本发明涉及医药领域，特别涉及从海藻多管藻中得到的一种木脂素类化合物及其在制备抗幽门螺杆菌药物和制备抗氧化剂中的应用。
背景技术：
幽门螺杆菌(helicobacterpylori，hp)属于革兰阴性螺旋状微需氧细菌，有鞭毛，其定植因子和毒力因子为致病因子，是最常见的传染性病原菌之一，对人类的健康造成了很大的威胁。人体感染hp可导致消化性溃疡、慢性胃炎等临床常见的消化道疾病，同时，幽门螺杆菌感染与胃癌的发生密切相关，为i类致癌原，系统规范根除幽门螺杆菌可明显降低胃癌的发病率[1]。目前，对于幽门螺杆菌感染性疾病，目前对此类患者主要可给予抗生素治疗，而随着抗生素的广泛使用，使得细菌的耐药性显著上升，单纯西药治疗效果一般[2]。临床上采用的一线治疗方案是三联疗法或者四联疗法，即质子泵抑制剂、铋剂或雷尼替丁枸椽酸铋中的1种，结合2种抗生素进行联合用药治疗[3]。目前的临床治疗方案虽然能在一定程度上提高对幽门螺杆菌的清除率，但是也存在明显的副作用，同时也存在抗幽门螺杆菌的疗效不稳定以及病人依从性差等问题，至今没有发现更好的解决方案。除此之外，在临床病人中幽门螺杆菌对甲硝唑和克拉霉素的耐药率呈上升趋势，克拉霉素耐药率为20％～50％，甲硝唑为40％～70％。另外，临床上也达成共识，那就是长期使用抗生素会不同程度的破坏患者的肠道菌群平衡，改变肠道菌群的种类和丰度，造成有益菌群的减少和有害菌群的增多，造成稳态失调，严重的还可导致腹泻、腹痛、便秘等一系列不良反应。为此，寻找具有抗幽门螺杆菌的新型化合物作为先导药物，对于抑制和杀灭幽门螺杆菌，抵消长期应用抗生素的副作用，有效治疗由幽门螺杆菌导致的的消化道疾病具有重要的意义。
海洋中资源丰富，生态环境独特，很多海藻能产生一些活性显著的次生代谢产物。为了寻找具有抗幽门螺杆菌的先导化合物，发明人所在的科研团队对中药、海藻进行了多年系统的化学及活性研究，发表了一系列的化合物结构鉴定与活性测试的论文[4-10]，最近又从海洋红藻多管藻中得到一个新的木脂素类化合物，活性测试表明其具有抑制和杀灭多株幽门螺杆菌的作用，可以用作制备抗幽门螺杆菌药物，为临床治疗幽门螺杆菌感染提供了新的药物种类；同时本发明化合物也具有清除dpph自由基的活性，可以制备抗氧化剂。
本发明所涉及的木脂素类化合物为新化合物，属于首次被发现，其生物活性迄今为止未见有专利或文献报道。
由于本发明化合物是由多管藻(polysiphoniaurceolata)中分离得到，以下将本发明化合物简称为化合物pu-b。
参考文献：
[1]rgzhang，gcduan，qtfan，etal.roleofhelicobacterpyloriinfectioninpathogenesisofgastriccarcinoma[j].worldjgastrointestpathophysiol.2016,7(1):97-107.
[2]金颖，陈明明，金菊花，等.三种方案根除儿童幽门螺杆菌感染疗效分析[j].浙江中西医结合杂志，2015，25(12):1138-1139.
[3]邢会霞，王潇，刘彦民.益生菌联合三联疗法在治疗幽门螺杆菌感染中的作用[j].中国微生态学杂志，2015，27(12):1483-1485.
[4]liuquan-wen，chencai-hua，wangxiao-feng，etal.triterpenoids,megastigmanesandhydroxycinnamicacidderivativesfromanisomelesindica[j].naturalproductresearch,2019,33,(01):41-46.
[5]quan-wenliu,qing-anqiao,tingzhang,etal.thestructureelucidationofanewbromophenolmetabolitefrompolysiphoniaurceolatabyexperimentalanddfttheoreticalmethods[j].j.mol.struct.2009，929：1-5
[6]liuqw,tanch,zhangt.etal.urceolatol,atetracyclicbromobenzaldehydedimerfrompolysiphoniaurceolata[j].journalofasiannaturalproducts，2006,8(4):379-383
[7]张婷,柳成荫,柳全文,等.多管藻提取物的抗氧化作用[j]，食品科学，2009，30(1)：255-257.
[8]柳全文，范晓，张婷，等.三叉仙菜中4种化学成分的分离鉴定[j].海洋科学，2006，30(10)：4-6.
