一种以玉米黄粉为原料制备免疫活性肽的方法与流程

本发明涉及免疫活性肽的制备技术领域，具体涉及一种以玉米黄粉为原料制备免疫活性肽的方法。

背景技术：

谷物蛋白是一类产量大、价格低廉的植物源蛋白，存在利用方法单一、不能很好发挥价值的问题。

我国是玉米生产大国，玉米产量占世界玉米产量的两成以上，居世界第二。除去直接食用，玉米目前的用途有饲料用途、工业生产淀粉及糖、工业榨油，经济价值不高。玉米黄粉是湿法生产淀粉的副产物，含有约60％的蛋白质。玉米黄粉预处理后经过蛋白酶酶解改性后得到谷物蛋白水解物具有完整蛋白丰富生物活性，经过酶改性的谷物蛋白扩宽其应用领域，提高了其附加价值，得到经济价值更高的产品。

免疫活性肽是指一类在生物体内具有免疫调节功能的肽类分子。在现代生活中，由于饮食不规律、不健康，年轻人及中年人生活压力大、熬夜成瘾，这些不健康的生活习惯是目前亚健康问题严重的主要因素，而亚健康必然导致机体免疫力低下，长此以往必定会使机体出现或大或小的健康问题，这也是目前好多疾病呈现年轻化趋势的主要原因，因此这类现代人急需一种提高免疫力，改善亚健康的产品；而对于免疫力低下人群(老年、儿童、慢性疾病病人)而言，寻求一种能够调解免疫的功能性食品的更加迫在眉睫。

免疫活性肽的种类较多，目前而言，可以通过分离纯化天然活性肽、化学合成法、重组dna法、蛋白质酶解法制备免疫活性肽，食物蛋白是生物活性肽的重要来源，食物蛋白分子隐藏的具有不同生物学活性的氨基酸序列经适宜的蛋白酶酶解后可被释放出来。免疫活性肽可从免疫器官、免疫细胞和免疫分子等多个层面广泛地调节机体的免疫功能，对提高机体免疫力、增强机体免疫功能以及确保机体健康具有重要的意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种以玉米黄粉为原料制备免疫活性肽的方法。利用本发明的制备方法制备得到的免疫活性肽具有提高机体免疫力，增强机体免疫功能的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种以玉米黄粉为原料制备免疫活性肽的方法，包括将玉米黄粉依次去淀粉处理、复合蛋白酶酶解、碱性蛋白酶酶解、灭酶、膜分离和离心去渣制备得到；

所述复合蛋白酶、碱性蛋白酶酶解包括：将所述玉米黄粉经去淀粉处理，得到蛋白质后，再利用复合蛋白酶进行第一酶解，得到第一酶解液后，再用碱性蛋白酶进行第二酶解，得到第二酶解液；

所述第一酶解的条件包括：复合蛋白酶的质量占蛋白质质量的2.5％～3％，酶解温度为50℃～65℃，酶解时间为2h～3h，酶解ph值为7～8.5；

所述第二酶解的条件包括：碱性蛋白酶的质量占第一酶解液总质量的2.5％～3％，酶解温度为50℃～60℃，酶解时间为2.5h～3h，酶解ph值为7～8.5。

优选地，所述玉米黄粉的粒径为≤180μm。

优选地，所述去淀粉处理包括：将所述玉米黄粉与pbs缓冲液混合得到悬液，再与α-淀粉酶混合后进行酶解、灭酶和离心。

优选地，所述悬液中玉米黄粉的质量浓度为8％～12％。

优选地，所述α-淀粉酶的质量占悬液的质量的0.8％～1.2％。

优选地，所述酶解的条件包括：酶解的温度为60℃～70℃，酶解的时间为1.5h～2.5h。

优选地，所述灭酶的条件包括：灭酶的温度为90℃～115℃，灭酶的时间为15min～25min。

优选地，所述离心的条件包括：离心的转速为7500rpm～8500rpm，离心的时间15min～25min。

优选地，所述离心去渣的条件包括：离心去渣的转速为2800rpm～3200rpm，离心去渣的时间为15min～25min。

本发明提供了一种以玉米黄粉为原料制备免疫活性肽的方法。本发明采用复合蛋白酶和碱性蛋白酶对玉米黄粉进行酶解，获得了玉米黄粉酶解液，实现了对玉米黄粉的有效利用。利用本发明提供的制备方法制备得到的免疫活性肽可以促进机体分泌iga、igm和igg，具有一定的调节机体体液免疫功能的能力；能够显著提高小鼠脾淋巴细胞增殖能力，使小鼠血清中ifn-γ、tnf-α、il-2和il-6含量显著提高，可促进机体的细胞免疫。

