一株连续传代的飞蝗细胞系QAU-Lm-E-17及其制备方法和应用与流程

本发明属于昆虫细胞生物学和害虫生物防治技术领域，具体涉及一株连续传代的飞蝗细胞系qau-lm-e-17及其制备方法和应用。

背景技术：

飞蝗(locustamigratoria)属直翅目，飞蝗科，是一种多食性、迁飞性大害虫。飞蝗喜食小麦、玉米、高粱、水稻等多种禾本科植物，也可为害棉花、大豆、蔬菜等。大面积发生时成群迁飞，把成片的农作物吃成光秆，危害极大。二十世纪80年代以来，受全球异常气候变化和某些水利工程失修或兴建不当以及农业生态与环境突变的影响，飞蝗在我国黄淮海地区频繁发生，每年发生面积约100～150万公顷，农业生产受到严重威胁。蝗虫微孢子虫(原命名为nosemalocustae，现命名paranosemalocustae，同义antonosporalocustae)是专一寄生于蝗虫的病原微生物，通过胃毒作用主要侵染宿主的脂肪体，可导致蝗虫生长发育缓慢、活动能力及食量下降、产卵量降低，发病严重的蝗虫最终死亡。蝗虫微孢子虫具有对人畜安全、不污染环境等特点，能够长期持续保存在蝗虫种群中，降低害虫密度，在蝗虫的生物防治和可持续治理中发挥了重要作用。深入研究蝗虫微孢子虫与宿主的相互作用以及互作分子进化机制，将为更好地利用蝗虫微孢子虫防治蝗虫提供理论指导。由于活虫体内组织结构和各因素之间的复杂性，使得相关研究变得复杂和困难，而离体昆虫细胞培养将为上述研究提供一个更加简单、快捷和准确的工具和手段。自1959年gaw成功建立家蚕(bombyxmori)传代细胞系和1962年grace建立了桉蚕(antheraeaeucalypti)细胞系以来，目前已从150多种昆虫中建立了800多株细胞系，在昆虫病原的基础研究、生物杀虫剂的生产、重组蛋白表达以及基因功能的研究等领域发挥着越来越重要的作用。

目前建立的昆虫细胞系中主要以鳞翅目和双翅目昆虫为最多，有关直翅目昆虫细胞系成功建立的报道还较少，报道的主要有血黑蝗(melanoplussanguinipes)、埃及蚂蚱(anacridiumaegyptium)、剑角蝗(poekiloceruspictus)、螽斯(gampsocleisgratiosa)等。一些研究者也曾尝试对飞蝗的卵巢和胚胎细胞进行原代培养，但到目前为止，还未有飞蝗连续传代细胞系成功建立的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株连续传代的飞蝗细胞系qau-lm-e-17，明确了飞蝗细胞系qau-lm-e-17的细胞生物学特性以及蝗虫微孢子虫的离体侵染特性，可用于蝗虫微孢子虫的离体增殖及其致病机理研究。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株连续传代的飞蝗细胞系qau-lm-e-17，于2019年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno.c2019123。

本发明提供了所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17的制备方法，包括以下步骤：将消毒后的飞蝗卵冲洗后研磨，磨碎卵粒提取细胞滤液，将所述细胞滤液加入培养基中进行培养，在所述培养期间每隔14d换一半体积的新鲜培养基；所述培养基以tnm-fh培养基为基本培养基，还包括以下体积百分含量的组分：20％的胎牛血清、0.1％的海藻糖和0.01％的庆大霉素。

优选的，所述飞蝗卵为飞蝗产卵7～13d的卵块。

优选的，所述消毒包括依次进行的次氯酸钠消毒和酒精消毒；所述次氯酸钠消毒为利用体积百分含量为10％的次氯酸钠水溶液消毒5min；所述酒精消毒为利用体积百分含量为75％酒精水溶液消毒5min。

优选的，所述研磨为在过滤网上进行，所述过滤网的孔径为100μm。

本发明还提供了所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17或利用所述制备方法制备得到的飞蝗细胞系qau-lm-e-17在离体增殖蝗虫微孢子虫中的应用。

