调节性T细胞表面抗原的表位以及与其特异性结合的抗体的制作方法

本发明涉及富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1)蛋白的表位，其是存在于调节性t细胞表面上的抗原，以及与其特异性结合的抗体或抗原结合片段。
背景技术：
：在所有正常个体中，最重要的特征之一是具有识别和消除非自身抗原的能力，同时又不会对构成自身的抗原性物质产生有害反应。这样，活体对自身抗原没有响应称为免疫学无反应性或耐受性。通过消除可能具有自身抗原特异性受体的淋巴细胞，或通过在接触自身抗原后自身失活反应能力而发生自我耐受。在诱导或维持自身耐受性出现问题的情况下，发生了对自身抗原的免疫反应，并且由此产生的疾病被称为自身免疫疾病。为了治疗自身免疫性疾病，gershon在1970年代初首次介绍并提出了抑制性t细胞的概念，该概念暗示可能存在能够控制和抑制常规t细胞的效应子功能的t细胞(r.k.gershon和k.kondo,immunology,1970,18:723-37)。从那时起，已进行研究以阐明调节性t细胞在免疫学的许多领域中的生物学特性和功能。关于这一点，已经报道调节性t细胞(treg细胞)在自然地预防过度发炎和免疫反应的发生中起重要作用；但是，在发生自身免疫疾病和慢性炎性疾病的情况下，调节性t细胞的功能和数量显著降低。因此，对于患有免疫和炎性疾病的患者，重要的是以正常水平产生调节性t细胞，这可以作为这些疾病的治疗方法之一。迄今为止，已经对调节性t细胞中特异存在的基因和蛋白质进行了研究，并且已经提出诸如cd25、ctla4、cd62l、cd38、cd103、gitr和cd45rb的物质可能对应于标记物质。但是，没有基因和蛋白质只能单独靶向调节性t细胞。另一方面，存在三个称为互补决定区的高变区(以下称为“cdr”)和四个构架区。cdr主要用于结合抗原上的表位。每条链的cdr通常从n端开始依次被称为cdr1、cdr2和cdr3，并且也通过具体cdr所在的链来区分。技术实现要素：技术问题本发明的目的在于提供一种富含富亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1)蛋白的表位，其存在于调节性t细胞(treg细胞)表面。本发明的另一个目的是提供能够特异性结合所述表位的抗体或抗原结合片段。本发明的又一个目的是提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含能够特异性结合所述表位的抗体或抗原结合片段。本发明的又一个目的是提供一种预防或治疗癌症的方法，使用能够特异性结合所述表位的抗体或抗原结合片段。然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员根据以下描述将清楚地理解未提及的其他问题。问题的解决方法本发明涉及富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1)蛋白的表位，或特异性结合该表位的抗体或抗原结合片段。在本发明中，“lrig-1蛋白”是存在于调节性t细胞表面上的跨膜蛋白，由富含亮氨酸的重复序列(lrr)和细胞外或管腔侧的三个免疫球蛋白样结构域，细胞跨膜序列和胞质尾部组成。lrig基因家族包括lrig1、lrig2和lrig3，并且它们之间的氨基酸是高度保守的。lrig1基因在正常皮肤中高表达，并可以在基底和毛囊细胞中表达，以调节上皮干细胞的增殖。因此，lrig1基因在维持表皮的稳态中起着重要的作用，而lrig1基因的缺失可能发展为牛皮癣或皮肤癌。已经报道在lrig1所在的染色体3p14.3部分被切除的情况下，有可能发展为癌细胞。实际上，已经确定在肾细胞癌和皮肤鳞状细胞癌中lrig1的表达大大降低。最近，还发现lrig-1仅在约20％至30％的癌症中表达。另一方面，出于本发明的目的，lrig-1蛋白可以是，但不限于人或小鼠中存在的蛋白。在本发明的一实施例中，lrig-1蛋白可以是源自哺乳动物的lrig-1蛋白，所述哺乳动物包括灵长类，例如人和猴，以及啮齿类动物，例如小鼠和大鼠。在本发明的一实施例中，lrig-1蛋白可以是由seqidno：1表示的人源lrig-1蛋白，其可以但不限于由seqidno：2表示的核酸序列编码(见表1)。表1在本发明的另一实施例中，lrig-1蛋白可以是，但不限于seqidno：3表示的小鼠源lrig-1蛋白(见表2)。表2根据本发明的一实施方式，提供了一种作为lrig-1蛋白的表位的表位，其包括由式1表示的氨基酸序列组成的多肽，[式1]lx1lx2x3n在式1中，x1至x3可各自独立地为中性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸或芳族氨基酸。在此，中性氨基酸可以是甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、丝氨酸(s)或苏氨酸(t)；酸性氨基酸可以是天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)或谷氨酰胺(q)；碱性氨基酸可以是赖氨酸(k)、精氨酸(r)或组氨酸(h)；芳香族氨基酸可以为苯丙氨酸(f)或酪氨酸(y)。在本发明的一实施例中，x1至x3可各自独立地为选自下组的氨基酸：天冬酰胺(n)、天冬氨酸(d)、丝氨酸(s)、酪氨酸(y)、精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、苏氨酸(t)、丙氨酸(a)、谷氨酰胺(q)、谷氨酸(e)和甘氨酸(g)。在本发明的另一实施例中，x1可以是选自下组的氨基酸：天冬酰胺(n)、苯丙氨酸(f)、天冬氨酸(d)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)、缬氨酸(v)、精氨酸(r)和苏氨酸(t)；x2可以是选自下组的氨基酸：丝氨酸(s)、谷氨酰胺(q)、丙氨酸(a)、天冬酰胺(n)、谷氨酸(e)、天冬氨酸(d)、苯丙氨酸(f)和甘氨酸(g)；x3可以是选自下组的氨基酸：酪氨酸(y)、组氨酸(h)、甘氨酸(g)、精氨酸(r)、天冬酰胺(n)、亮氨酸(l)、赖氨酸(k)和苯丙氨酸(f)。在本发明的另一实施例中，x1至x3可以各自独立地是选自下组的氨基酸：天冬酰胺(n)、天冬氨酸(d)、丝氨酸(s)、酪氨酸(y)和精氨酸(r)。在本发明的又一实施例中，x1可以是天冬酰胺(n)或天冬氨酸(d)；x2可以是丝氨酸(s)或天冬酰胺(n)；和x3可以是酪氨酸(y)或精氨酸(r)。