一种冠突散囊菌株及其发酵液提取物的制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体的说涉及一种冠突散囊菌株及其发酵液提取物的制备方法。

背景技术：

“金花菌”，即冠突散囊菌，是茯砖茶生产的优势菌，在茯砖茶上长有大量金黄色颗粒，俗称“金花”。“金花”是茯砖茶独特风味的主要影响因素，长年饮用茯砖茶有调理肠胃、促进消化、降血糖、降血脂、增强人体体质及延缓衰老等功效，而这些功效与“金花菌”的作用是密不可分的。冠突散囊菌的发酵液提取物同样具备抗氧化、抑菌、抑制乙酰胆碱脂酶活性作用、肉制品保鲜功能及提高免疫力作用，但是目前冠突散囊菌发酵液提取物的制备工艺太过粗糙，其提取纯度较低，如中国专利申请：201710010631.5，所提取得到的发酵液提取物功效较差，无法满足提高免疫力的药物、食品或保健食品功效的高要求。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明要解决的技术问题在于提供了一种冠突散囊菌株及其发酵液提取物的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明通过以下方案来实现：一种冠突散囊菌株（eurotiumcristatum）116，该菌株已于2019年11月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为cgmccno.18826。

本发明的一种冠突散囊菌株发酵液提取物，该发酵液提取物以冠突散囊菌株116为菌种，通过以下步骤制备而成：

（1）菌种活化：挑取冠突散囊菌株菌丝接种于pda平板上，25℃培养5天，连续活化2次；

（2）种子液制备：在去离子水中加入pdb、kh2po4、mgso4·7h2o、维生素b1充分搅拌溶解，ph自然，配置得到pdb24.0g/l，kh2po43.0g/l，mgso4·7h2o1.5g/l，维生素b110.0mg/l的种子培养液；

从步骤1中pda平板上取5个0.5cm²大小菌块连同培养基分别接种到含有250ml种子培养基的500ml三角瓶中，在恒温震荡培养箱上培养5天（培养温度为25℃，转速150rpm）；

（3）一级发酵：制备7.0l发酵培养基置于10l一级发酵罐中，121℃高压原位灭菌后冷却后备用；将步骤2中制备的冠突散囊菌株种子液在火焰保护法下接种于10l一级发酵罐发酵培养基中，接种量为1-10%；接种后，在温度24-30℃，转速60-250rpm，通气量0.1-4m³/h，罐压0.01-0.06mpa条件下发酵3-20天，得到冠突散囊菌株一级发酵液；

（4）二级发酵：制备70l发酵培养基置于100l二级发酵罐中，121℃高压原位灭菌后冷却后备用；将步骤3中制备的冠突散囊菌株一级发酵液移种至100l二级发酵罐发酵培养基中，接种量为1-10%；接种后，在温度24-30℃，转速60-250rpm，通气量0.3-5m³/h，罐压0.01-0.06mpa条件下发酵4-35天，得到冠突散囊菌株二级发酵液；

（5）超声辅助提取：将步骤4得到的冠突散囊菌株的发酵液在聚能式超声提取机中超声处理20min，超声频率20khz，超声功率1200-3600w，占空比1:1-5:5，连续超声处理2次；

（6）离心处理：将步骤5中冠突散囊菌株的发酵液通入管式离心机中，以转速19000rpm高速离心处理60分钟得到发酵液清液；

（7）微滤：将步骤6中冠突散囊菌株的发酵液清夜通入超滤陶瓷膜，温度35-45℃，循环流量6m³/h，进行微滤40min除去悬浮物得到发酵液清液和浓缩液；

（8）浓缩：将步骤7中冠突散囊菌株的发酵液清夜通入卷式膜，温度27-32℃，循环流量1200l/h，进口压力0.25mpa，纳滤浓缩20min得到发酵浓缩液；

（9）喷雾干燥或冷冻干燥：将步骤7和步骤8中冠突散囊菌发酵浓缩液，通入喷雾干燥器中，进风温度为150-220℃，出口温度为80-120℃，喷雾干燥得到冠突散囊菌发酵液提取物；或将步骤7和步骤8中冠突散囊菌发酵浓缩液，放入冷冻干燥机不锈钢托盘中，经过预冻、一次升华、二次解析过程在-60-40℃下真空冷冻干燥24-72h获得发酵液提取物。