[9]柳全文徐慧张婷,等.多管藻中具有ptp1b酶抑制活性的新化合物[j].化学通报，2006，69(9)：708-710.
[10]柳全文,谭昌恒,曲世津,等.臭辣树化学成分[j].中国天然药物,2006,(1):25-30.
技术实现要素：
本发明目的在于解决现有抗幽门螺杆菌药物的不足之处，提供一种结构新颖的化合物pu-b。该化合物对幽门螺杆菌具有抑制和杀灭活性，可用于制备抗幽门螺杆菌药物；同时该化合物具有清除dpph自由基的活性，可用于制备抗氧化剂。
本发明提供了一种具有抗幽门螺杆菌作用和抗氧化活性的化合物pu-b，其特征在于所述化合物pu-b的结构式如下式所示：
上述化合物pu-b根据iupac命名法可命名为：
(2s,3r,4s,5s,6r)-2-(4′-((3a”r,6a”r)-4”-(3”′-溴-4”′,5”′-二羟基苯基)六氢呋喃[3”,4”-c]呋喃-1”-基)-2′,6′-二甲氧基苯氧基)-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇。
本发明提供了化合物pu-b的制备方法，其特征之处在于包括以下步骤：
用提取罐提取海洋红藻多管藻polysiphoniaurceolata，先后以6～8倍量的浓度为50％～95％乙醇加热回流提取3次，每次2～5小时，合并三次提取液，利用旋转蒸发仪减压回收乙醇，浓缩得浸膏。将浸膏用水混悬，按1:1～4的比例依次用乙酸乙酯、水饱和正丁醇各萃取3～5次，各萃取液经减压浓缩合并得乙酸乙酯部位浸膏，正丁醇部位浸膏以及水部位浸膏。将正丁醇部位浸膏用水溶解后，经大孔吸附树脂柱进行柱层析，分别用蒸馏水、10％～95％的乙醇溶液进行梯度洗脱，依据薄层色谱检测结果，分别将各流份合并，减压回收乙醇溶液，依次得各部位浸膏为：水部位、10％部位、30％部位、50％乙醇、70％部位。将30％乙醇、50％乙醇两个部位的浸膏用水溶解，分别过mci柱色谱进行柱层析，甲醇-水(体积比0：100％～100％：0)梯度洗脱，每300～600ml收集一个流份。其中，30％乙醇部位收集的60～100个流份，经薄层色谱(tlc)检识，合并其中的相同流份。然后，经制备型高效液相色谱进一步分离纯化得到本发明化合物pu-b。
本发明提供了化合物pu-b具有抗幽门螺杆菌的作用，以及化合物pu-b在制备抗幽门螺杆菌的药物中的应用。
本发明提供了化合物pu-b具有体外清除dpph自由基的作用，以及化合物pu-b在制备抗氧化剂的应用。
本发明具有如下优点：本发明所述的化合物pu-b为一种新化合物，经药理实验证实其对幽门螺杆菌有抑制和杀灭作用以及体外清除dpph自由基的活性，该化合物对由幽门螺杆菌感染引起的疾病治疗具有重要的价值，可以应用在制备抗幽门螺杆菌的药物，也可以制备抗氧化剂。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
化合物pu-b的结构和理化性质。
本发明的一种用于制备抗幽门螺杆菌药物和制备抗氧化剂的化合物，结构式如下：
根据iupac命名法化合物pu-b可命名为：
(2s,3r,4s,5s,6r)-2-(4′-((3a”r,6a”r)-4”-(3”′-溴-4”′,5”′-二羟基苯基)六氢呋喃[3”,4”-c]呋喃-1”-基)-2′,6′-二甲氧基苯氧基)-6-(羟甲基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三醇。
化合物pu-b相应的英文名称为：
(2s,3r,4s,5s,6r)-2-(4′-((3a”r,6a”r)-4”-(3”′-bromo-4”′,5”′-dihydroxyphenyl)hexahydrofuro[3”,4”-c]furan-1”-yl)-2′,6′-dimethoxyphenoxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2h-pyran-3,4,5-triol。
经ca检索，化合物pu-b为新化合物。
化合物pu-b为白色透明块状晶体，溶于甲醇、乙醇，微溶于水，分子式为c26h31bro12。
化合物pu-b分子量为614。
化合物pu-b核磁共振氢谱1h-nmr和核磁共振碳谱13c-nmr数据见表1
表1化合物pu-b的核磁共振氢谱1hnmr(500mhz)和碳谱13c-nmr(125mhz)数据(化学位移值δ单位ppm,耦合常数j单位为hz,测试溶剂：dmso-d6测试温度：30℃)
实施例2