在本发明中，表位包括由式1表示的氨基酸序列组成的多肽，并且可以由10至20聚体，优选10至15聚体，并且更优选11至14聚体组成。另外，在本发明中，表位中由式1表示的氨基酸序列组成的多肽可以位于自表位的n末端的3-6位，优选4-6位，更优选5位。作为本发明的一实施例，由式1表示的氨基酸序列组成的多肽可以由但不限于下表3中的seqidno：4至17的任何一个氨基酸序列表示：[表3]作为本发明的另一实施例，表位可以但不限于由seqidno：18或20的氨基酸序列表示。根据本发明的另一实施方式，提供了一种作为lrig-1蛋白的表位的表位，其包含由下表4中的seqidno：18至29的任何一个氨基酸序列表示的多肽：[表4]seqidno序列信息seqidno:18wtrslnlsynklseqidno:19tevrntcfphgppiseqidno:20rltqldlnrnrirseqidno:21dlnrnrirliegltfseqidno:22nsiarihrkgwseqidno:23wlppwligrmlqafseqidno:24rqvtfghegryseqidno:25fghegryqcvitnhfseqidno:26rltvnvlpsftktphseqidno:27rrmhvmpdddvffseqidno:28ffitdvkiddagvysseqidno:29kgdrplslterhh根据本发明的又一实施方式，提供了编码由本发明提供的表位的核酸分子。如本领域技术人员已知的，本发明的核酸分子包括通过将本发明提供的多肽的氨基酸序列翻译成多核苷酸序列而获得的所有核酸分子。因此，可以通过开放阅读框(orf)制备各种多核苷酸序列，并且所有这些多核苷酸序列也都包括在本发明的核酸分子中。根据本发明的又一实施方式，提供了表达载体，其中插入了本发明提供的分离的核酸分子。在本发明中，“载体”是能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种载体是“质粒”，其是指环状双链dna，其中可以连接其他dna区段。另一种载体是噬菌体载体。还有一种载体是病毒载体，其中另外的dna区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体是游离型哺乳动物载体)。在导入宿主细胞后，可以将其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。通常，可用于重组dna技术的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。本发明中表达载体的具体实例可以选自但不限于下组：商业上广泛使用的pcdna载体、f、r1、rp1、col、pbr322、tol、ti载体；粘粒；噬菌体例如λ、λ形的、m13、mu、p1、p22、qμ、t-even、t2、t3、t7；植物病毒。对于本领域技术人员而言，任何已知的表达载体均可在本发明中用作表达载体，并且根据靶宿主细胞的性质选择表达载体。可通过磷酸钙转染、病毒感染、deae-葡萄聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔来将载体引入宿主细胞。然而，本发明不限于此，本领域技术人员可以采用并使用适合于所使用的表达载体和宿主细胞的导入方法。可通过磷酸钙转染、病毒感染、deae-葡萄聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔来将载体引入宿主细胞。然而，本发明不限于此，本领域技术人员可以采用和使用适合于所使用的表达载体和宿主细胞的导入方法。载体可优选包含至少一种选择标记。然而，本发明不限于此，并且取决于是否产生产物，可以使用不包含选择标记的载体来进行选择。根据靶宿主细胞选取选择标记，这是使用本领域技术人员已知的方法完成的，因此本发明对此没有限制。为了促进本发明的核酸分子的纯化，可以将标签序列插入表达载体并与之融合。标签包括但不限于六组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或标志标签，并且本领域技术人员已知的有助于纯化的任何标签都可以用于本发明。根据本发明的又一个实施方式，提供了用本发明提供的表达载体转染的宿主细胞系。在本发明中，“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是用于掺入多肽插入物的载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于自然、偶然或有意的突变，该后代不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或基因组dna补体上)。宿主细胞包括用本文的多核苷酸体内转染的细胞。在本发明中，宿主细胞可以包括哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细胞来源的细胞，并且可以是例如细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，例如酵母细胞和巴斯德毕赤酵母；昆虫细胞，如果蝇和草地贪夜蛾sf9细胞；动物细胞，例如cho(中国仓鼠卵巢)细胞、sp2/0(小鼠骨髓瘤)、人类淋巴母细胞、cos、nso(小鼠骨髓瘤)、293t、bowes黑色素瘤细胞、ht-1080、小仓鼠肾(bhk)细胞、人类胚胎肾(hek)细胞或perc.6(人类视网膜细胞)；或植物细胞。然而，宿主细胞不限于此，并且可以用作宿主细胞系的本领域技术人员已知的任何细胞都是可用的。根据本发明的又一个实施方式，提供了特异性结合本发明的表位的抗体或抗原结合片段。另外，根据本发明的抗体特异性结合表位，该表位包括由式1表示的氨基酸序列组成的多肽，或包括由seqidno：18至29的任一氨基酸序列表示的多肽的表位，在调节性t细胞上存在的lrig-1蛋白中，以致抑制调节性t细胞的功能并且可以维持或增加效应t细胞的活性，从而有效地抑制癌细胞特别是实体癌细胞的生长。如本文所用，术语“癌症”是指或指示以哺乳动物细胞的生长为特征的生理状况，其没有以典型方式被调节。本发明中待预防、改善或治疗的癌症可以是由实体器官中细胞异常生长引起的聚结物形成的实体瘤，并且可以是但不限于胃癌、肝癌、胶质细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、转移癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌等，取决于实体器官的位置。