优选的，所述离体增殖蝗虫微孢子虫的方法，包括以下步骤：将感染微孢子虫的飞蝗若虫，进行表面消毒后，解剖所述蝗虫若虫提取脂肪体，将所述脂肪体在第二过滤网上研磨后收集脂肪体滤液，利用所述脂肪体滤液接种所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17后，在28℃的条件下进行培养；

所述第二过滤网浸泡于增殖培养基中，所述增殖培养基以tnm-fh培养基为基本培养基，还包括以下体积百分含量的组分：20％的胎牛血清、0.1％的海藻糖、0.01％的庆大霉素和0.025％的两性霉素b；

所述第二过滤网的孔径为40μm。

优选的，所述飞蝗若虫为感染微孢子虫10d后的3龄飞蝗若虫，解剖前饥饿24h。

优选的，所述表面消毒包括依次进行的次氯酸钠消毒和酒精消毒；所述次氯酸钠消毒为利用体积百分含量为10％的次氯酸钠水溶液消毒10min；所述酒精消毒为利用体积百分含量为75％酒精水溶液消毒10min。

优选的，所述接种时，微孢子虫的孢子和所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17中细胞的数量比为20:1。

本发明提供了一株飞蝗细胞系qau-lm-e-17，经过对所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17线粒体coi基因片段的扩增和序列分析发现，扩增的飞蝗细胞系qau-lm-e-17线粒体coi基因片段长度为657bps，序列已提交到genbank(登录号为mn395672，seqidno.1)，利用在ncbi中进行blast比对，与数据库中飞蝗的线粒体coi基因(登录号为jn858163.1，seqidno.3)最大的相似率为100％，证明该细胞系为飞蝗细胞系；对飞蝗细胞系qau-lm-e-17进行核型分析时，发现所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17的染色体数目在21～26个之间，全部为端着丝粒，其中21个染色体的占比最多，为40％，23和24个染色体的占比分别为10％和7％，与飞蝗染色体雄性为2n＝23和雌性为2n＝24相比，数目上略有变化。本发明所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17为国内外首次建立的可连续传代的飞蝗细胞系，也首次报道了该细胞系可支持专性寄生物蝗虫微孢子虫的离体增殖，为飞蝗生理学和蝗虫微孢子虫的深入研究提供有价值的实验材料。

附图说明

图1为本发明所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17的形态图；

图2为本发明所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17感染蝗虫微孢子虫的形态图；

图3为飞蝗细胞系qau-lm-e-17线粒体coi基因核苷酸比对图。

生物保藏信息

飞蝗(locustamigratoria)细胞系qau-lm-e-17，于2019年6月21日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno.c2019123。

具体实施方式

本发明提供了一株连续传代的飞蝗细胞系qau-lm-e-17，于2019年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno.c2019123。

本发明所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17的形态如图1所示，细胞主要为梭形和圆形两种形态，还有较少部分棒状细胞，其中梭形细胞最多，占比59.7％，大小为33.0±5.2×8.5±1.7μm，其次为圆形细胞，比例为34.8％，大小为13.0±1.9μm，还有5.5％的棒状细胞，大小为21.1±3.9×8.4±1.5μm。

本发明提供了所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17的制备方法，包括以下步骤：将消毒后的飞蝗卵冲洗后研磨，磨碎卵粒提取细胞滤液，将所述细胞滤液加入所述培养基中进行培养，在所述培养期间每隔14d换一半体积的新鲜培养基；所述培养基以tnm-fh培养基为基本培养基，还包括以下体积百分含量的组分：20％的胎牛血清、0.1％的海藻糖和0.01％的庆大霉素。

在本发明的制备方法中，所述飞蝗卵优选为飞蝗产卵7～13d的卵块，轻轻剥去卵块外面的土和卵囊，挑选大而饱满的卵进行消毒。本发明所述消毒优选在超净工作台中进行。本发明所述消毒优选包括依次进行的次氯酸钠消毒和酒精消毒；所述次氯酸钠消毒优选为利用体积百分含量为10％的次氯酸钠水溶液消毒5min；所述酒精消毒优选为利用体积百分含量为75％酒精水溶液消毒5min。本发明所述清洗优选为依次用无菌去离子水和清洗培养基进行清洗，所述清洗培养基优选以tnm-fh培养基为基本培养基，还包括体积百分含量为10％的胎牛血清(fbs)。