化合物pu-b的制备方法：本发明化合物pu-b来自海洋生物多管藻。具体提取纯化方案为：用提取罐提取海洋红藻多管藻polysiphoniaurceolata3.2kg，先后以8倍量、8倍量、6倍量的70％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，合并三次提取液，减压浓缩得浸膏。将浸膏用水混悬，按1:1.5的比例依次用乙酸乙酯、水饱和正丁醇各萃取4次，各萃取液经减压浓缩合并得乙酸乙酯部位浸膏177g，正丁醇部位浸膏339g，剩余水部位浸膏664g。将正丁醇萃取部位浸膏用水溶解后，经d101型大孔吸附树脂进行柱层析，分别用水、10％、30％、50％、70％、95％的乙醇溶液进行梯度洗脱，分别将各流份合并，减压回收乙醇溶液，得各部位浸膏依次为：水部位(115g)、10％部位(7.5g)、30％部位(96g)、50％乙醇(59.1g)、70％部位4.3g。将30％乙醇、50％乙醇两个部位的浸膏用水溶解，分别过mci柱色谱进行柱层析，甲醇-水(0：100％～100％：0)梯度洗脱，每500ml收集一个流份，30％乙醇部位收集97份流份，50％乙醇部位收集56份流份，流份经tlc检识合并相同流份。其中30％乙醇部位各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用gf254薄层板，以体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份6–18、流份20–29、33–43，得到3个亚组分fr.30-1、fr.30-2、fr.30-3；将亚组分fr.30-2经制备高效液相色谱分离，色谱柱为ymc-packods-a(250×20mm,5μm)，再以体积比为55:45的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7ml/min，收集保留时间为25min的色谱峰，得到本发明化合物pu-b。
实施例3
化合物pu-b抗幽门螺杆菌活性测试。
1、药物配制
化合物pu-b，纯度＞98％(hplc法测定)，系由本实验室首次从海洋红藻多管藻polysiphoniaurceolata中分离纯化得到，药物化合物pu-b临用前用二甲基亚砜(dmso)溶解，配制成20mg·ml-1的母液保存于4℃冰箱中，实验前再稀释成100、75、50、25、12.5、6.25μg·ml-1的含药brain-heartinfusionbhi培养液(以下简称：bhi培养液)。
2、试剂和仪器
tdl-5-a低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；超净工作台，sw-cj-1cu苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；mco-17aco2培养箱，日本sanyo公司；麦氏比浊仪(珠海贝索生物技术有限公司)；ldzx-40bi立体自动电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；胎牛血清(生工生物工程(上海)有限公司)；哥伦比亚培养基(columbiabloodagarbase，批号：2114697)、mueller-hintonagar(批号：1374679)、brain-heartinfusion(bhi)培养液(批号：1913435)，英国oxoid公司；无菌脱纤维羊血(南京茂捷微生物科技有限公司，批号：20190130)；bio-rad550酶标定量测定仪，bio-rad；xds-1b型倒置显微镜，coic；孔径0.22μm微孔滤膜滤器，天津市津腾实验设备有限公司；细胞培养板；1-10ml注射器和针头；烧杯，玻璃棒，离心管，剪刀，镊子等。
3、细菌
幽门螺杆菌标准株(atcc43504)购于山东中医药大学；幽门螺杆菌临床株(icdc111001)购于中国疾病预防控制中心；克拉霉素甲硝唑双重耐药菌株(hp1870)，购于烟台毓璜顶医院。
4、实验方法
(1)细菌的培养：将冻存在超低温冰箱(-80℃)中的幽门螺杆菌菌株取出，在含7％脱纤维新鲜羊血的哥伦比亚培养基平板上复苏。然后，倒置平板置于37℃、5％o2、10％co2、85％n2的培养箱中，培养时间48～72h。待细菌长满培养基平板后，在无菌环境条件下，使用一次性无菌棉签刮取并重悬于的pbs中，然后接种于新的哥伦比亚培养基上，再培养48～72h。每隔36h进行1次传代培养。
(2)液体稀释法测定化合物pu-b最小抑菌浓度(mic)和最小杀菌浓度(mbc)
取7支试管，分别在各试管中加入含10％血清的bhi培养液。然后，将试管进行实验分组：空白对照组(bhi)、对照组(bhi+h.pylori)、阴性对照组(bhi+h.pylori+dmso)、化合物pu-b组(bhi+h.pylori+化合物pu-b)。化合物pu-b组分别加入相同体积不同浓度的化合物pu-b，使其终浓度为100、50、25、12.5、6.25μg·ml-1。分别收集传代至第二代的幽门螺杆菌，重悬于pbs中，调整细菌浓度为3×108cfu·ml-1，除空白对照组外其余每组每试管加入0.5ml菌液(终体积4ml)，用无菌棉封口。将实验用各组试管置于微需氧培养箱中震摇培养72h后，观察结果。随后取上述培养液100μl接种于含血哥伦比亚培养基上培养72h观察结果。以试管不变浑浊的最小药物浓度作为mic值，以涂布平板后无菌生长的最小药物浓度作为mbc值。实验重复3次。