在本发明中，作为全长抗体或作为抗体一部分的抗体具有结合lrig-1蛋白的能力，并且包括与本发明的结合分子以竞争方式结合到lrig-1抗原决定位点的任何抗体片段。如本文所用，“抗体”是指充当特异性识别抗原的受体的蛋白质分子，包括与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子。为了本发明的目的，抗原可以是存在于调节性t细胞表面上的lrig-1蛋白。优选地，抗体可以特异性识别lrig-1蛋白的富含亮氨酸的区域或免疫球蛋白样结构域，但不限于此。在本发明中，“免疫球蛋白”具有重链和轻链，并且重链和轻链中的每一个均包含恒定区和可变区。轻链和重链的每一个的可变区包含三个称为互补决定区的高变区(以下称为“cdr”)和四个框架区。cdr主要用于结合抗原上的表位。每条链的cdr通常从n端开始依次被称为cdr1、cdr2和cdr3，并且也通过具体cdr所在的链来区分。在本发明中，“全长抗体”具有由两条全长轻链和两条全长重链组成的结构，其中每个轻链通过二硫键与重链相连，并且包括iga、igd、ige、igm和igg。igg包括作为其亚型的igg1、igg2、igg3和igg4。另外，如本文所用，“抗原结合片段”是指具有抗原结合功能的片段，并且抗原结合片段的实例包括(i)由轻链可变区(vl)、重链可变区(vh)，轻链恒定区(cl)和重链恒定区1(ch1)组成的fab片段；(ii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iii)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段；(iv)由vh结构域组成的dab片段(ward，e.s.等人,nature341：544-546(1989))；(v)分离的cdr区；(vi)f(ab')2片段，其是包括两个连接的fab片段的二价片段；(vii)单链fv分子(scfv)，其中vh结构域和vl结构域通过肽接头连接，该肽接头允许两个结构域缔合形成抗原结合位点；(viii)双特异性单链fv二聚体；和(ix)双抗体，其是通过基因融合构建的多价或多特异性片段。在使用蛋白水解酶例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶的情况下，抗原结合片段可以作为fab或f(ab')2片段获得，并且可以通过基因重组技术产生。另外，在本发明中，抗体可以是但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、二价双特异性分子、微型抗体、结构域抗体、双特异性抗体、模拟抗体、双抗体、三抗体或四抗体或其片段。另外，如本文所用，“单克隆抗体”是指从基本上相同的抗体群体获得的单一分子组成的抗体分子，并且对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力。在本发明中，“嵌合抗体”是通过将小鼠抗体的可变区和人抗体的恒定区重组而获得的抗体，与小鼠抗体相比，免疫应答大大提高。另外，如本文所用，“人源化抗体”是指通过修饰源自非人类物种的抗体的蛋白质序列而获得的抗体，使得该蛋白质序列类似于人类天然产生的抗体变体。例如，可以如下制备人源化抗体。小鼠来源的cdr可以与人抗体来源的fr重组以制备人源化可变区，并且人源化可变区可以与优选人抗体的恒定区重组以制备人源化抗体。如本文所用，“结合”或“特异性结合”是指本文的抗体或抗体组合物对抗原的亲和力。在抗原抗体结合中，“特异性结合”与非特异性背景结合是有区别的，通常在解离常数(kd)小于1×10-5m，小于1×10-6m，或小于1×10-7m的情况下。可以通过本领域已知的方法检测特异性结合，例如elisa、表面等离振子共振(spr)、免疫沉淀和共沉淀，其包括可以区分非特异性结合和特异结合的适当的对照。本发明的抗体或抗原结合片段可以以多聚体形式存在，例如二聚体，三聚体，四聚体或五聚体，其包含至少一部分单体的抗原结合能力。这样的多聚体还包括同源多聚体或异源多聚体。抗体多聚体包含大量的抗原结合位点，因此与单体相比具有优异的抗原结合能力。抗体多聚体也容易用于产生多功能(即双功能、三功能、四功能等)抗体。如本文所用，“多功能”是指具有两个或多个活性或功能(例如，抗原结合能力，酶活性以及配体或受体结合能力)的抗体或抗原结合片段。例如，本发明的抗体可以结合至具有酶活性的多肽，例如荧光素酶，乙酰基转移酶和半乳糖苷酶等。多功能抗体还包括多价或多特异性(即双特异性，三特异性等)形式的抗体。根据本发明的又一实施方式，提供了一种抗体-药物偶联物(adc)，其包含本发明提供的抗体或抗原结合片段和药物。如本文所用，“抗体-药物偶联物(adc)”是指药物和抗体彼此化学连接而不降低抗体和药物的生物学活性的形式。在本发明中，抗体-药物偶联物是指其中药物与抗体的重链和/或轻链的n-末端的氨基酸残基结合的形式，特别是其中药物与抗体的重链和/或轻链的n末端与一α-氨基结合的形式。如本文所用，“药物”可以指对细胞具有一定生物学活性的任何物质，其是包括dna、rna或肽的概念。药物可以是含有能够与α-氨基反应和交联的反应性基团的形式，也可以包括含有能够与α-氨基反应和交联的反应性基团的形式并且接头与其连接。在本发明中，能够与α-氨基反应和交联的反应性基团的实例在类型方面没有特别限制，只要该反应性基团可以与抗体的重链或轻链的n末端的α-氨基反应并交联即可。反应性基团包括与氨基反应的本领域已知的所有类型的基团。反应性基团可以是例如异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、nhs酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、芳基卤化物、酰亚氨基酯、碳二亚胺、酸酐和氟苯基酯中的任何一种，但为不限于此。在本发明中，抗体-药物偶联物包括作为抗体或抗原结合片段的与lrig-1蛋白中的本发明表位特异性结合的抗体或抗原结合片段，即，包括由式1表示的氨基酸序列组成的多肽的表位或包括由seqidno：18至29中任一氨基酸序列表示的多肽的表位，其中药物可以是能够治疗癌症，lrig-1抗体靶向疾病的药物，即抗癌药。在本发明中，抗癌剂可以包括任何药物而没有限制，只要该药物用于预防、改善或治疗癌症即可。