本发明将所述冲洗后的飞蝗卵进行研磨，所述研磨优选在过滤网上进行，所述过滤网的孔径为100μm。本发明对所述研磨的方法并没有特殊限定，优选的为将卵粒转移至孔径100μm的小筛子(bdfalcon公司)中，浸于装有所述培养基的培养皿中，用尖头镊子轻轻扎破卵壳，再用研磨棒充分研磨卵粒。

本发明将所述细胞滤液加入所述培养基中进行培养，在所述培养期间每隔14d换一半体积的新鲜培养基。本发明所述培养的温度优选为28℃。本发明在培养期间更换新鲜培养基，优选的吸弃培养装置中的上清液，并更换等量的新鲜培养基。

利用本发明所述制备方法，胚胎细胞和组织于所述培养后4～7d开始贴壁，之后贴壁组织逐渐扩大并呈网状，随着时间的推移，网状组织内有一些纤维状细胞，从网状组织中产生零星的圆形和椭圆形新生细胞，之后一些部位细胞分裂增加，新生细胞渐多，待细胞铺满瓶壁的80％可进行细胞传代。

本发明还提供了所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17或利用所述制备方法制备得到的飞蝗细胞系qau-lm-e-17在离体增殖蝗虫微孢子虫中的应用。

在本发明所述应用中，所述离体增殖蝗虫微孢子虫的方法，优选包括以下步骤：将感染微孢子虫的飞蝗若虫，进行表面消毒后，解剖所述蝗虫若虫提取脂肪体，将所述脂肪体在第二过滤网上研磨后收集脂肪体滤液，利用所述脂肪体滤液接种所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17后，在28℃的条件下进行培养；所述第二过滤网浸泡于增殖培养基中，所述增殖培养基以tnm-fh培养基为基本培养基，还包括以下体积百分含量的组分：20％的胎牛血清、0.1％的海藻糖、0.01％的庆大霉素和0.025％的两性霉素b；所述第二过滤网的孔径为40μm。

本发明所述飞蝗若虫优选为感染微孢子虫10d后的3龄飞蝗若虫，解剖前饥饿24h。本发明对所述感染的方法并没有特殊限定，优选的包括挑选健康的3龄飞蝗若虫饥饿12h后，饲喂涂有孢子数约为10⁶蝗虫微孢子的玉米叶片，感染10d后将若虫饥饿24h进行解剖。

本发明在进行所述解剖前对感染微孢子虫的飞蝗若虫进行表面消毒，所述表面消毒优选包括依次进行的次氯酸钠消毒和酒精消毒；所述次氯酸钠消毒为利用体积百分含量为10％的次氯酸钠水溶液消毒10min；所述酒精消毒为利用体积百分含量为75％酒精水溶液消毒10min。

本发明所述接种时，微孢子虫的孢子和所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17中细胞的数量比优选为20:1。本发明将所述蝗虫微孢子虫接种所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17细胞后，可见细胞逐渐膨大，贴壁细胞开始悬浮，孢子在细胞质内繁殖，在细胞质内中产生大量微孢子虫，感染后期细胞膜破裂，散布于细胞间(图2)。

下面结合实施例对本发明提供的一株连续传代的飞蝗细胞系qau-lm-e-17及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

飞蝗细胞的原代培养和细胞系的建立

1、细胞原代培养

取产卵7～13d的飞蝗卵块，轻轻剥去卵块外面的土和卵囊，挑选大而饱满的卵约10粒，在超净工作台内经10％次氯酸钠和75％酒精分别消毒5min，无菌去离子水清洗3次，再用含10％fbs的tnm-fh培养基冲洗1次；将卵粒转移至孔径100μm的小筛子(bdfalcon公司)中，浸于装有5ml含有20％的胎牛血清和0.01％庆大霉素的tnm-fh培养基的培养皿中，用尖头镊子轻轻扎破卵壳，再用研磨棒充分研磨卵粒。分别吸取2.5ml细胞滤液移入25cm²细胞培养瓶(corning公司)中，再向培养瓶内加入2.5ml上述tnm-fh培养基，置于28℃培养箱中静置培养。每隔14d换液一次，吸出一半体积即2.5ml的上清液，再添加等量新鲜的上述tnm-fh培养基，在倒置相差显微镜ix71(olympus公司)下观察细胞的生长状态。

