1、k2hpo4·h2o21.75g·l^-1、na2hpo4·12h2o33.4g·l^-1、nh4cl5.0g·l^-1)，3.0ml22.5g·l^-1的mgso4溶液(mgso4·7h2o46.125g·l^-1)，1.0ml0.25g·l^-1的fecl3溶液(fecl3·6h2o0.42g·l^-1)，1.0ml36.4g·l^-1的cacl2溶液(cacl2·2h2o48.22g·l^-1)，1.0ml微量元素溶液(mnso4·h2o39.9mg·l^-1；znso4·h2o42.8mg·l^-1；(nh4)6mo7o24·4h2o34.7mg·l^-1)混匀，ph7.0～7.2，后用纯水定容至1l，121℃灭菌15min。

含有10g·l^-1蛋白胨的msm培养基：胰蛋白胨10.0g加入msm培养基(1l)溶液中，ph7.0～7.2，后用纯水定容至1l，121℃灭菌15min。

2.实验仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌锅(bl-50a，上海静科实业有限公司)、便携式ph计(phb-4，上海精密科学有限公司)、离心机(centrifuge5810r)、电热烘箱(dgg-9070a，上海森信实验仪器有限公司)、数显恒温水浴锅(hh系列，常州国宇仪器制造有限公司)、冰箱(rcd-205ag7，海信电器)、生化培养箱(pyx-208s-a，科力仪器)、超净工作台(sw-cj-1f，苏净安泰空气技术有限公司)、涡旋混合器(xw-80a，上海精科实业有限公司)、mycyclerpcr(美国bio-rad公司)、电泳仪(dyy-6c，北京六一仪器厂)、nanodrop核酸蛋白定量检测仪(德国thermo)、凝胶成像系统(美国bio-rad公司)、落地恒温振荡器(hzq-211c)。

3.四环素降解菌株富集筛选及分离纯化

(1)菌株的分离与纯化

称取采集污染土壤1g，加至50ml含0.5mg·l^-1tc(四环素)的含有10g·l^-1蛋白胨的msm培养基中驯化培养(即将tc加入到含有10g·l^-1蛋白胨的msm培养基中，使其终浓度为0.5mg·l^-1)，驯化两天后以2％(v/v)的接种量转接至含1mg·l^-1tc的含有10g·l^-1蛋白胨的msm培养基驯化，然后依次转接(接种量为2％(v/v))至tc浓度为2.5、5和10mg·l^-1tc的含有10g·l^-1蛋白胨的msm培养基中分别驯化3d。驯化筛选后，将菌液用培养基稀释10⁶、10⁷、10⁸和10⁹倍，分别取稀释液0.2ml涂布于lb固体培养基，30℃培养至菌落形成；再将长出来的单菌落挑选出来，分离并纯化。

(2)菌株筛选

将步骤(1)分离纯化得到的纯化菌株接种到lb液体培养基中进行扩大培养20～24h。活化后按2％(v/v)的比例加至含有10mg·l^-1tc的含有10g·l^-1蛋白胨的msm培养基中，150r·min^-130℃避光培养，0、2、6和9天后收集菌液。菌液以8000r·min^-1离心10min，收集上清过0.22μm有机滤膜，滤液用高效液相色谱方法(hplc)进行测定，计算菌株对四环素的降解速率，以上所有实验步骤都尽量避光。将得到的能降解tc的菌株，命名为菌株tc931。其中，液相色谱(hplc)的条件如下：液相色谱柱为cnwc18-wp(4.6×250mm，5μm)，a相为甲醇，b相为乙腈，c相为0.01mol·l^-1草酸，v(a):v(b):v(c)＝15:15:70，流速为1ml·min^-1，柱温31℃；进样量20μl；紫外检测器检测波长355nm。

二、菌落形态特征观察

菌株tc931在lb培养基上生长较快，可在30～37℃生长。菌斑呈淡橘色、圆形、菌落中心向上凸起、光滑、有光泽，在37℃培养36h后，菌落直径约3～4mm。可在四环素浓度为10mg/l的含有10g/l蛋白胨的无机盐液体培养基中生长良好(图1)。

2.16srdna扩增

以提取的菌株tc931的总dna为模板，采用细菌16srdna通用引物扩增，正向引物为27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'，反向引物为1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3'(stackebrandtetal.,1991)扩增16srdna基因序列。

pcr反应总体系为25μl；上、下游引物各2μl；模板dna0.5μl；2×taqpcrmastermix12.5μl；无菌超纯至总体积25μl。

pcr反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃补充延伸5min。pcr结束后用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，选择dl2000marker。凝胶成像系统下观察，其中在marker1000bp与2000bp条带中间范围出现明显的亮带。