所述抗癌剂可以例如选自下组：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、来那替尼、拉帕替尼、吉非替尼、范德他尼、尼洛替尼、司马沙尼、博舒替尼、阿西替尼、西地尼布、来他替尼、曲妥单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、白槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基尿素、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗、奥古霉素、替伊莫单抗、七铂、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶、阿仑单抗、甲苄肼、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多西氟尿啶、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉西、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、伊诺他滨、氟他胺、卡培他滨、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫氟、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、拓扑替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春花碱、伊达比星、丝裂霉素、博来霉素、更生霉素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、六甲蜜胺、达卡巴嗪、噻替派、尼莫斯汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸、维甲酸、依西美坦、氨鲁米特、阿那格雷、奥拉帕尼、长春瑞滨、法倔唑、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、比卡鲁胺、洛莫司汀、5fu、伏立诺他、恩替诺特和卡莫司汀。然而，抗癌剂不限于此。在本发明中，癌症可以是由实体器官中细胞的异常生长引起的聚结物形成的实体瘤，并且其具体实例可以包括但不限于胃癌、肝癌、胶质细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、转移癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、肺癌等，取决于实体器官的位置。根据本发明的又一实施方式，提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含作为活性成分的本发明提供的抗体或抗原结合片段或本发明提供的抗体-药物偶联物(adc)。在本发明中，包含在药物组合物中作为活性成分的抗体或抗原结合片段或通过与药物结合而获得的抗体-药物偶联物，特异性结合调节性t细胞上存在的lrig-1蛋白中的表位，包括由式1表示的氨基酸序列组成的多肽的表位，或包含由seqidno：18至29中任一氨基酸序列表示的多肽的表位，从而可以抑制调节t细胞的功能，效应t细胞的活性可以维持或增加，从而有效地抑制癌细胞，特别是实体癌细胞的生长。在本发明中，癌症可以是由实体器官中细胞的异常生长引起的聚结物形成的实体瘤，并且其具体实例可以包括但不限于胃癌、肝癌、胶质细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、转移癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、肺癌等，取决于实体器官的位置。同时，在本发明中，“预防”可包括但不限于使用本发明的药物组合物阻断疾病症状或抑制或延迟症状的任何行为。此外，在本发明中，“治疗”可以包括但不限于使用本发明的药物组合物来改善或有益地改变疾病症状的任何行为。在本发明中，药物组合物的特征可以在于是胶囊、片剂、颗粒剂、注射剂、软膏剂、散剂或饮料的形式，并且药物组合物的特征是可以针对人。在本发明中，药物组合物可以按照常规方法分别制成口服制剂的形式，例如散剂，颗粒剂，胶囊剂，片剂和水性混悬剂，外用制剂，栓剂和无菌注射液并被使用。但是，药物组合物不限于此。本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。作为药学上可接受的载体，可以将粘合剂、助流剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、颜料、调味剂等用于口服给药；可以将缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等混合用于注射剂；可以将碱、赋形剂、润滑剂、防腐剂等用于局部给药。本发明的药物组合物的制剂可以通过以各种方式与如上所述的药学上可接受的载体混合制备。例如，对于口服给药，可以将药物组合物制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、植入剂(wafer)等形式。对于注射，药物组合物可以配制成单位剂量安瓿或多种剂量的形式。或者，可以将药物组合物配制成溶液、悬浮液、片剂、胶囊、缓释制剂等。同时，作为适合于制备制剂的载体、稀释剂或赋形剂的实例，可以使用乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。另外，可以进一步包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂、防腐剂等。在本发明中，药物组合物的给药途径包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠、局部、舌下或直肠途径。口服或肠胃外给药是优选的。在本发明中，“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、囊内、胸骨内、硬膜内、病灶内和颅内注射或输注技术。本发明的药物组合物也可以栓剂的形式用于直肠给药。本发明的药物组合物可根据多种因素而广泛变化，包括所用某种化合物的活性、患者的年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合以及要预防或治疗的某些疾病的严重性。药物组合物的剂量可以根据患者的状况、体重、疾病的严重程度、药物形式、给药途径和持续时间而变化，并且可以由本领域技术人员适当地选择。