进一步的，所述步骤2中每个500ml三角瓶中加入250ml培养基并在121℃高压灭菌20min，冷却后备用。

进一步的，所述步骤3中发酵培养基的制备方法为：在去离子水中加入碳源、氮源、kh2po4、mgso4·7h2o、feso4·7h2o、维生素b1充分搅拌溶解，得到碳源10-50g/l，氮源1-20g/l，kh2po42-10g/l，mgso4·7h2o0.5-5.5g/l，feso4·7h2o0.05-2.5g/l，维生素b110-100mg/l的发酵培养液，调节ph至5.0-6.5，在121℃高压灭菌20min，冷却后备用。

进一步的，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、果糖中的一种或两种；所述氮源为蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、玉米浆、豆饼粉、酵母粉、甜菜碱中的一种或两种。

进一步的，所述步骤4中发酵培养基的制备方法为：在去离子水中加入碳源、氮源、kh2po4、mgso4·7h2o、feso4·7h2o、维生素b1充分搅拌溶解，得到碳源10-50g/l，氮源1-20g/l，kh2po42-10g/l，mgso4·7h2o0.5-5.5g/l，feso4·7h2o0.05-2.5g/l，维生素b110-100mg/l的发酵培养液，调节ph至5.0-6.5，在121℃高压灭菌20min，冷却后备用。

进一步的，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、果糖中的一种或两种；所述氮源为蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、玉米浆、豆饼粉、酵母粉、甜菜碱中的一种或两种。

进一步的，该冠突散囊菌株发酵液提取物在制备提高免疫力的药物、食品或保健食品方面的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明的冠突散囊菌株的活化启动快，只需连续活化2次即可完成活化进行发酵工作，同时，本发明通过菌种活化、种子液制备、一级发酵、二级发酵、超声辅助提取、离心处理、陶瓷膜微滤、卷式膜纳滤浓缩、喷雾干燥或冷冻干燥等一系列步骤来制备得到冠突散囊菌株发酵液提取物，相对于现有技术，本发明优化了发酵液提取物的制备工艺，其提取纯度更高，所制取发酵液提取物提高免疫力的效果更加明显，为进一步研究提高免疫力的药物、食品或保健食品提供了依据。

附图说明

图1为本发明优选实施例中发酵液提取物的制备方法流程图；

图2为本发明发酵液提取物对raw264.7对数生长期细胞的活性影响示意图；

图3为本发明发酵液提取物对小鼠脾淋巴细胞的活性影响示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细阐述，以使发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明的一种冠突散囊菌（eurotiumcristatum）116，该菌株已于2019年11月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.18826。

本发明的冠突散囊菌株用于制备冠突散囊菌株发酵液提取物，一种冠突散囊菌株发酵液提取物，以冠突散囊菌株116为菌种，通过以下步骤制备而成：

（1）菌种活化：挑取冠突散囊菌株菌丝接种于pda平板上，25℃培养5天，连续活化2次；

（2）种子液制备：在适量去离子水中加入36克pdb、4.5克kh2po4、2.25克mgso4·7h2o、15mg维生素b1充分搅拌溶解，再加入适量去离子水配置得到1.5l种子培养液，充分搅拌，ph自然；

从步骤1中pda平板上取5个0.5cm²大小菌块连同培养基分别接种到含有250ml种子培养基的500ml三角瓶中（每个500ml三角瓶中加入250ml培养基并在121℃高压灭菌20min，冷却后备用），在恒温震荡培养箱上培养5天（培养温度为25℃，转速150rpm）；

（3）一级发酵：制备7.0l发酵培养基置于10l一级发酵罐中，121℃高压原位灭菌后冷却后备用；将步骤2中制备的冠突散囊菌株种子液在火焰保护法下接种于10l一级发酵罐发酵培养基中，接种量为1-10%；接种后，在温度24-30℃，转速60-250rpm，通气量0.1-4m³/h，罐压0.01-0.06mpa条件下发酵3-20天，得到冠突散囊菌株一级发酵液；

一级发酵培养液制备：在适量去离子水中加入10g碳源、10g氮源、2克kh2po4、1克mgso4·7h2o、1克feso4·7h2o、10mg维生素b1充分搅拌溶解，再加入适量去离子水配置得到1l一级发酵培养液（碳源10g/l，氮源10g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o1g/l，feso4·7h2o1g/l，维生素b110mg/l），充分搅拌，调节ph至5.0-6.5，在121℃高压灭菌20min，冷却后备用。

（4）二级发酵：制备70l发酵培养基置于100l二级发酵罐中，121℃高压原位灭菌后冷却后备用；将步骤3中制备的冠突散囊菌株一级发酵液移种至100l二级发酵罐发酵培养基中，接种量为1-10%；接种后，在温度24-30℃，转速60-250rpm，通气量0.3-5m³/h，罐压0.01-0.06mpa条件下发酵4-35天，得到冠突散囊菌株二级发酵液；