附图说明

图1是实施例1所制备的玉米免疫活性肽对脾淋巴细胞增殖率的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种以玉米黄粉为原料制备免疫活性肽的方法，包括将玉米黄粉依次去淀粉处理、复合蛋白酶酶解、碱性蛋白酶酶解、灭酶、膜分离和离心去渣制备得到；

所述复合蛋白酶、碱性蛋白酶酶解包括：将所述玉米黄粉经去淀粉处理得到蛋白质后，再利用复合蛋白酶进行第一酶解，得到第一酶解液后，再用碱性蛋白酶进行第二酶解，得到第二酶解液；

所述第一酶解的条件包括：复合蛋白酶的质量占蛋白质质量的2.5％～3％，酶解温度为50℃～65℃，酶解时间为2h～3h，酶解ph值为7～8.5；

所述第二酶解的条件包括：碱性蛋白酶的质量占第一酶解液总质量的2.5％～3％，酶解温度为50℃～60℃，酶解时间为2.5h～3h，酶解ph值为7～8.5。

本发明对所述玉米黄粉的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述玉米黄粉的粒径优选≤180μm。

在本发明中，所述去淀粉处理优选包括：将所述玉米黄粉与pbs缓冲液混合得到悬液，再与α-淀粉酶混合后进行酶解、灭酶和离心。在本发明中，所述悬液的质量浓度优选为8％～12％，更优选为10％。

本发明对所述α-淀粉酶的来源没有特殊限定，优选酶活≥3700活力单位/克的市售α-淀粉酶。在本发明中，所述α-淀粉酶的质量优选占悬液的质量的0.8％～1.2％，更优选为1％。在本发明中，所述α-淀粉酶优选购置于北京奥博星生物技术有限责任公司，生产批号为20170206，货号为01-067。

在本发明中，所述α-淀粉酶进行酶解的条件优选包括：酶解的温度为60℃～70℃，更优选为65℃；酶解的时间优选为1.5h～2.5h，更优选为2h。

在本发明中，所述去淀粉处理的过程中灭酶的条件优选包括：灭酶的温度为90℃～115℃，优选为100℃；灭酶的时间为15min～25min，优选为20min。

在本发明中，所述去淀粉处理的过程中离心的条件优选包括：离心转速为7500rpm～8500rpm，优选为8000rpm；离心时间15min～25min，优选为20min。

在本发明中，所述复合蛋白酶、碱性蛋白酶酶解包括：将所述玉米黄粉经去淀粉处理，得到蛋白质后，再利用复合蛋白酶进行第一酶解，得到第一酶解液后，再用碱性蛋白酶进行第二酶解，得到第二酶解液。

在本发明中，所述复合蛋白酶优选为诺维信protamex酶，产自天津诺维信(中国)生物技术有限公司，地址天津经济技术开发区南海路150号。

在本发明中，所述第一酶解的条件包括：复合蛋白酶的质量占底物总质量的2.5％～3％；酶解温度为50℃～65℃，优选为60℃；酶解时间为2h～3h，优选为2.5h；酶解ph值为7～8.5，优选为8。在本发明中，所述复合蛋白酶在低水解度的情况下也能产出没有苦味的蛋白水解液，所述复合蛋白酶优选的标注活力为1.5au(安森单位)每克。