药物组合物可以每天0.0001至50mg/kg或0.001至50mg/kg的量施用。给药可以一天一次或一天几次。该剂量无意以任何方式限制本发明的范围。本发明的药物组合物可以配制成丸剂、糖衣片剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂或混悬剂的形式。根据本发明的又一实施方式，提供了一种预防或治疗癌症的方法，包括对个体施用根据本发明的抗体或抗原结合片段、或根据本发明的抗体药物偶联物(adc)的步骤。。本发明的抗体或抗原结合片段以及本发明的抗体-药物偶联物特异性结合调节性t细胞上存在的lrig-1蛋白中的表位，该表位包括由式1表示的氨基酸序列组成的多肽，或者该表位包括由seqidno：18至29的任一氨基酸序列表示的多肽，从而可以抑制调节性t细胞的功能并且可以维持或增加效应t细胞的活性，从而有效地抑制癌细胞特别是实体癌细胞的生长。在本发明中，“个体”是被怀疑患有癌症的个体，并且被怀疑患有癌症的个体是指已经发展或可能发展所述疾病的哺乳动物，例如人，小鼠和家畜。但是，用本发明的抗体或抗体-药物偶联物治疗的任何个体没有限制地包含在本文内。本发明的方法可以包括以药学有效量施用抗体或抗体-药物偶联物。主治医师或兽医可以在合理的医学判断范围内确定适当的每日总用量，并可以一次或多次给药。然而，出于本发明的目的，针对特定患者的特定治疗有效量优选根据各种因素进行不同的应用，包括要实现的反应的类型和程度，是否与其他试剂一起使用的特定组合物，视情况可以是患者的年龄，体重，总体健康状况，性别和饮食，给药时间，给药途径，组合物的分泌率，治疗时间以及与特定组合物同时使用或与联合使用的药物，以及在医学领域众所周知的类似因素同时，用于预防或治疗癌症的方法可以是但不限于联合疗法，其进一步包括给予对一种或多种癌症疾病具有治疗活性的化合物或物质在本发明中，“联合”应理解为代表同时、单独或顺序给药。在以顺序或单独的方式进行给药的情况下，第二组分应以一定的间隔给药，以使联合的有益作用不会丧失。在本发明中，抗体或抗体-药物偶联物的剂量可以是但不限于每千克患者体重约0.0001微克至500毫克。在本发明中，癌症可以是由实体器官中细胞的异常生长引起的聚结物形成的实体瘤，并且其具体实例可以包括但不限于胃癌、肝癌、胶质细胞瘤、卵巢癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、肾细胞癌、乳腺癌、转移癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、肺癌等，取决于实体器官的位置。发明的有益效果根据本发明，特异性结合lrig-1蛋白的表位的抗体或抗原结合片段，特异性结合存在于调节性t细胞上的本发明的表位，从而可以抑制调节性t细胞的功能，维持或增加效应t细胞的活性，从而有效地抑制癌细胞特别是实体癌细胞的生长。附图简述图1示出根据本发明的一实施方式的lrig-1蛋白的结构。图2示出根据本发明的一实施方式的lrig-1蛋白的结构。图3示出根据本发明的一实施方式的lrig-1mrna的表达水平。图4示出根据本发明的一实施方式的lrig-1mrna的表达水平。图5示出根据本发明的一实施方式的lrig-1mrna的表达水平。图6示出根据本发明的一实施方式的lrig-1、lrig-2和lrig-3mrna的表达水平。图7示出根据本发明一实施方式通过比较调节性t细胞和非调节性t细胞中lrig-1蛋白的表达水平获得的结果。图8示出根据本发明的一实施方式lrig-1蛋白在调节性t细胞的表面上的表达。图9示出在本发明的一实施方式中通过分析抗体(a7、c8、e7、g3、a8、b8、d9和h6)与lrig-1蛋白的结合能力获得的结果。图10示出在本发明的一实施方式中，通过分析在调节性t细胞中调节lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a7、c8、e7、g3、a8、b8、d9和h6)的lrig-1蛋白诱导的stat3磷酸化的机制而获得的结果。图11示出在本发明的一实施方式中，使用lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)进行癌症治疗的实验设计。图12示出在本发明的一实施方式中，通过使用lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)获得的癌症治疗效果。图13示出在本发明的一实施方式中，使用微阵列的10μg/ml的单克隆抗体(h6)对lrig-1蛋白进行表位作图而获得的结果。图14示出在本发明的一实施方式中使用微阵列的100μg/ml的单克隆抗体(h6)对lrig-1蛋白进行表位作图而获得的结果。图15示出在本发明的一实施方式中，使用微阵列的单克隆抗体(h6)对lrig-1蛋白进行表位作图而获得的结果。具体实施方式本发明涉及富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1)蛋白的表位，或特异性结合该表位的抗体或抗原结合片段。根据本发明的一实施方式，提供了一种作为lrig-1蛋白的表位的表位，其包括由式1表示的氨基酸序列组成的多肽。[式1]lx1lx2x3n在式1中，x1至x3可各自独立地为中性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸或芳香族氨基酸。本文中，中性氨基酸可以是甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、异亮氨酸(i)、丝氨酸(s)或苏氨酸(t)；酸性氨基酸可以是天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、天冬酰胺(n)或谷氨酰胺(q)；碱性氨基酸可以是赖氨酸(k)、精氨酸(r)或组氨酸(h)；和芳香族氨基酸可以为苯丙氨酸(f)或酪氨酸(y)。在本发明的一实施例中、x1至x3可各自独立地是选自下组的氨基酸：天冬酰胺(n)、天冬氨酸(d)、丝氨酸(s)、酪氨酸(y)、精氨酸(r)、苯丙氨酸(f)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)、亮氨酸(l)、缬氨酸(v)、苏氨酸(t)、丙氨酸(a)、谷氨酰胺(q)、谷氨酸(e)和甘氨酸(g)。