培养瓶内的胚胎细胞和组织4～7d后开始贴壁，之后贴壁组织逐渐扩大并呈网状，随着时间的推移，网状组织内有一些纤维状细胞，从网状组织中产生零星的圆形和椭圆形新生细胞，之后一些部位细胞分裂增加，新生细胞渐多，待细胞铺满瓶壁的80％可进行细胞传代。

2、飞蝗细胞系的建立

待原代培养的细胞生长良好并铺满培养瓶瓶底80％以上时，轻轻晃动培养瓶若干次使细胞悬浮，以1:1(v/v)的比例传代，待细胞生长稳定并铺满培养瓶瓶底80％以上后再次传代。在倒置相差显微镜下观察细胞的形态并拍照，随机选取100个细胞，通过显微标尺测量细胞的大小。采用microsoftexcel软件对细胞大小(平均值±标准差)进行统计分析。

飞蝗细胞系qau-lm-e-17传代培养时使用含20％fbs的tnm-fh培养基，并在其中添加了0.1％的海藻糖，以有利于细胞的生长和发育，在稳定传代后绝大部分细胞呈贴壁状态，细胞生长缓慢，要经过2～4次换液，间隔约1～2个月后方可继续传代，细胞主要为梭形和圆形两种形态，还有较少部分棒状细胞(如图1所示)。其中梭形细胞最多，占比59.7％，大小为33.0±5.2×8.5±1.7μm，其次为圆形细胞，比例为34.8％，大小为13.0±1.9μm，还有5.5％的棒状细胞，大小为21.1±3.9×8.4±1.5μm。

实施例2

飞蝗细胞系线粒体coi基因片段的扩增和序列分析

利用基因组提取试剂盒提取飞蝗细胞系qau-lm-e-17的基因组dna，利用通用引物hco2198(seqidno.4，5'-taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3')和lco1490(seqidno.5，5'-ggtcaacaaatcataaagatattgg-3')对细胞系的coι基因进行pcr扩增，反应体系为10×pcrbuffer5μl，2.5mmol/ldntps4μl，10μmol/l引物各1μl，taqdna聚合酶(5u/μl)0.5μl，50ng基因组dna模板，加水至50μl。反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后，72℃延伸5min。pcr产物经电泳检测后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

扩增的飞蝗细胞系qau-lm-e-17线粒体coi基因片段长度为657bps，序列已提交到genbank(登录号为mn395672，seqidno.1)，其可编码的氨基酸序列如seqidno.2所示，利用blast在ncbi中进行比对，与数据库中飞蝗的线粒体coi基因(登录号为jn858163.1，seqidno.3)最大的相似率为100％，核苷酸比对结果如图3所示，证明该细胞系为飞蝗细胞系。

实施例3

飞蝗细胞系的核型分析

用秋水仙素处理对数生长期的qau-lm-e-17细胞，秋水仙素的终浓度为0.1μg/ml，继续培养18h，将细胞移入15ml离心管中，1500r/min离心10min，吸去上清液，向细胞沉淀中加入去离子水1ml，轻轻将细胞沉淀弹开，在室温下低渗处理10min，再加入1ml去离子水，低渗10min，加入固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)0.5ml处理5min，离心后弃上清，再加入固定液3ml悬浮细胞，将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，晾干，然后用giemsa染液染色，制片后于axioimagera2(carlzeiss公司)生物显微镜下观察拍照，选择100个染色体分散好的细胞计数。

qau-lm-e-17细胞的染色体数目在21～26个之间，全部为端着丝粒，其中21个染色体的占比最多，为40％，23和24个染色体的占比分别为10％和7％。与飞蝗染色体雄性为2n＝23和雌性为2n＝24相比，数目上略有变化。

实施例4

蝗虫微孢子虫感染飞蝗细胞系

挑选健康的3龄飞蝗若虫饥饿12h后，饲喂涂有孢子数约为10⁶蝗虫微孢子的玉米叶片，感染10d后将若虫饥饿24h，先将蝗虫浸于75％酒精中10-15min使其昏迷，之后在超净台内依次经10％次氯酸钠和75％酒精消毒10min，无菌水冲洗三次，解剖蝗虫取脂肪体，置于孔径40μm的小筛子内，小筛子浸于含20％胎牛血清、0.1％海藻糖、0.01％的庆大霉素和0.025％两性霉素b的tnm-fh培养基中，用研磨棒研磨，每头蝗虫脂肪体的滤液接种到1瓶12.5cm²培养瓶的蝗虫细胞qau-lm-e-17，使其终体积达到2.5ml，倒置显微镜下每天观察记录并拍照。待细胞感染后，取感染微孢子虫的qau-lm-e-17细胞上清液，计数微孢子虫浓度，将上清液接种蝗虫细胞，按孢子和细胞的比例为20:1的比例进行接种。