在本发明中，所述第二酶解的条件包括：碱性蛋白酶的质量占第一酶解液总质量的2.5％～3％；酶解温度为50℃～60℃，优选为55℃；酶解时间为2.5h～3h；酶解ph值为7～8.5，优选为8。在本发明中，所述碱性蛋白酶优选为诺维信alcalase酶，产自天津诺维信(中国)生物技术有限公司，地址天津经济技术开发区南海路150号。在本发明中，所述碱性蛋白酶的酶活优选为0.6au/克。

在本发明中，所述制备免疫活性肽的灭酶的条件优选包括：灭酶的温度为90℃～115℃，优选为100℃；灭酶的时间为15min～25min，优选为20min。

本发明对所述膜分离的方法没有特殊限定，采用常规蛋白去杂的膜分离技术即可。

在本发明中，所述制备免疫活性肽的离心去渣的条件优选包括：离心去渣的转速为2800rpm～3200rpm，优选为3000rpm；离心去渣的时间为15min～25min，优选为20min。

在本发明中，所述经离心去渣得到的免疫活性肽还优选包括冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件包括：零下80℃，100pa保持48h。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)原料粉碎：以玉米黄粉为原料，粉碎过80目筛；

(2)去淀粉：将过筛的玉米黄粉用pbs缓冲液配置成浓度为10％的悬液，加入1％α-淀粉酶，保持65℃2h去除淀粉，100℃，20min灭酶，8000rpm离心20min取沉淀蒸煮后烘干；

(3)酶解：采用复合蛋白酶、碱性蛋白酶酶解，水解条件为先用复合蛋白酶酶解，酶酶底比2.5％，在ph7.0、50℃条件下保持3h，再用碱性蛋白酶酶解，得到酶解液，酶酶底比2.5％，在ph8.5、60℃条件下保持2.5h；

(4)灭酶：将得到的酶解液加热至100℃，保持20min，冷却；

(5)膜分离：将冷却后的酶解液纳滤脱盐，去除钠离子，防止影响活性肽品质；

(6)离心去渣：3000rpm离心20min，去除不溶性蛋白及其他杂质，将上清冷冻干燥，得到免疫活性肽。

实施例2

(1)原料粉碎：以玉米黄粉为原料，粉碎过80目筛；

(2)去淀粉：将过筛的玉米黄粉用pbs缓冲液配置成浓度为10％的悬液，加入酶底比为1％α-淀粉酶，保持65℃，2h去除淀粉，100℃，20min灭酶，8000rpm离心20min取沉淀蒸煮后烘干；

(3)酶解：采用碱性蛋白酶、复合蛋白酶酶解，水解条件为先用碱性蛋白酶酶解，酶酶底比3％，在ph8.5、60℃条件下保持2.5h，再用复合蛋白酶酶解，得到酶解液，酶酶底比3％，在ph7.0、50℃条件下保持3h；

(4)灭酶：将得到的酶解液加热至100℃，保持20min，冷却；

(5)离心去渣：3000rpm离心20min，冷冻干燥，得到免疫活性肽。

实施例3

(1)原料粉碎：以玉米黄粉为原料，粉碎过80目筛；

去淀粉：将过筛的玉米黄粉用pbs缓冲液配置成浓度为10％的悬液，加入酶底比为1％α-淀粉酶，保持65℃，2h去除淀粉，100℃，20min灭酶，8000rpm离心20min取沉淀蒸煮后烘干；

(2)酶解：采用复合蛋白酶、碱性蛋白酶酶解，水解条件为先用复合蛋白酶酶解，酶酶底比2.5％，在ph7.0、50℃条件下保持3h，再用碱性蛋白酶酶解，得到酶解液，酶酶底比2.5％，在ph8.5、60℃条件下保持2.5h；

(3)灭酶：将得到的酶解液加热至100℃，保持20min，冷却；

(4)离心去渣：3000rpm离心20min，冷冻干燥，得到，免疫活性肽；

(5)美拉德：将冻干得到的产品进行美拉德反应处理。

实施例4

1、免疫活性肽对环磷酰胺免疫抑制小鼠的影响实验

icr小鼠90只，随机分5组，每组18只，雌雄各半，分别为：正常对照组、免疫抑制模型组、免疫活性肽高[200mg/(kg·bw)]、中[100mg/(kg·bw)]、低[50mg/(kg·bw)]剂量组。