在本发明的另一实施例中、x1可以是选自下组的氨基酸：天冬酰胺(n)、苯丙氨酸(f)、天冬氨酸(d)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)、缬氨酸(v)、精氨酸(r)和苏氨酸(t)；x2可以是选自下组的氨基酸：丝氨酸(s)、谷氨酰胺(q)、丙氨酸(a)、天冬酰胺(n)、谷氨酸(e)、天冬氨酸(d)、苯丙氨酸(f)和甘氨酸(g)；x3可以是选自下组的氨基酸：酪氨酸(y)、组氨酸(h)、甘氨酸(g)、精氨酸(r)、天冬酰胺(n)、亮氨酸(l)、赖氨酸(k)和苯丙氨酸(f)。在本发明的另一实施例中、x1至x3可以各自独立地是选自下组的氨基酸：天冬酰胺(n)、天冬氨酸(d)、丝氨酸(s)、酪氨酸(y)和精氨酸(r)。在本发明的又一实施例中，x1可以是天冬酰胺(n)或天冬氨酸(d)；x2可以是丝氨酸(s)或天冬酰胺(n)；x3可以是酪氨酸(y)或精氨酸(r)。在本发明的又一实施例中，由式1表示的氨基酸序列组成的多肽可以但不限于由seqidno：4至17的任一氨基酸序列表示。根据本发明的另一实施方式，提供了一种作为lrig-1蛋白的表位的表位，其包括由表4中的seqidno：18至29的任一氨基酸序列表示的多肽。根据本发明的另一实施方式，提供了特异性结合本发明表位的抗体或抗原结合片段。根据本发明的又一实施方式，提供了一种预防或治疗癌症的药物组合物，其包含作为活性成分的本发明提供的抗体或抗原结合片段。在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于更详细地描述本发明，并且对于本领域技术人员而言将显而易见的是，根据本发明的主旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。实施例[制备实施例1]t细胞亚型细胞培养为了鉴定lrig-1蛋白是否仅在调节性t(treg)细胞中表达，制备了t细胞亚群th0、th1、th2、th17和itreg。与天然分离的ntreg不同，itreg是指在具有以下组成的培养基中人工诱导分化的细胞。通过首先分离从小鼠脾脏获得的原初t细胞，使得含有10％胎牛血清(fbs；hyclone，犹他州洛根)的rpmi1640(英杰gibco，格兰德岛，纽约)营养培养基进一步包含下表5中的各个成分，并在37℃，5％co2的培养箱中进行72小时培养，从而诱导t细胞亚群分化为相应的细胞。表5分化细胞组成th0抗-cd3、抗-cd28th1il-12、抗-il-4抗体th2il-4、抗-ifnβth17il-6、tgfβ、抗-ifnβ、抗-il-4itregil-2、tgfβ[实施例1]lrig-1的结构分析预测lrig-1蛋白的细胞外结构域的三维空间结构以产生对lrig-1蛋白特异性的抗体，lrig-1蛋白是调节性t细胞的表面蛋白。首先，为了预测表位的碱基序列，使用了uniprot(http://www.uniprot.org)和rcsb蛋白数据库(http://www.rcsb.org/pdb)的工具来预测lrig-1蛋白的细胞外结构域(ecd)的三维空间结构，以便鉴别ecd的结构。然后，结果在图1和2中示出。如图1所示，在lrig-1蛋白的细胞外结构域的lrig-lrr结构域(第41-494位的氨基酸序列)中总共存在15个富含亮氨酸的区域，lrr1至lrr15。每个lrr结构域由23-27个氨基酸组成，其中存在3至5个亮氨酸。另外，如图2所示，在lrig-1蛋白的细胞外结构域中的lrig-1蛋白的494-781位的氨基酸序列中存在三个免疫球蛋白样结构域。[实施例2]在调节性t细胞中lrig-1mrna的特异性表达的鉴定验证了lrig-1蛋白是否可以作为调节性t细胞的特异性生物标志物。为了进行验证，使用磁激活细胞分选(macs)通过cd4珠子从小鼠脾脏中分离出cd4+t细胞。随后，使用cd25抗体用荧光激活细胞分选仪(facs)分离调节性t(cd4+cd25+t)细胞和非调节性t(cd4+cd25-t)细胞。对于各个细胞和在制备实施例1中分化的细胞，使用trizol提取mrna，然后根据制造商提供的方案使用gdna提取试剂盒(凯杰)从基因组rna中去除gdna。通过bdsprintcdna合成试剂盒(克隆技术)将去除gdna的mrna合成为cdna。进行实时聚合酶链反应(rtpcr)以定量鉴定cdna中lrig-1mrna的表达水平。使用sybrgreen(分子探针)，按照制造商提供的规程，使用下表6中所示的引物进行实时聚合酶链反应，条件为：40个循环，包括95℃3分钟，61℃15秒，72℃30秒，使用δct方法计算相对基因表达水平，并使用hprt进行归一化。结果在图3-6中示出。表6如图3所示，可以看出lrig-1在调节性t(cd4+cd25+t)细胞中的表达比非调节性t(cd4+cd25-t)细胞高18.1倍。这是比以前已知的调节性t细胞的标记lag3和ikzf4高约10倍的表达水平。另外，如图4和5所示，与其他类型的免疫细胞相比，lrig-1mrna在调节性t细胞中显著高表达，特别是在自然分离的调节性t细胞(ntreg)中与诱导型调节性t(itreg)细胞相比显著高。另外，如图6所示，在对应lrig家族的lrig-1、lrig-2和lrig-3中，lrig-1的表达最高。从以上结果可以看出，根据本发明的lrig-1蛋白在调节性t细胞，特别是天然存在的调节性t细胞中特异性表达。[实施例3]lrig-1蛋白在调节性t细胞中的特异性表达的鉴定鉴定了从lrig-1mrna表达的lrig-1蛋白是否仅在调节性t细胞中特异性表达。使用foxp3-rfp敲入小鼠，通过将红色荧光蛋白(rfp)与foxp3启动子偶联获得的foxp3-rfp，foxp3启动子是调节性t细胞特有的转录因子，使用磁激活细胞分选法(macs)通过cd4珠子从小鼠的脾脏分离cd4+t细胞。随后，使用rfp蛋白，通过荧光激活细胞分选仪(facs)进行分离，从而获得调节性t(cd4+rfp+t)细胞和非调节性t(cd4+rfp-t)细胞。将各个细胞用购买的lrig-1抗体染色，并将阴性对照用同种型匹配的对照抗体染色，以用荧光激活的细胞分选仪检测lrig-1的表达水平。结果在图7中示出。如图7所示，用虚线指示的非调节性t细胞显示出与阴性对照几乎相同的lrig-1表达水平，而在调节性t细胞中存在大量高表达lrig-1的细胞。从以上结果可以看出，根据本发明的lrig-1蛋白在调节性t细胞中特异性表达。[实施例4]lrig-1蛋白在调节性t细胞表面上的特异性表达的鉴定从成为细胞治疗靶标的角度来看，lrig-1蛋白必须表达在调节性t细胞的表面，从而可以更有效地进行靶标治疗，鉴定了lrig-1蛋白是否在调节性t细胞的表面表达。