蝗虫微孢子虫接种qau-lm-e-17细胞后，可见细胞逐渐膨大，贴壁细胞开始悬浮，孢子在细胞质内繁殖，在细胞质内中产生大量微孢子虫，感染后期细胞膜破裂，散布于细胞间(如图2所示)。结果表明，飞蝗细胞系qau-lm-e-17能支持蝗虫微孢子虫的离体增殖，将为蝗虫微孢子虫的深入研究提供便利的实验工具。

实施例5

培养基对飞蝗细胞系qau-lm-e-17的影响

取产卵7～13d的飞蝗卵块，轻轻剥去卵块外面的土和卵囊，挑选大而饱满的卵约10粒，在超净工作台内经10％次氯酸钠和75％酒精分别消毒5min，无菌去离子水清洗3次。将卵粒转移至孔径100μm的小筛子(bdfalcon公司)中，浸于装有5ml不同培养基的培养皿中，用尖头镊子轻轻扎破卵壳，再用研磨棒充分研磨卵粒。分别吸取2.5ml细胞滤液移入25cm²细胞培养瓶(corning公司)中，再向培养瓶内加入2.5ml上述培养基，置于28℃培养箱中静置培养，在倒置相差显微镜ix71(olympus公司)下观察细胞的生长状态。

分别用含20％fbs(biologicalindustries公司)的ipl-41(lifetechnologies公司)、schneider’sdrosophila(lifetechnologies公司)、tnm-fh(hyclone公司)培养基以及无血清培养基sf-900ⅲ(lifetechnologies公司)培养飞蝗细胞，其中在含20％fbs的tnm-fh培养基中大部分细胞贴壁生长，细胞状态良好；ipl-41和schneider’sdrosophila培养基中细胞极少贴壁，多数悬浮，大约20-30d后逐渐变为细胞碎片，细胞数量减少，并出现许多结晶；在sf-900ⅲ培养基中，培养的细胞第2d破碎明显，细胞数量骤减。结果表明，几种培养基中以tnm-fh培养基对飞蝗细胞的培养效果最好。

实施例6

取材时间对飞蝗细胞生长的影响

取产卵不同天数的飞蝗卵块，轻轻剥去卵块外面的土和卵囊，挑选大而饱满的卵约10粒，在超净工作台内经10％次氯酸钠和75％酒精分别消毒5min，无菌去离子水清洗3次。将卵粒转移至孔径100μm的小筛子(bdfalcon公司)中，浸于装有5ml含20％fbs的tnm-fh培养基的培养皿中，用尖头镊子轻轻扎破卵壳，再用研磨棒充分研磨卵粒。分别吸取2.5ml细胞滤液移入25cm²细胞培养瓶(corning公司)中，再向培养瓶内加入2.5ml含20％fbs的tnm-fh培养基，置于28℃培养箱中静置培养，在倒置相差显微镜ix71(olympus公司)下观察细胞的生长状态。

产卵1～6d的细胞数量较少，细胞分散较好，贴壁能力较强；产卵第7～13d的细胞量显著增多，细胞分散性较好，细胞呈贴壁生长状态；产卵13d后的细胞量虽然较大，但贴壁能力较差。综合考虑细胞量、贴壁性和生长状态等指标，以7～13d的卵最适合进行细胞的原代培养。

本发明提供了一株飞蝗细胞系qau-lm-e-17及其制备方法和应用，所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17为国内外首次建立的可连续传代的飞蝗细胞系，所述飞蝗细胞系qau-lm-e-17可支持专性寄生物蝗虫微孢子虫的离体增殖，为飞蝗生理学和蝗虫微孢子虫的深入研究提供有价值的实验材料。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>一株连续传代的飞蝗细胞系qau-lm-e-17及其制备方法和应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>657

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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