3.16srdna序列的测定

pcr扩增后产物送北京睿博兴科生物技术有限公司(广州分公司)测序。得到菌株的16srdna基因序列如下(seqidno.1)：

aacgcgtgagcaacctacctccatcagggggatagcctctcgaaagagagattaacaccgcataatatcaacagttcgcatgttcagttgattaaatatttataggatggagatgggctcgcgtgacattagctagttggtagggtaacggcttaccaaggcgacgatgtctaggggctctgagaggagaatcccccacactggtactgagacacggaccagactcctacgggaggcagcagtaaggaatattggtcaatgggcggaagcctgaaccagccatgccgcgtgcaggatgactgccctatgggttgtaaactgcttttgtccaggaataaacctaaatacgagtatttagctgaatgtactggaagaataaggatcggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggaggatccgagcgttatccggatttattgggtttaaagggtgcgtaggcggcctgttaagtcaggggtgaaatacggtggctcaaccatcgcagtgcctttgatactgatgggcttgaatccatttgaagtgggcggaataagacaagtagcggtgaaatgcatagatatgtcttagaactccgattgcgaaggcagctcactaagctggtattgacgctgatgcacgaaagcgtggggatcgaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgataactcgatgttggcgatagacagccagcgtcttagcgaaagcgttaagttatccacctggggagtacgcccgcaagggtgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggaggagcatgtggtttaattcgatgatacgcgaggaaccttacccgggcttgaaagttagtgaaggtagcagagacgctaccgtccttcgggacacgaaactaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgccgtgaggtgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatgtttagttgccagcatgtagtggtggggactctaaacagactgcctgcgcaagcagcgaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgtccggggctacacacgtgctacaatggatggtacagcgggcagctagctggcaacagcatgctaatctctaaaagccattcacagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagttggattcgctagtaatcgcgtatcagcaatgacgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagccatgaaagttgggggtacctaaagcatgtgaccgcaa。

上述序列由1325碱基(bp)组成。

将获得的16srdna基因序列提交至美国国立生物信息中心(ncbi)网页进行blast对比，与lpsn数据库(http://www.bacterio.net/index.html)中相关模式菌株的16srdna基因进行同源性比对分析，下载同源性较高的模式菌株序列在美国国立生物信息中心(ncbi)网站上对扩增产物序列进行blast比对和同源性分析，采用mega6.0软件，以neighbour-joining法构建系统发育树。经16srdna序列进行比较发现，菌株tc931与模式菌株常州鞘氨醇杆菌(sphingobacteriumchangzhouense)有99.7％的同源性(图2)。

四、菌株tc931鉴定为一种新功能菌株

根据菌株tc952菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，将菌株tc931鉴定为常州鞘氨醇杆菌(sphingobacteriumchangzhouense)，并命名为常州鞘氨醇杆菌tc931(sphingobacteriumchangzhouensetc931)。该菌株已保存于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏号为gdmccno：60635，保藏日期为2019年4月23日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

目前，国内外尚无文献报道常州鞘氨醇杆菌(sphingobacteriumchangzhouense)具有降解四环素的功能。因此，常州鞘氨醇杆菌tc931为一株具有降解四环素功能的新菌株。

实施例2菌株tc931在含有四环素和蛋白胨的无机盐培养基中对四环素的降解

将菌株tc931划线与lb平板上30℃培养20h后，挑取单菌落接种于lb液体培养基中，30℃150r·min^-1的摇床中培养20h后按2％(v/v)的比例接种至tc含量为10mg·l^-1的含10g·l^-1胰蛋白胨的msm培养基中培养，并于2、6、9d(天)后取样；以不添加菌株tc952为对照(ck)。样液以10000r·min^-1离心1min，上清液用0.22μm滤膜过滤，过滤后hplc测定其tc的残留量(四环素测定方法同实施例1)。

结果表明，未加菌的对照tc发生水解，加菌tc931后，tc降解明显加快加强。tc初始浓度为10ppm时，2、6和9d后的水解率分别为34.29％、65.11％、71.32％，可知随着培养时间增加，自然水解率增加。加入tc931后tc降解速率加快，2、6和9d后的tc降解效率(水解+生物降解)为67.93％、81.20％、74.61％。tc自然水解或生物降解2、6、9天后四环素残余浓度见图3。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一株能降解四环素的常州鞘氨醇杆菌及其应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1325

<212>dna

<213>常州鞘氨醇杆菌（sphingobacteriumchangzhouense）

<220>

<223>16srdna

<400>1

aacgcgtgagcaacctacctccatcagggggatagcctctcgaaagagagattaacaccg60

cataatatcaacagttcgcatgttcagttgattaaatatttataggatggagatgggctc120

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cgggccttgtacacaccgcccgtcaagccatgaaagttgggggtacctaaagcatgtgac1320

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<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>正向引物为27f

<400>2

agagtttgatcctggctcag20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>反向引物为1492r

<400>3

ggttaccttgttacgactt19