(3)实验结果统计学处理方法
采用spss16.0统计软件，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用独立样本t检验。p＜0.05为差异有统计学意义。
5、化合物pu-b的抗幽门螺杆菌实验测定结果
由表2可知，化合物pu-b对幽门螺杆菌标准株atcc43504的mic为12.5μg·ml-1，对临床株icdc111001和临床株hp1870的mic均为25μg·ml-1。化合物pu-b对幽门螺杆菌标准株atcc43504、临床株icdc111001以及临床株hp1870的mbc依次为25、50和100μg·ml-1。实验结果说明化合物pu-b对幽门螺杆菌标准株和临床株均有良好的抑制和杀灭作用，同时也说明化合物pu-b对hp1870多重耐药菌株也有稳定的抑制和杀灭作用。
表2化合物pu-b对幽门螺杆菌的体外抑菌效果(n＝3)
实施例4
化合物pu-b的抗氧化活性测定如下：
1、实验原理：dpph化学名称是1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种在有机溶剂中很稳定的的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。dpph呈紫色，在517nm处有一个特征吸收峰，当有自由基清除剂存在时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱。当dpph自由基遇到氢供体如抗氧化剂时，自由基单电子与氢结合，517nm处吸收减少，从而反映抗氧化活性的强弱。dpph能测定为数众多的天然抗氧化剂，并且不受葡萄糖等干扰。由于清除剂直接作用于dpph，操作简单快速灵敏，所以经常用来测试物质的体外抗氧化能力。
2、化合物pu-b的配制：准确称取0.0050克化合物pu-b于5ml容量瓶中，加入适量的无水乙醇溶解摇晃均匀并定容，经过计算得到溶液的浓度为1mg·ml-1。
3、试剂的配制：
0.15mmdpph：采用95％的乙醇水溶液配制，准确称取0.0509gdpph倒入棕色试剂瓶内，加入850ml95％乙醇，混合均匀，避光备用，储存时间较长可用锡纸包裹外瓶。
4、测定步骤：
取配制好的1mg·ml-1化合物pu-b溶液于试管中，用乙醇分别稀释成0.025mg·ml-1、0.05mg·ml-1、0.075mg·ml-1、0.1mg·ml-1、0.125mg·ml-1、0.15mg·ml-16组浓度溶液。用移液枪分别精确吸取上述6组溶液各1ml，分别加入到贴有不同标签的洁净试管中，然后精确加入dpph溶液3ml，旋涡混合后放在暗处反应30min，待反应结束后用紫外分光光度计在517nm下测定吸光度，记为a1；取1ml乙醇和3mldpph混合均匀后测定吸光度记为a0；为消除化合物自身颜色的干扰，取1ml本发明化合物溶液加入3ml乙醇混合后测定其吸光值为a2；根据下面的自由基清除率计算公式计算化合物pu-b对dpph自由基的清除率。
5、化合物pu-b对dpph自由基清除能力的结果分析
实验结果见表3，由结果可知，本发明化合物pu-b有较好的清除dpph自由基的能力，而且随着化合物pu-b浓度的升高，清除率明显升高，化合物pu-b清除dpph自由基的能力存在明显的浓度依赖性。实验结果表明化合物pu-b有很好的体外清除自由基的活性，可以应用于制备抗氧化剂。
表3化合物pu-b对dpph自由基清除能力的结果分析
实施例5
化合物pu-b冻干粉针的制备：精密称取化合物pu-b原料20.0g及药用甘露醇40.0g溶于1000ml注射用水中，充分搅拌使溶解，补加注射用水至2000ml，加入针用活性碳2.0g，加热至60℃搅拌30分钟，碳棒过滤，滤液经0.25um微孔滤膜过滤除菌，分装于1000支西林瓶中，装量2.0ml/支，冷冻干燥，即得。每支含化合物pu-b20mg。
实施例6
化合物pu-b注射液的制备：精密称取化合物pu-b原料20.0g,溶于1000ml注射用水中，充分搅拌使溶解，补加注射用水至2000ml，加入针用活性碳2.0g，加热至60℃搅拌30分钟，碳棒过滤，滤液经0.25um微孔滤膜过滤除菌，分装于1000支西林瓶中，装量2.0ml/支，封口，灭菌，即得。每支含化合物pu-b20mg。
实施例7
化合物pu-b颗粒剂的制备：精密称取化合物pu-b原料1g，加入赋形剂药用淀粉29g，混合均匀，制颗粒，整粒压片，制得片剂100片，每片含10mg化合物pu-b。