模型建立：小鼠灌胃21天，其中玉米蛋白水解物高、中、低剂量组灌玉米肽，空白对照组和模型组灌等量的生理盐水，5组均正常摄食摄水。

第20天时模型组和玉米蛋白水解物组腹腔注射环磷酰胺200mg/kg，空白对照组腹腔注射等量生理盐水。

对小鼠血清中补体蛋白c3、c4进行测定，对免疫球蛋白iga、igm、igg含量进行测定。

2、免疫活性肽对正常小鼠的影响实验

icr小鼠140只，随机分5组，每组28只，雌雄各半，分别为：正常对照组、vc阳性对照组、免疫活性肽高[200mg/(kg·bw)]、中[100mg/(kg·bw)]、低[50mg/(kg·bw)]剂量组。

连续灌胃21d，其中cph高中低剂量组分别灌胃对应的cph溶液，正常对照组灌胃生理盐水，vc阳性对照组灌胃100mg/(kg·bw)的vc溶液，5组均正常摄食摄水。

对小鼠血清中免疫球蛋白iga、igm、igg含量进行测定，对细胞因子tnf-α、ifn-γ、il-2和il-6水平进行测定。

本发明实施例1制备得到的免疫活性肽具有以下性质：

1、对环磷酰胺致免疫低下小鼠的作用

表1实施例1不同浓度免疫活性肽对环磷酰胺免疫抑制小鼠补体蛋白的影响

注:不同小写字母表示样本间差异有统计学意义(p＜0.05)。

表2实施例1不同浓度免疫活性肽对环磷酰胺免疫抑制小鼠免疫球蛋白的影响

注:不同小写字母表示样本间差异有统计学意义(p＜0.05)。

2、对正常小鼠的作用

表3实施例1不同浓度免疫活性肽对小鼠免疫球蛋白的影响

注:不同小写字母表示样本间差异有统计学意义(p＜0.05)。

表4实施例1不同浓度免疫活性肽对小鼠血清中细胞因子的影响

注:不同小写字母表示样本间差异有统计学意义(p＜0.05)。

由以上结果可知，在免疫活性肽对环磷酰胺免疫致免疫低下小鼠的作用实验中，环磷酰胺模型组小鼠血清中补体蛋白c3、c4及免疫球蛋白iga、igm和igg与正常对照组差异显著，证明建模成功；与模型组比，免疫活性肽中、高剂量组补体蛋白c3、c4均能提高；与模型组比，免疫活性肽低、中、高剂量组能提高血清中iga、igm含量，高剂量组能提高血清中igg含量。

在免疫活性肽对正常小鼠的作用实验中，与正常对照组相比，免疫活性肽可以促进机体分泌免疫球蛋白iga、igm和igg；与正常对照组小鼠相比，免疫活性肽低剂量组的小鼠血清中ifn-γ含量显著增加；低、中免疫活性肽剂量组的小鼠血清中tnf-α、il-2和il-6含量显著提高，摄入低剂量的免疫活性肽可提高血清中细胞因子表达。

综上所述，免疫活性肽可以缓解环磷酰胺导致的机体免疫力低下，可以在正常范围内提高正常机体免疫能力。

实施例5

小鼠引颈处死，75％乙醇消毒，在超净台上获取脾脏，用镊子将脾在盛有适量无菌hanks液的小平皿中轻轻撕碎，200目筛网过滤后加红细胞裂解液2次，去除红细胞制成单细胞悬液，细胞悬液用pbs液洗涤3次，每次进行5min(1000r/min)离心，然后将细胞重悬于rpmi-1640完全培养液中，台盼蓝染色计数活细胞数(在95％以上)，用培养基将细胞浓度调整为2×10⁶个/ml。每孔加100ul细胞悬液和100ul免疫活性肽于5％co2，37℃饱和湿度培养箱中培养48h。然后加mtt并于4h后用酶标仪检测(od490)。

由以上结果可知，随着免疫活性肽浓度的增加，脾淋巴细胞增殖率上升。见图1，其中，图1中不同小写字母表示样本间差异有统计学意义(p＜0.05)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。