使用抗cd4-apc和抗lrig-1-pe抗体对制备实施例1的各个分化的t细胞亚群进行染色，并使用荧光激活的细胞分选仪(facs)测量各个细胞表面lrig-1的表达水平。结果在图8中示出。如图8所示，lrig-1在活化t细胞、th1细胞、th2细胞、th17细胞和原初t细胞中的表达量为0.77至15.3，而在分化诱导t细胞(itreg细胞)中lrig-1的表达量高达83.9。从以上结果可以看出，根据本发明的lrig-1蛋白不仅在调节性t(treg)细胞中特异性表达，而且特别是在treg细胞表面上以较高水平表达。[生产实施例1至8]lrig-1蛋白的特异性单克隆抗体的生产生产根据本发明的lrig-1蛋白的特异性抗体。本发明的抗体不是通过指定某个表位产生，而是作为能够结合lrig-1蛋白上任何位点的抗体产生。为了生产抗体，制备表达lrig-1蛋白的细胞。更具体地，将对应于seqidno：2的dna片段和pcdna(hygro)用切割酶切割，在37℃下孵育，并连接以产生其中插入了lrig-1蛋白的dna序列的pcdna。通过转染将由此产生的插入有seqidno：2的pcdna导入l细胞，从而使lrig-1蛋白在l细胞的表面上表达。从人scfv文库中选择能够结合在细胞表面表达的lrig-1的轻链和重链氨基酸序列，从而选择了总共八个重链和轻链。将所选的重链和轻链氨基酸序列与mlgg2afc区融合，以产生单克隆抗体。单克隆抗体的序列显示在下表7中。[表7][实施例5]评价本发明的抗体对lrig-1蛋白的结合能力为了鉴定在生产实施例1至8中生产的根据本发明的单克隆抗体是否很好地识别lrig-1，将生产实施例1至8中的每种抗体与稳定表达lrig-1的l细胞结合。然后，向其中添加与eflour670偶联并能够识别小鼠抗体的二抗，接着使用facs分析单克隆抗体与lrig-1蛋白的结合能力。结果在图9中示出。如图9所示，发现根据本发明的所有lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a7、a8、b8、c8、d9、e7、g3和h6)有效识别并结合存在于l细胞的表面上的lrig-1蛋白。[实施例6]通过本发明的抗体对调节性t细胞中的信号转导途径的调节为了分析生产实施例1至8中生产的根据本发明的单克隆抗体如何通过lrig-1蛋白影响调节性t细胞中的信号转导途径，通过用生产实施例1至8的抗体处理调节性t细胞来刺激存在于调节性t细胞表面上的lrig-1，然后通过磷酸酪氨酸免疫印迹分析经刺激的调节性t细胞中存在的stat3蛋白的酪氨酸磷酸化水平。结果在图10中示出。如图10所示，发现根据本发明的lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a7、c8、e7和g3)将stat3的磷酸化增加到与th17细胞相同的水平。另一方面，发现根据本发明的lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)继续以与itreg细胞相同的水平维持和减少stat3的磷酸化。[实施例7]a8、b8、d9和h6抗体的癌症治疗作用为了鉴定在生产实施例5至8中生产的根据本发明的单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)对实体癌的治疗作用，如图11所示，将b16f10黑素瘤细胞以3×105细胞的量皮下注射到小鼠的背部，然后在第4、8和12天以200ug的量将生产实施例5至8的抗体腹膜内注射给小鼠。在移植黑素瘤细胞后，测量肿瘤体积随时间的变化，结果示于图12中。如图12所示，发现与未接受抗体治疗的阴性对照相比，在用本发明的lrig-1蛋白特异性单克隆抗体(a8、b8、d9和h6)治疗的情况下观察到黑色素瘤肿瘤大小显著减少。从这些结果可以看出，根据本发明的lrig-1蛋白的特异性单克隆抗体抑制各种实体癌细胞的生长，从而有效地预防、改善或治疗此类癌症。[实施例8]根据本发明的lrig-1蛋白中表位的测定为了发现与生产实施例8的h6抗体结合的表位，其中所述表位存在于调节性t细胞表面上存在的lrig-1蛋白的各lrr结构域和ig样结构域中，执行以下实验。1.实验准备(1)微阵列lrig-1蛋白在其c和n末端用gsgsgsg接头延长，以避免肽被截断。延长的抗原序列被翻译成15个氨基酸，具有14个氨基酸的肽-肽重叠。所得的lrig-1肽微阵列包含1091个不同的肽，一式两份印刷，并用其他ha(ypydvpdyag，102个斑点)对照肽框住。(2)实验材料样品：生产实施例8的h6单克隆抗体洗涤缓冲液：pbs，ph7.4，含0.05％吐温20(3倍，每次孵育后10秒)封闭缓冲液：罗克兰封闭缓冲液mb-070(第一次测定前30分钟)孵育缓冲液：含10％封闭缓冲液的洗涤缓冲液测定条件：将孵育缓冲液中的抗体浓度调整为1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml，并在4℃下孵育16小时，并在140rpm下进行搅拌二抗：山羊抗人igg(h+l)dylight680(0.2μg/ml)；在室温下于孵育缓冲液中染色45分钟对照抗体：小鼠单克隆抗ha(12ca5)dylight800(0.5μg/ml)；在室温下于孵育缓冲液中染色45分钟扫描仪：li-corodyssey成像系统；扫描偏移量0.65毫米，分辨率21微米，扫描强度为7/7(红色＝700nm/绿色＝800nm)2.实验方法使用二抗和对照抗体在孵育缓冲液中对lrig-1肽微阵列拷贝进行了预染色，以确定它们是否可以与可能在主要测定中引起干扰的抗原衍生肽相互作用。随后将其他lrig-1肽微阵列拷贝与生产实施例8的h6单克隆抗体(1μg/ml，10μg/ml和100μg/ml)在孵育缓冲液中孵育，然后用二抗和对照抗体染色。使用li-corodyssey成像系统以7/7(红色/绿色)的扫描强度进行读取。点强度的定量和肽注释基于16位灰度的tiff文件。微阵列图像分析是用分析仪完成的。结果在图13至图15中示出，分析的表位序列示于下表8。[表8]3.实验结果如图13-15所示，发现特异性结合于调节性t细胞上存在的lrig-1蛋白并因此有效治疗癌症的单克隆抗体(h6)特异性结合在lrig-1蛋白中由seqidno：18-29的任一氨基酸序列表示的表位，并因此发挥功能。此外，发现由seqidno：18和20表示的表位具有共同的富含亮氨酸的重复，并且特别地，这些表位包含共有序列，其可以由本发明的式1的氨基酸序列表示，位于自n端的第五个氨基酸位置。尽管上面已经详细描述了本发明，但是本发明的范围不限于此。