二级发酵培养液制备：在适量去离子水中加入10g碳源、10g氮源、2克kh2po4、1克mgso4·7h2o、1克feso4·7h2o、10mg维生素b1充分搅拌溶解，再加入适量去离子水配置得到1l一级发酵培养液（碳源10g/l，氮源10g/l，kh2po42g/l，mgso4·7h2o1g/l，feso4·7h2o1g/l，维生素b110mg/l），充分搅拌，调节ph至5.0-6.5，在121℃高压灭菌20min，冷却后备用。

（5）超声辅助提取：将步骤4得到的冠突散囊菌株的发酵液在聚能式超声提取机中超声处理20min，超声频率20khz，超声功率1200-3600w，占空比1:1-5:5，连续超声处理2次；

（6）离心处理：将步骤5中冠突散囊菌株的发酵液通入管式离心机中，以转速19000rpm高速离心处理60分钟得到发酵液清液；

（7）微滤：将步骤6中冠突散囊菌株的发酵液清夜通入超滤陶瓷膜，温度35-45℃，循环流量6m³/h，进行微滤40min除去悬浮物得到发酵液清液和浓缩液；

（8）浓缩：将步骤7中冠突散囊菌株的发酵液清夜通入卷式膜，温度27-32℃，循环流量1200l/h，进口压力0.25mpa，纳滤浓缩20min得到发酵浓缩液；

（9）喷雾干燥：将步骤7和8中冠突散囊菌发酵浓缩液，通入喷雾干燥器中，进风温度为150-220℃，出口温度为80-120℃，喷雾干燥得到冠突散囊菌发酵液提取物。

需要说明的是，步骤3中的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、果糖中的一种或两种，本优选实施例采用葡萄糖作为碳源来制备一级发酵培养液，步骤3中的氮源为蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、玉米浆、豆饼粉、酵母粉、甜菜碱中的一种或两种，本优选实施例采用酵母粉作为氮源来制备一级发酵培养液。

需要说明的是，步骤4中的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、可溶性淀粉、果糖中的一种或两种，本优选实施例采用葡萄糖作为碳源来制备二级发酵培养液，步骤4中的氮源为蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、玉米浆、豆饼粉、酵母粉、甜菜碱中的一种或两种，本优选实施例采用蛋白胨作为氮源来制备二级发酵培养液。

本发明冠突散囊菌株发酵液提取物在制备提高免疫力的药物、食品或保健食品方面具有广泛的应用。

实施例2冠突散囊菌发酵液提取物的提高免疫力作用

本实施例通过以下两种方法对上述发酵和提取干燥获得的冠突散囊菌发酵液提取物进行活性检测评估：

a细胞活性评价：取raw264.7对数生长期细胞配制为合适浓度，并取200μl接种于96孔板中铺板，置于37°c，5%二氧化碳恒温培养箱中培养过夜后，将本发明发酵和提取干燥获得的冠突散囊菌发酵液提取物配制成不同浓度溶液，给予1-200µg/ml（具体的为2µg/ml、10µg/ml、50µg/ml、100µg/ml、200µg/ml）发酵液提取物给药处理，分别在培养24h后加入10μlcck-8孵育3小时，450nm波长处检测吸光度值，按公式（1a）计算细胞增殖活性，以免疫增强剂ahcc作为阳性对照药物。

增殖率(%)=（a样品-a对照）/a对照×100%（1a）

本发明获取的冠突散囊菌发酵液提取物能明显促进该细胞增殖，结果见图2。结果表明，100µg/ml浓度下ahcc和冠突散囊菌发酵液提取物均能显著促进巨噬细胞raw264.7的增殖活性(p<0.01)。

b原代免疫细胞活性评价：无菌取脾，制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为1×106个/ml，于96孔板接种100µl/孔，再分别加入培养液（空白对照）、5µg/mlcona（阳性对照）及不同浓度冠突散囊菌发酵液提取物溶液，置37℃，5%co2培养箱内孵育48h。cck8法检测450nm吸光值，按公式（1b）计算细胞增殖活性淋巴细胞增殖指数si。以免疫增强剂ahcc作为阳性对照药物。

si=样品组吸光值/空白对照组吸光值×100%（1b）

本发明获取的冠突散囊菌发酵液提取物能明显促进该细胞增殖，结果见图3。实验结果表明，50µg/ml发酵液提取物能够显著刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖，但是对cona协同作用弱于ahcc。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。