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离权利要求中描述的本发明的技术精神的情况下，可以进行各种修改和改变。工业可用性本发明涉及富含亮氨酸和免疫球蛋白样结构域1(lrig-1)蛋白的表位以及与其特异性结合的抗体或抗原结合片段，所述蛋白是存在于调节性t细胞表面上的抗原。<110>古德t细胞有限公司<120>调节性t细胞表面抗原的表位以及与其特异性结合的抗体<130>pdpb187156k01<150>kr10-2018-0053052<151>2018-05-09<160>45<170>kopatentin3.0<210>1<211>1093<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>1metalaargprovalargglyglyleuglyalaproargargserpro151015cysleuleuleuleutrpleuvalleuvalargleugluprovalthr202530alaalaalaglyproargalaprocysalaalaalacysthrcysala354045glyaspserleuaspcysglyglyargglyleualaalaleuprogly505560aspleuprosertrpthrargserleuasnleusertyrasnlysleu65707580sergluileaspproalaglyphegluaspleuproasnleuglnglu859095valasnleusertyrasnlysleusergluileaspproalaglyphe100105110gluaspleuproasnleuglngluvaltyrleuasnasnasngluleu115120125thralavalproserleuglyalaalaserserhisvalvalserleu130135140pheleuglnhisasnlysileargservalgluglyserglnleulys145150155160alatyrleuserleugluvalleuaspleuserleuasnasnilethr165170175gluvalargasnthrcyspheprohisglyproproilelysgluleu180185190asnleualaglyasnargileglythrleugluleuglyalapheasp195200205glyleuserargserleuleuthrleuargleuserlysasnargile210215220thrglnleuprovalargalaphelysleuproargleuthrglnleu225230235240aspleuasnargasnargileargleuilegluglyleuthrphegln245250255glyleuasnserleugluvalleulysleuglnargasnasnileser260265270lysleuthraspglyalaphetrpglyleuserlysmethisvalleu275280285hisleuglutyrasnserleuvalgluvalasnserglyserleutyr290295300glyleuthralaleuhisglnleuhisleuserasnasnserileala305310315320argilehisarglysglytrpserphecysglnlysleuhisgluleu325330335valleuserpheasnasnleuthrargleuaspglugluserleuala340345350gluleuserserleuservalleuargleuserhisasnserileser355360365hisilealagluglyalaphelysglyleuargserleuargvalleu370375380aspleuasphisasngluileserglythrilegluaspthrsergly385390395400alapheserglyleuaspserleuserlysleuasnleuglyglyasn405410415alaileargservalglnpheaspalaphevallysmetlysasnleu420425430lysgluleuhisileserseraspserpheleucysaspcysglnleu435440445lystrpleuproprotrpleuileglyargmetleuglnalapheval450455460thralathrcysalahisprogluserleulysglyglnserilephe465470475480servalproprogluserphevalcysaspasppheleulysprogln485490495ileilethrglnprogluthrthrmetalametvalglylysaspile500505510argphethrcysseralaalaserserserserserprometthrphe515520525alatrplyslysaspasngluvalleuthrasnalaaspmetgluasn530535540phevalhisvalhisalaglnaspglygluvalmetglutyrthrthr545550555560ileleuhisleuargglnvalthrpheglyhisgluglyargtyrgln565570575cysvalilethrasnhispheglyserthrtyrserhislysalaarg580585590leuthrvalasnvalleuproserphethrlysthrprohisaspile595600605thrileargthrthrthrvalalaargleuglucysalaalathrgly610615620hisproasnproglnilealatrpglnlysaspglyglythraspphe625630635640proalaalaarggluargargmethisvalmetproaspaspaspval645650655phepheilethraspvallysileaspaspalaglyvaltyrsercys660665670thralaglnasnseralaglyserile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